Screening of blood serum for markers of infection with measles, rubella, cytomegalovirus and Dengue Fever in Russian tourists

Full Text

Согласно приказу Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека от 17 марта 2008 г. № 88 «О мерах по совершенствованию мониторинга за возбудителями инфекционных и паразитарных болезней» [1], ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» осуществляет мониторинг лихорадки денге [2-4] на территории России. Ранее описаны подтвержденные случаи завоза лихорадки денге в Россию из стран Латинской Америки, Южной и Юго-Восточной Азии [5-10]. Первичный диагноз лихорадки денге нуждается в лабораторном подтверждении, чтобы избежать ошибочного диагноза при проявлении лихорадочных симптомов у пациента. Похожие симптомы острой стадии описаны для кори и краснухи [11, 12]. Также встречаются случаи лихорадки без выраженного геморрагического синдрома, но с более тяжелыми проявлениями других симптомов. Логично предположить наличие дополнительных оппортунистических заболеваний, например цитомегалови- русной инфекции (ЦМВ) [13, 14]. Южная и Юго-Восточная Азия являются регионами с высокими показателями заболеваемости корью и краснухой, и причиной этого является отсутствие плановых мероприятий по вакцинации в ряде густонаселенных стран, например в Индии, где, по данным официальной статистики ВОЗ, регистрируется большинство случаев смерти от кори [15]. Мы провели выявление маркеров первичных коревой и первичной краснушной инфекций в сыворотках крови периода острой стадии заболевания у российских туристов, заболевших после поездки в Юго-Восточную Азию или Индию. Обследование проб проводили в лаборатории референс-центра, а затем положительный результат верифицировали в независимой лаборатории, являющейся региональным центром ВОЗ по элиминации кори и мониторингу за синдромом врожденной краснухи (РЦ ВОЗ) [16, 17]. Параллельно во всех полученных в 2013 г. сыворотках крови больных с подозрением на лихорадку денге было проведено выявление маркеров ранней цитомегаловирусной инфекции методом ферментативно усиленной хемилюминесценции (ФУХЛ) и последующее подтверждение положительных результатов методом иммуноферментного анализа (ИФА). Материалы и методы В 2013 г. в референс-лабораторию ГНЦ ВБ «Вектор» из инфекционных больниц и отделений ФГБУЗ поступили однократно взятые пробы сыворотки крови от 131 больного с подозрением на лихорадку денге. Все пациенты заболели при посещении Таиланда, Вьетнама, Китая, Индонезии и Индии. Симптомы заболевания указывали на вероятность инфицирования вирусом денге. Регламент клиникодиагностических работ с этими пробами был одобрен этическими комитетами лечебных учреждений, направивших сыворотку крови для обследования. Все поступившие на клиническую лабораторную диагностику пробы были обследованы методом иммунохроматографии (ИХ) на наличие NS1-белка вируса денге и методом ИХ либо ИФА - на наличие антител классов М (IgM) и G (IgG) к антигенам вируса денге. ИХ и ИФА проводились с использованием коммерческих наборов реагентов Dengue NS1 Ag+Ab Combo («Standard Diagnostics, Inc.», Корея) и ImmunoComb® II Dengue IgM/IgG Bispot («Orgenics Ltd.», Израиль) соответственно. Затем содержащие NS1 белок вируса денге сыворотки были обследованы методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) на наличие РНК вируса денге, ПЦР проводилась с использованием коммерческих наборов Geno-Sen’s DENGUE 1-4 RealTime PCR Kit («Genome Diagnostics Pvt Ltd.», Индия) и «Вектор- ПЦРрв-Денге2-RG» (ГНЦ ВБ «Вектор», РФ). Выделение суммарной РНК из сыворотки крови для проведения ПЦР осуществляли с использованием набора QIAamp Viral RNA Mini Extraction Kit («Qiagen», США). ПЦР проводили на приборе RotorGene 6000 («Corbett Research», Австралия). Подтверждение положительных результатов ПЦР и установление генотипа вируса денге выполняли секвенированием фрагмента кДНК 5’-UTR (285 п.н.) на автоматическом секвенаторе Applied Biosystems 3130xl (Япония). Для выявления первичных краснушной и коревой инфекций определяли специфические IgM [18, 19] в пробах от больных с неподтвердившимся диагнозом лихорадки денге. Следует заметить, что в результате плановой вакцинации большинство наших соотечественников первично уже контактировали с аттенуированными штаммами кори и краснухи, поэтому при последующем контакте с природным вирусом не обязательно будут продуцировать специфические ^М в диагностируемом количестве. Поэтому специфические IgM в сыворотке крови больных корью и краснухой не всегда обнаруживаются у плохо вакцинированных при их последующем заболевании. Но наличие специфических IgM служит лабораторным подтверждением заболевания. Иммуноглобулины класса M к антигенам вируса краснухи выявляли методом ФУХЛ на автоматическом анализаторе закрытого типа Acces 2 («Beckman Coulter», США). Полученные положительные результаты верифицировали в РЦ ВОЗ методом ИФА с использованием Набора реагентов для выявления антител класса IgM к вирусу краснухи методом иммуноферментного анализа в варианте “capture”, «ИФА-Краснуха-IgM» (ЗАО «Эколаб», РФ). Иммуноглобулины класса M к антигенам вируса кори выявляли методом ИФА с применением набора реагентов «Мелиса Корь-IgM» (ЗАО «Медикобиологический союз», РФ). Полученные положительные результаты верифицировали в РЦ ВОЗ методом ИФА с использованием разрешенного к применению в практике клинических диагностических лабораторий набора реагентов «ВектоКорь- IgM» (ЗАО «Вектор Бест», РФ). Маркерами острой стадии инфекции ЦМВ являлись специфические IgM. Иммуноглобулины класса M к ЦМВ выявляли в первичном скрининговом обследовании на автоматическом анализаторе закрытого типа Acces 2 методом ФУХЛ. Полученные положительные результаты верифицированы в лаборатории референс-центра, где проводился и первичный скрининг. Использован метод ИФА с помощью набора «ИФА-ЦМВ-IgM»(ЗАО «Эколаб», рф). Статистическая обработка результатов проводилась с применением прикладной программы Statistica 6,0. определялись средние значения показателей (М) и ошибка среднего значения (m), вычислялся коэффициент ранговой корреляции Спирмена (г). Результаты и обсуждение обследование однократно взятых проб сыворотки крови от 131 больного с подозрением на лихорадку денге с целью лабораторной диагностики проведено по алгоритму, изложенному в разделе «Материалы и методы». Выбранные для диагностики тест-системы позволяют выявлять все четыре генотипа вируса денге (согласно международной классификации) с равной чувствительностью и специфичностью. Тест-системой ИХ в 34 сыворотках выявлен NS- антиген вируса денге. В 12 сыворотках из 34 ИХ также определены IgM к антигенам вируса денге. Методом ИФА IgM к антигенам вируса денге выявлены только в этих же 12 сыворотках из 34 содержащих NS-антиген. Методами ИХ и ИФА еще в 53 сыворотках выявлены IgM к вирусу денге, в 23 случаях в сочетании со специфическими IgG. Не обнаружено других вариантов сочетания маркеров лихорадки денге. Специфических IgG без специфических IgM не выявлено. Всего заболевание лабораторно подтверждено в 87 (66,4%) случаях. ПЦР -методом РНК вируса денге в сыворотке крови обнаружена у 18 человек из числа 22 больных, сыворотка крови которых содержала только NS-антиген. Метод сиквенс-фрагментов вирусспецифической кДНК установил генотип 1 для РНК, выделенной из 15 проб, генотипы 2, 3 и 4 определены для одной пробы каждый. Результаты выявления IgM к вирусам кори, краснухи и ЦМВ в 131 сыворотке крови пациентов с подозрением на лихорадку денге Определение иммуноглобулинов класса М (используемые методы для скрининга / подтверждения) Результаты лабораторного подтверждения Количество сывороток IgM к ЦМВ, (ФУХЛ/ИФА) IgM к вирусу кори (ИФАскр. /ИФАподтв.)* IgM к вирусу краснухи (ФУХЛ/ИФА) лихорадки денге (%) количество интервал КПоз.** количество интервал КПоз. ** количство интервал КПоз. ** Лихорадка денге лабораторно подтверждена 87 (66,4%) 7/7 От 1,3±0,1 до 4,8±0,5/ от 1,1±0,1 до 1,9±0,2 н.т. н.т. н.т н.т Лихорадка денге лабора- 44 (33,6%) 0/0 - 4/3 От 1,3±0,1 5/0 от 1,25±0,1 до 1,63±0,2 торно не подтверждена до 10,5±1,1 / от1,2±0,1 до 14,9±1,5 / нет Примечание. * - ИФАскр. - результаты получены в скрининговом ИФА, ИФАподтв. - результаты получены в подтверждающем ИФА; ** - погрешность границ интервала КПоз. рассчитана индивидуально для каждого диагностического набора; н.т. - тестирование не проводилось. На наличие IgM к ЦМВ обследована 131 проба, а наличие IgM к вирусам кори и краснухи определялось только в 44 сыворотках, не содержащих маркеры лихорадки денге. Результаты представлены в таблице. Результаты выявления IgM к вирусам кори, краснухи и ЦМВ в 131 сыворотке крови пациентов с подозрением на лихорадку денге Как видно из данных таблицы, в семи сыворотках методом ФУХЛ были выявлены IgM к ЦМВ. Пробы принадлежат пациентам с лабораторно подтвержденной лихородкой денге. Результат полностью верифицирован методом ИФА. Это может свидетельствовать о микстинфекции ЦМВ и лихорадки денге. При этом показатель отношения сигнала к пороговому для детекции значения, так называемый коэффициент позитивности или «S/СО» (КПоз), для ФУХЛ и ИФА показал абсолютную корреляцию (К = 1,0). 4 корр. 7 ' Выявление IgM к антигенам вируса кори, так же как и верификация результатов, производилось с помощью ИФА с использованием наборов разных производителей. Первичный скрининг проведен в референс-лаборатории ГНЦ ВБ «Вектор», верификация результата - в РЦ ВОЗ. Для выявления IgM к антигенам вируса краснухи был использован наиболее чувствительный на сегодня метод ФУХЛ, что позволило выявить пять положительных сывороток. однако при попытке подтвердить наличие IgM к вирусу краснухи в этих сыворотках методом ИФА в референс-центре ВоЗ только один результат для сыворотки с самым высоким в ФУХЛ КПоз. интепретирован как «равнозначный». Результаты анализа четырех остальных положительных в ФУХЛ сывороток были интерпретированы как «отрицательные». Расхождение результатов может быть объяснено более высокой чувствительностью метода ФУХЛ по сравнению с ИФА [18-20]. Следует отметить, что без данных лабораторной диагностики диагноз кори или краснухи не рассматривался. По полученным нами результатам корью заболели 24-летний мужчина и 2 женщины 38 и 49 лет. Подозрение на краснуху у мужчины 32 лет. Эти случаи заболевания выявлены у больных из возрастной группы от 20 до 50 лет, которая составила 92% от всех обследованных. У заболевших корью и больного с подозрением на краснуху, как и у большинства больных лихорадкой денге, описано начало заболевания с лихорадкой, с короткими, но выраженными ознобами. Лихорадка у пациентов была умеренной, плохо купировалась антипиретиками. У всех больных с первого дня заболевания также отмечались выраженные миалгии, артралгии и оссалгии или их сочетание, выраженная слабость, снижение аппетита. Менее выраженными были головные боли, беспокоили боли в глазах. Имели место точечная или пятнистая экзантемы. Не наблюдалось геморрагической сыпи и других геморрагических проявлений. Выводы 1. В 2013 г. в референс-лаборатории ГНЦ ВБ «Вектор» при выявлении случаев лихорадки денге среди заболевших после возвращения из стран ЮгоВосточной Азии и Индии выявлены 3 случая заболевания корью. Лабораторный диагноз был верифицирован в РЦ ВОЗ. 2. У 7 заболевших лихорадкой денге выявлены специфические IgM к ЦМВ, что может свидетельствовать о вероятности оппортунистической коинфекции при лихорадке денге.

About the authors

S. A Pyankov

State Research Center of Virology and Biotechnology Vector

Email: pyankov_sa@vector.nsc.ru
12, Koltsovo, Novosibirsk region, 630559

E. V Ivanova

Center for Hygiene and Epidemiology for the Novosibirsk region of the Federal Service for the Oversight of Consumer Protection and Welfare

Email: volman71@mail.ru
84, Frunze Str., Novosibirsk, 630099

V. A Ternovoy

State Research Center of Virology and Biotechnology Vector

Email: tern@vector.nsc.ru
12, Koltsovo, Novosibirsk region, 630559

A. P Agafonov

State Research Center of Virology and Biotechnology Vector

Email: agafonov@vector.nsc.ru
12, Koltsovo, Novosibirsk region, 630559

References

Supplementary files