THE INVESTIGATION OF DNA DAMAGE IN LYMPHOCYTES BY COMET ASSAY IN CHRONIC VIRAL HEPATITIS B PATIENTS

Full Text

Введение При вирусном гепатите В у больных повышается риск развития гепатоцеллюлярной карциномы[1], что может являться апогеем генотоксического и прямого цитотоксического влияния вируса на клетки организма хозяина. Известно также, что у пациентов на стадии цирроза печени в исходе хронического вирусного гепатита В (ХВГВ) в лимфоцитах периферической крови отмечается увеличение частоты сестринского хроматидного обмена [2]. Этот факт может свидетельствовать о репликативном стрессе, поперечных сшивках ДНК или блокировке репликационной вилки. Установлено, что в лимфоцитах больных гепатитом В выше количество хроматидных поломок [3]. Существуют и исследования, показывающие связь повреждений ДНК в лимфоцитах с уровнем 8-гидроксигуанозина в лимфоцитах [4], однако данные параметры выражены сильнее у больных с хроническим вирусным гепатитом С по сравнению с больными ХВГВ. В отношении увеличения при ХВГ частоты повреждений ДНК в лимфоцитах периферической крови в литературе нет единого мнения. Одни авторы это подтверждают [5, 6], другие, наоборот, отрицают [7, 8]. Вместе с тем по характеристике повреждений ДНК лимфоцитов можно косвенно судить о глубине и интенсивности патологического процесса, учитывая патогенетические особенности репликации частиц вируса гепатита В [10]. В связи с этим представляет интерес взаимосвязь выраженности фибротических процессов в печени с изменениями в генетическом аппарате мононуклеаров периферической крови. Цель работы - установить количество одно- и двунитевых разрывов ДНК в лимфоцитах, выделенных у пациентов с ХВГВ в зависимости от степени выраженности фиброза печени по данным эластометрии, а также оценить методом ДНК-комет долю лимфоцитов, погибших вследствие апоптоза и некроза у этих больных. Материалы и методы В исследовании в 2012-2015 гг. приняли участие пациенты инфекционного отделения ГБУЗ «Краевая клиническая больница № 2» и ГБУЗ «Краевая клиническая инфекционная больница» - 50 человек. Контрольную группу составили 43 добровольца без сопутствующих аутоиммунных, острых и хронических заболеваний органов кровообращения, почек, поджелудочной железы, печени, сопоставимых по полу и возрасту с основной группой. В крови добровольцев маркеры вирусных гепатитов и ВИЧ не обнаружены. Возраст больных колебался в пределах 25-60 лет, средний возраст составил 39,7±12,3 года; из них мужчин было 29, женщин - 21. Исследуемых пациентов разделили на 6 групп: F0 - пациенты со степенью фиброза F0 (n = 10), F1 - пациенты со степенью фиброза F1 (n = 10), F2 - пациенты со степенью фиброза F2 (n = 10), F3 - пациенты со степенью фиброза F3 (n = 10), F4 - пациенты со степенью фиброза F4 (n = 10) и контрольную группу (n = 43) (табл. 1). Критериями включения пациентов в исследование были наличие подтвержденного методом иммуноферментного анализа (ИФА) гепатита В с давностью заболевания более 6 мес, идентифицированной методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с чувствительностью не менее 20 МЕ/мл ДНК вируса гепатита В (HBV). Степень выраженности фиброза печени определяли на аппарате FibroScan по классификации METAVIR. Биохимическую активность при гепатите устанавливали на основании лабораторных синдромов мезенхимального воспаления, цитолиза, холестаза. Критериями исключения служили: признаки хронической артериальной недостаточности, ишемическая болезнь сердца, сердечная недостаточность, сахарный диабет, инфекционные и сопутствующие заболевания внутренних органов в стадии обострения, беременность, психические заболевания, курение. Все больные получали стандартную патогенетическую терапию ХВГВ. Исследование проб крови проводили однократно - при поступлении у пациентов забирали 2 мл цельной крови в пробирки, содержащие антикоагулянт. Выделение лимфоцитов проводили поэтапным методом с использованием градиента фиколл-урографина (ρ = 1,077 г/см3) в стерильных условиях (Boyum A., 1968). Цельную кровь, разведенную питательной средой 199 (1:2), наслаивали на раствор фиколл-урографина и центрифугировали при комнатной температуре в центрифуге с горизонтальным ротором при 2000 оборотов/мин в течение 30 мин. Выделенные клетки трижды отмывали средой 199, центрифугируя по 10 мин при 1000 оборотов/мин. Оценку степени повреждения ДНК проводили методом ДНК-комет в щелочной среде(Olive P. et al., 1990) [9]. Отмытые лимфоциты (50 мкл) смешивали с 500 мкл 1% раствора легкоплавкой агарозы («Sigma»), приготовленной на фосфатно-солевом буфере при температуре 37ºС до финальной концентрации 104 клеток/мл. Затем 60 мкл клеточной суспензии наносили на слайды, предварительно покрытые нормоплавкой агарозой («Sigma»), и накрывали покровными стеклами. Слайды для застывания агарозы хранили 5 мин при температуре 4ºС. После затвердевания агарозы снимали покровные стекла и помещали препараты в холодный (4ºС) лизирующий буфер (10 мМ Tris-HCl, pH 10,0,2,5 мМ NaCl, 100 мМ EDTA-Na2, 1% TritonX-100,10% ДМСО) на 1 ч при 4ºС. По окончании лизиса препараты помещали в камеру для электрофореза, содержащую щелочной буфер (300 мМ NaOH, 1 мМ EDTA-Na2) на 40 мин. Далее проводили электрофорез при напряжении 20 В и силе тока 300 мА в течение 25 мин. Слайды после электрофореза трижды по 5 мин обрабатывали нейтральным буфером (0,4 М Tris-HCl pH 7,5), затем дегидратировали метанолом и красили раствором этидия бромида (2 мкг/мл). Препараты ДНК просматривали на флуоресцентном микроскопе Carl Zeiss при увеличении в 200 раз. Полученные изображения анализировали с помощью программы Comet Score. Анализу подвергались не менее 100 клеток каждого препарата. Данная модификация метода позволяет оценить количество одно- и двунитевых разрывов ДНК ядросодержащих клеток. С помощью этой программы представляется возможным классифицировать и подсчитать при визуализации клетки, погибшие в процессе апоптоза и некроза. Для оценки степени повреждения ДНК использовали показатель содержания ДНК в хвосте комет(% DNA t), также регистрировали количество комет с повреждениями ДНК более 50%, известных в литературе как апоптотические ДНК-кометы. Некротические клетки определяли как широкие рыхло-диффузные ДНК-кометы неправильной формы. Статистическая обработка данных проводилась с использованием пакета Statistica 6.4, Microsoft Office Excel 2007. Проверку нормальности распределения количественных параметров проводили с помощью критериев Колмогорова-Смирнова, Лиллиефорса и Шапиро-Уилка. Описание совокупности и разработка референтных интервалов уровня поврежденности ДНК мононуклеарных клеток крови проводились методом персентилей, с использованием показателей медианы (Р50), верхних и нижних децилей (Р10 и Р90), квартилей (Р25 и Р75), минимума (Р0) и максимума (Р100). За верхнюю границу нормы изучаемого признака взят показатель Р75. Для сравнения количественных показателей групп между собой использовали метод Тьюки для неравных групп (Tukey HSD for unequal N). В исследовании результаты считались значимыми при р < 0,05. Результаты По полученным результатам, показанным на гистограммах, видно, что с увеличением степени фиброза, оцениваемого по шкале METAVIR, у пациентов с ХВГВ показатели % ДНК в хвосте кометы по сравнению с показателями контрольной группы смещаются в правую сторону, то есть в сторону увеличения (рис. 1). На рис. 2, который демонстрирует межгрупповые различия, также можно отметить, что есть четкая зависимость между степенью фиброза и степенью деструкции ДНК лимфоцитов периферической крови у больных ХВГВ. Средгнегрупповые значения (табл. 2) в группах F2, F3, F4 (ρ < 0,001), F1 (ρ < 0,5) достоверно отличались от показателей контрольной группы. При этом достоверных различий при отсутствии фибротических изменений в печени (группа F0) по сравнению со здоровыми лицами не выявлено. В контрольной группе медиана составила 3,75±1,44%, а в группе F4 - 9,84±3,09%, т. е. степень деструкции ДНК лимфоцитов оказалась в этой группе наиболее значительной. Апоптотические кометы присутствовали в группах F3 и F4, что составило 1 и 0,88% соответственно от общей популяции клеток (рис. 3), а в контрольной группе и группах F0, F1, F2 такие клетки отсутствовали. Во всех группах пациентов не было зарегистрировано клеток, погибших вследствие некроза. Обсуждение Анализируя имеющиеся данные, в настоящее время можно предположить три патогенетически значимых механизма для описания феномена увеличения степени повреждения ДНК лимфоцитов в периферической крови у больных ХВГВ. Во-первых, это увеличение уровня активных форм кислорода и развитие окислительного стресса, который включает не только пероксидное окисление липидов, но и пероксидное окисление белков и нуклеиновых кислот [11]. Вторым механизмом может быть непосредственная генотоксичность вируса и разрушение им структур клетки, а также его негативное эпигенетическое влияние, что в дальнейшем проявляется в виде лимфопролиферативных заболеваний, трансформации фиброза в гепатоцеллюлярную карциному и др. [12]. Следует учитывать и третий механизм в генотоксичности ВГВ - это увеличение концентрации факторов воспаления: ФНОα, ФНОβ, ИЛ-6, ИЛ-17, ИЛ-1β, NSE и др. [13, 14]. Применительно к гепатоциту все эти три механизма в итоге инициируют онкогены, активируют патоген-ассоциированные молекулярные паттерны и ассоциированные с повреждением молекулярные паттерны, что в конечном счете увеличивает вероятность развития гепатоцеллюлярной карциномы. Заключение Выявлен генотоксический эффект вируса гепатита В на ДНК лимфоцитов клеток периферической крови у пациентов с хроническим течением заболевания. Отмечено также увеличение степени фрагментации ДНК лимфоцитов в зависимости от степени фиброза печени по шкале METAVIR. Последнюю особенность можно использовать в качестве неспецифического маркера, отражающего глубину фибротических изменений в печени у таких пациентов. Учитывая изложенное, необходимо продолжить дальнейшее изучение патоген-ассоциированных молекулярных паттернов и ассоциированных с повреждающими факторами молекулярных паттернов в патогенезе фиброобразования при хронических вирусных гепатитах, что представляется весьма перспективным в качестве прогностических моделей для оценки риска развития гепатоцеллюлярной карциномы.

About the authors

A. O Mikhailov

Pacific State Medical University

Email: mao1991@mail.ru
2, Ostryakov Avenue, Vladivostok, 690002, Russian Federation

A. F Popov

Pacific State Medical University

2, Ostryakov Avenue, Vladivostok, 690002, Russian Federation

N. S Ivanova

Pacific State Medical University

2, Ostryakov Avenue, Vladivostok, 690002, Russian Federation

A. I Simakova

Pacific State Medical University

2, Ostryakov Avenue, Vladivostok, 690002, Russian Federation

References

Supplementary files