THE CLINICAL SIGNIFICANCE OF DETECTION OF RNA IN PATIENTS WITH CHRONIC VIRAL HEPATITES

Full Text

Исследование крови на РНК вируса гепатита G (hepatitis G virus - HGV) методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в настоящее время является рутинным и используется врачами для уточнения природы заболеваний печени, этиология которых не укладывается в рамки известных клинико-вирусологических факторов. Однако обнаружение РНК HGV ставит перед врачом вопрос о роли этого вируса в развитии имеющегося заболевания, поскольку исследования патогенных свойств HGV и его распространенности в человеческой популяции еще продолжаются. HGV получил свое название в соответствии с инициалами пациента (GB - G. Barker), перенесшего в 1966 г. желтушную форму острого гепатита с умеренной ферментативной активностью. При парентеральном заражении приматов кровью этого пациента было зарегистрировано развитие гепатита, что позволило предполагать наличие нового вирусного агента, названного GBV. Однако только через 25 лет (после появления новых методов идентификации вирусов) из крови человека был выделен вирус, названный HGV [1, 8, 16, 22]. В последующем при обследовании различных групп населения РНК HGV обнаруживалась в гепа-тоцитах [14, 20], лимфоцитах и моноцитах периферической крови [13], эндотелиальных клетках сосудов [11], а также в других тканях [7, 8]. HGV-инфекция сопровождается продукцией специфических антител, которые длительно определяются в крови методом ИФА. Было показано, что в отличие от HCV-инфекции при инфицировании HGV не удается одновременно обнаруживать в крови РНК HGV и специфические антитела к этому вирусу. Таким образом, наличие в крови только антител к HGV указывает на элиминацию вируса, как и при большинстве вирусных инфекций [4, 7, 12]. Кроме того, было выявлено, что при HGV-инфекции в 60-75% случаев у иммунокомпетентных пациентов происходит спонтанное исчезновение вируса и образование специфических антител [25, 26]. Частота обнаружения РНК HGV в популяции в среднем составляет 1,7%, причем, по данным исследователей, вирус имеет неравномерное распространение в разных странах: от 3,4% в азиатском регионе до 17,2% среди африканского населения [24]. Вирус относят к возбудителям инфекций с парентеральным путем передачи. Косвенным подтверждением этого является более частое обнаружение HGV в группах лиц повышенного риска заражения парентеральными инфекциями. Распространению HGV способствует использование инфицированной крови и ее продуктов. Однако, учитывая отсутствие клинических проявлений HGV-инфекции у доноров и абсолютного большинства реципиентов крови, FDA (Food and Drug Administration) США не считает Для корреспонденции: Громова Наталья Ивановна, канд. мед. наук, зав. отд. инфекционных заболеваний ФГБУ Поликлиника № 1 Управления делами Президента РФ, e-mail:gromovamail@ mail.ru 36 необходимым введение контроля крови и ее компонентов на маркеры HGV-инфекции. Целый ряд исследований подтверждают возможность полового пути передачи HGV, учитывая высокую частоту обнаружения РНК HGV у гомосексуалистов и проституток, а также у половых партнеров лиц, инфицированных вирусом [23, 27]. Найдены многочисленные доказательства вертикального пути передачи HGV от матери к ребенку [17, 19]. Некоторые авторы указывают на возможность контактного пути передачи HGV [15]. Несмотря на описанные случаи острого и хронического гепатита G, гепатотропность HGV остается спорной. Подобно РНК-содержащему вирусу гепатита C (HCV), HGV не интегрируется в геном инфицированной клетке, располагаясь в ее цитоплазме. По мнению ряда авторов, вирус размножается в мононуклеар-ных клетках периферической крови, в основном в B- и T-лимфоцитах и костном мозге [11, 13]. Клинические проявления HGV-инфекции чаще всего соответствуют субклиническим и безжелтуш-ным формам гепатита с нормальной или невысокой активностью аминотрансфераз [9]. При морфологическом исследовании биоптатов печени на фоне изолированной персистирующей HGV-инфекции выявляются фиброз и стеатоз портальных трактов с незначительной воспалительной инфильтрацией, причем индекс гистологической активности у моноинфицированных HGV значительно ниже, чем у больных с коинфекцией HCV + HGV или моноинфекцией HCV [5, 6, 21]. Таким образом, в настоящий момент не ясно, является ли HGV случайным попутчиком или гепато-тропным вирусом, имеющим самостоятельное значение в патологии человека. Решение этой проблемы требует накопления экспериментальных и клинических данных и их научного анализа. Поскольку при обследовании пациентов, наблюдаемых нами в отделении инфекционных заболеваний крупной поликлиники Москвы, также в ряде случаев обнаруживалась РНК HGV, нами была предпринята попытка оценить частоту выявления HGV у больных с вирусными гепатитами B и C, а также влияние HGV-инфекции на течение вирусных гепатитов и эффективность комбинированной противовирусной терапии (ПВТ). Материалы и методы В исследуемую группу были включены 593 пациента с хроническими вирусными гепатитами различной этиологии и реконвалесценты вирусных гепатитов B и C. Из них 352 больных хроническим гепатитом C (ХГС), 46 пациентов в стадии реконвалесценции после перенесенного гепатита C, 128 пациентов с хроническим гепатитом B (ХГВ), 25 реконвалесцентов гепатита B и 42 пациента, в крови которых обнаруживались только РНК HGV и/или ДНК TTV в отсутствие маркеров вирусов гепатитов B и C. Критериями включения в исследование было наличие хронических вирусных гепатитов у взрослых пациентов 18 лет и старше с обнаружением маркеров гепатотропных вирусов. Критериями исключения из исследования являлись аутоиммунные заболевания печени, ВИЧ-инфекция, декомпенсированные соматические заболевания, онкологические и онкогематоло-гические заболевания, продолжающееся употребление психоактивных препаратов и алкоголя, беременность и лактация. У пациентов в период реконвалесценции после перенесенных вирусных гепатитов в крови обнаруживались антитела к HCV и антигенам HBV в отсутствие РНК HCV и ДНК HBV (в трех исследованиях). Исследуемая группа состояла из 355 мужчин и 238 женщин. Средний возраст пациентов составил 39,1 года. Всем пациентам выполнялись клинические и биохимические анализы крови в динамике, определение гормонов щитовидной железы, белков и белковых фракций крови, альфа-фетопротеина, факторов свертывания, по показаниям - исследование крови на аутоантитела (антинуклеарный фактор, антитела к митохондриям и гладкой мускулатуре). График обследования пациентов, получавших противовирусную терапию, был стандартным: до начала лечения, затем на 2, 4, 8, 12, 24, 36, 48-й неделях лечения. После окончания лечения пациенты были обследованы через 4, 12, 24, 48, 78 и 104 нед. Все пациенты один и более раз были обследованы на РНК HGV и ДНК TTV методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). С целью изучения влияния препаратов интерферона на персистенцию HGV 24 больных с ХГС и 6 больных с ХГВ, имевших в крови РНК HGV и получавших интерферонотерапию, были обследованы на РНК HGV трижды: до начала лечения, во время проводимой терапии (на 12-24-й неделе лечения) и после ее окончания. Всем пациентам 1 раз в год выполнялось ультразвуковое исследование органов брюшной полости. Биопсия или фиброэластометрия печени выполнены 118 больным хроническими вирусными гепатитами. Определение серологических маркеров вирусных гепатитов проводилось методом ИФА, исследования крови на РНК HCV, ДНК HBV, РНК HDV, ДНК TTV, РНК HGV, ДНК CMV, ДНК VEB - методом ПЦР. Выделение РНК из образцов сыворотки крови проводили методом экстракции фенол-хлороформом с использованием набора производства НПО “ЛИТЕХ” по протоколу производителя. Полученный генетический материал подвергали обратной транскрипции (ОТ) с помощью набора “Реверта-L” производства ООО “Ин-терЛабСервис” по протоколу производителя. Полученную кДНК амплифицировали в полимеразной цепной реакции с вложенными праймерами, специфичными к 5’-нетранслируемой области (НТО) генома HGV. Статистическая обработка полученных данных проводилась с применением программного пакета Statistica 7.0. Результаты и обсуждение В исследуемой группе больных хроническими вирусными гепатитами средняя длительность заболевания от момента предполагаемого инфицирования составила 9,77 года, средняя длительность наблюдения за пациентами - 5 лет. Случайные половые связи 2,02 % Татуировки 3,88 % Переливание крови 12,48 % Наркотики парентерально 15,68 % Другие факторы 1,01 % Операции и роды 37,61 % Стоматологическое лечение 27,32 % Рис. 1. Эпидемиологические факторы. Среди эпидемиологических факторов заболевания чаще встречалось вероятное инфицирование гепато-тропными вирусами при операциях и родах - у 223 (37,61%) больных. Все пациенты исследуемой группы хотя бы однажды были на приеме у стоматолога, но 162 (27,32%) человека отрицали какие-либо другие парентеральные манипуляции, кроме стоматологического лечения. Использование парентерально вводимых наркотических препаратов выявлено в анамнезе у 93 (15,68%) пациентов. Переливание крови и ее компонентов до заболевания имело место у 74 (12,48%) больных. У 23 (3,88%) больных сведения о парентеральных манипуляциях ограничивались татуировками или пирсингом. Лишь 12 (2,02%) пациентов связывали свое заболевание со случайными половыми связями. Данные эпидемиологического анамнеза пациентов исследуемой группы представлены на рис. 1. Уровень фиброза у 71 из 118 больных хроническими вирусными гепатитами, которым были выполнены биопсия или фиброэластография печени, был от 0 до 1 балла по Knodell, что составляет 60,2%. Распределение больных в зависимости от уровня фиброза представлено на рис. 2. По данным разных авторов, коинфекция HGV с вирусами гепатитов B, C и D выявляется значительно чаще, чем моноинфекция. РНК HGV обнаруживали у 8-16% больных ХГВ, у 5,6-21% больных ХГС и в 58% случаев ХГВ с дельта-агентом [26]. В нашем исследовании у больных хроническими гепатитами B, C и D, а также реконвалесцентов этих заболеваний РНК HGV обнаружена у 75 (13,61%) человек из 551. При этом отсутствовали различия в частоте вы- 4 балла 12,7 3 балла 10,1 % 2 балла 17,0 0 баллов 24,6 % Рис. 2. Распределение больных исследуемой группы с хроническими вирусными гепатитами в зависимости от уровня фиброза (n = 118). 37 ЭПИДЕМИОЛОГИЯ И ИНФЕКЦИОННЫЕ БОЛЕЗНИ, № 2, 2012 явления РНК HGV в группах больных ХГВ и ХГС и реконвалесцентов HBV- и HCV-инфекций (табл. 1). Поскольку все пациенты исследуемой группы были обследованы также на ДНК TTV, мы провели сравнительную оценку выявления этих вирусов в крови пациентов с ХГВ, ХГС и реконвалесцентов этих заболеваний (данные о влиянии инфицирования вирусом ТТ на течение и эффективность ПВТ у больных хроническими вирусными гепатитами были нами опубликованы ранее) [2]. При этом были выявлены достоверные различия обнаружения ДНК TTV и РНК HGV: ДНК TTV обнаружена у 46,64%, а РНК HGV - только у 13,61% пациентов исследуемой группы (р < 0,05). При этом обнаруженные различия были более выражены в группе больных и реконвалесцентов ХГВ, в которой ДНК TTV выявлена у 62,86% пациентов, а РНК HGV - лишь у 13,48% (р < 0,05). В нашем исследовании не удалось подтвердить данные о высокой частоте обнаружения РНК HGV у больных ХГВ с дельта-агентом. Однако, учитывая небольшую численность группы больных ХГВ + D (n = 12), мы планируем продолжить исследования у пациентов с ХГВ + D. Результаты сравнительной оценки частоты обнаружения вирусов HGV и TTV у больных хроническими гепатитами B, C и D представлены в табл. 1. Частота выявления HGV-инфекции среди пациентов с ХГС оказалась в 2 раза ниже, чем у пациентов с ВИЧ-инфекцией - 13,82% против 26,2 % (данные о распространенности HGV у ВИЧ-инфицированных лиц, получавших наркотические препараты, были опубликованы нами ранее) [3]. Поскольку оба исследования проводились одной тест-системой ПЦР с ОТ, такие различия достоверны и связаны, вероятно, с различиями в интенсивности реализации парентерального пути передачи в исследуемых группах, а также с иммуносупрессией на фоне ВИЧ-инфекции. Мнения авторов по поводу влияния HGV-инфекции на течение хронического гепатита разделились. Наиболее подробно обследованы больные ХГС в сочетании или без HGV. Так, Е. Tanaka и со-авт. [24] при обследовании 420 больных выявили более высокую активность АЛТ в группе пациентов, коинфицированных HcV + HGV, чем в группе пациентов с ХГС. Л. Ю. Ильченко и Т. И. Карлович [5] при обследовании 312 больных ХГС отмечают, что у 28 (9%) из них выявлена РНК HGV, причем достоверных различий в клинической картине заболевания в группах больных с РНК HGV и без РНК HGV обнаружено не было. С целью оценки влияния инфицирования HGV на клинико-биохимические характеристики заболевания мы разделили больных с ХГС (n = 352) на 2 подгруппы: пациентов, в крови которых РНК HGV не обнаруживалась (n = 298) и пациентов, коинфи-цированных HCV + HGV (n = 54). Полученные результаты свидетельствовали об отсутствии статистически достоверных различий клинико-биохимических показателей и уровней фи броза (при фиброэластометрии и биопсии печени) у пациентов сравниваемых групп. Исключением стало повышение уровня активности АЛТ, которое при статистическом исследовании методом Манна-Уитни достоверно чаще встречалось в группе больных, ко-инфицированных вирусами HCV и HGV (табл. 2). В медицинской литературе обсуждается вопрос о влиянии HGV на эффективность ПВТ больных хроническими вирусными гепатитами. F. Jr. Garcia и соавт. [10] наблюдали стойкий биохимический и вирусологический ответ через 6 мес после окончания курса терапии у 55-57% больных с коинфекцией HCV + HGV и 69% больных с моноинфекцией HCV. С другой стороны, Е. Orito и соавт. высказывают мнение об отсутствии влияния HGV-инфекции на эффективность лечения ХГС препаратами интерферона [18]. В нашем исследовании с целью оценки влияния коинфицирования HGV на эффективность лечения Таблица 1 Частота обнаружения РНК HGV и ДНК TTV у больных ХГС, ХГВ и реконвалесцентов этих заболеваний Заболевания Число больных Частота выявления РНК HGV Частота выявления ДНК TTV абс. % абс. % ХГВ 141 19 13,48 88 62,86 ХГВ + D 12 1 8,33 8 66,67 ХГС 398 55 13,82 161 40,45 Всего... 551 75 13,61 257 46,64 Таблица 2 Сравнительная характеристика клинико-биохимических показателей у больных, моноинфицированных HCV и коинфицированных HCV и HGV Больных Больные ХГС без РНК HGV в крови, n (%) ХГС с Показатель наличием РНК HGV в крови, n (%) Число больных 54 298 Средний возраст, годы 32,43 37,24 ИМТ > 25 кг/м2 22 (40,74) 149 (50) Астенический синдром 21 (38,89) 108 (36,24) Диспепсический синдром 14 (25,93) 90 (30,20) Общий билирубин > N (20,5 ммоль/л) 11 (20,37) 53 (17,79) АЛТ м/ж > 40/30 Ед/л 53 (98,15)* 257 (86,24)* Средний уровень АЛТ, Ед/л 136,2* 106,9* ГГТП > 42 Ед/л 22 (40,74) 137 (46,13) Сывороточное Fe больше нормы (м/ж -28,3/26 мкмоль/л) 12 (22,22) 60 (20,13) Вирусная нагрузка > 2 млн МЕ/мл 16 (29,63) 73 (24,5) Увеличение размеров печени (УЗИ) 11 (20,75) 62 (20,88) Фиброз печени 2 балла и выше при биопсии или фиброэластографии 3 (5,56) 23 (7,72) Примечание. * - р < 0,05; в скобках - проценты. 38 больных ХГС пациенты исследуемой группы, получавшие ПВТ, были разделены на 2 подгруппы в зависимости от наличия или отсутствия РНК HGV в крови (38 и 190 больных соответственно). Успешность ПВТ определялась достижением устойчивого вирусологического ответа (УВО), о чем свидетельствовало отсутствие РНК HCV в течение не менее 24 нед после окончания курса лечения. Эффективность ПВТ зависела от генотипа РНК HCV и применяемых препаратов интерферона. Лечение проводилось как стандартными интер-феронами короткого действия (реаферон, реальди-рон, интрон А или роферон А по 3 млн МЕ подкожно через день) в сочетании с рибавирином per os в дозе 13 мг на 1 кг массы тела, так и интерферонами пролонгированного действия (пегасис 180 мкг или пегинтрон 80-120 мкг подкожно 1 раз в нед) в сочетании с рибавирином в той же дозе. Длительность курса ПВТ составляла 48 нед при 1-м генотипе вируса и 24 нед при 2-м и 3-м генотипах. Учитывая небольшую численность пациентов в группе больных, коинфицированных HCV + HGV (n = 38), исследование сравнительной эффективности ПВТ в зависимости от генотипа вируса и применяемых препаратов интерферона привело бы к делению ее на мелкие подгруппы и снижению статистической достоверности результата. В связи с этим мы оценивали суммарную эффективность ПВТ в исследуемых группах. Полученные результаты свидетельствовали об отсутствии достоверных различий эффективности лечения у больных с моноинфекцией HCV и коинфицированных HCV + HGV, что позволило сделать вывод об отсутствии влияния инфицирования HGV на комбинированную ПВТ (табл. 3). Было проведено статистическое исследование влияния HGV на эффективность комбинированной интерферонотерапии и результаты лечения у пациентов с ХГС с использованием таблиц сопряженности 2 X 2. Рассчитанные значения статистики χ2 с поправкой Иетса (р > 0,05) позволили принять нулевую гипотезу о независимости исследованных признаков - наличия в крови РНК HGV и результата лечения, что свидетельствовало об отсутствии влияния HGV-инфекции на эффективность лечения ХГС. Группа пациентов из 30 человек с хроническими вирусными гепатитами, имевших в крови РНК HGV и получавших препараты интерферона, была обследована трижды (до начала лечения, во время лечения и после его окончания). Группа состояла из 24 больных ХГС, получавших препараты интерферона и рибавирина в стандартных дозах и продолжительности курса лечения в зависимости от генотипа возбудителя (24 или 48 нед), и 6 больных ХГВ, которым проводилась монотерапия препаратами интерферона в течение 48 нед. Из них у 16 больных отмечалось временное прекращение репликации HGV на фоне лечения препаратами интерферона и ее возобновление после окончания лечения. Еще у 7 больных отмечено прекращение репликации РНК HGV на фоне лечения, а также в течение 6 и более мес после его окончания. У остальных 7 пациентов репликация РНК HGV не прекращалась ни во время ПВТ, ни после окончания лечения (табл. 4). Таким образом, можно сделать вывод о том, что интерферонотерапия (в сочетании с рибавирином у больных с ХГС) подавляла репликацию HGV, но в большинстве случаев это подавление носило временный характер. В исследуемой группе больных хроническими вирусными заболеваниями печени у 42 пациентов в крови отсутствовали маркеры HCV- и HBV-инфекции и выявлялись только ДНК TTV и/или РНК HGV. Из них у 30 больных в крови обнаруживалась только ДНК TTV в отсутствие РНК HGV, у 5 - как РНК HGV, так и ДНК TTV, у 12 - только РНК HGV. Таким образом, эти 12 пациентов можно рассматривать как случаи моноинфекции HGV. В группу моноинфицированных HGV вошли 8 мужчин и 4 женщины, средний возраст которых составил 33,9 года, длительность заболевания от предполагаемого инфицирования 6,5 года. У половины больных (6 человек) ИМТ превышал 25 кг/м2. У 10 (83,3%) пациентов этой группы отсутствовали какие-либо жалобы, заболевание протекало бессимптомно. Увеличение размеров печени, по данным УЗИ, отмечено только у 1 пациента. В биохимическом анализе крови у половины больных этой группы (6 человек) уровень трансами-наз оставался в норме, у остальных имело место повышение уровня активности АЛТ в 1,1-4,6 раза вы- Т аблица 3 Оценка влияния HGV на эффективность пВТ у больных ХГС Обнаружение Число Число Эффектив Группа РНК HGV у больных ХГС больных больных с УВО ность ПВТ, % 1-я Не обнаружена 190 138 72,63 2-я Обнаружена 38 29 76,32 Т аблица 4 Влияние пВТ на репликацию HGV у больных ХГC и Х^ Вирусологический ответ на ПВТ РНК HGV Количество больных, n Число больных с УВО абс. % Устойчивый Не определяется во время и после ПВТ 7 23,33 Вирусологический ответ во время ПВТ, рецидив вирусемии после лечения Не определяется во время ПВТ и появляется после ее окончания 16 53,33 Отсутствие Определяется до, во время и после ПВТ 7 23,33 Всего... Обследовано на РНК HGV до, во время и после ПВТ 30 100 39 ЭПИДЕМИОЛОГИЯ И ИНФЕКЦИОННЫЕ БОЛЕЗНИ, № 2, 2012 ше верхней границы нормы. Кроме того, у 6 больных отмечалось повышение уровня ГГТП в 1,2-3,3 раза выше нормы. Обращает на себя внимание то, что, несмотря на молодой возраст пациентов, у 8 больных этой группы отмечено повышение содержания холестерина в крови, а также при ультразвуковом исследовании обнаружены явления стеатоза печени. Таким образом, в нашем исследовании были получены данные, свидетельствующие о достаточно высокой частоте выявления HGV у пациентов с хроническими вирусными гепатитами (13,6%). При этом частота обнаружения РНК HGV в исследуемой группе больных была в 3 раза ниже, чем частота обнаружения ДНК TTV. Наличие РНК HGV в крови больных ХГС не влияло на эффективность ПВТ, на фоне которой у большинства больных имело место подавление репликации HGV, носившее временный характер. У лиц с моноинфекцией HGV клиническая симптоматика была скудной, у половины больных этой группы молодого и среднего возраста отмечались повышение уровня холестерина, а также явления стеатоза печени по данным УЗИ. Учитывая небольшую численность группы пациентов с моноинфекцией HGV, необходимо продолжить накопление данных о роли HGV в генезе заболеваний печени и патологии билиарной системы.

About the authors

N. I. Gromova

Federal State Institution Polyclinic №1 of the Office of Presidential Affairs of Russia

I. V. Gordeychuk

Federal State Budget-Financed Institution Chumakov Institute ofpoliomielitis and viral encephalitides ofRAMS, Institut poliomielita

K. K. Kyuregyan

Federal State Budget-Financed Institution Chumakov Institute ofpoliomielitis and viral encephalitides ofRAMS, Institut poliomielita

L. U. Ilchenko

Federal State Budget-Financed Institution Chumakov Institute ofpoliomielitis and viral encephalitides ofRAMS, Institut poliomielita

M. I. Mikhailov

Federal State Budget-Financed Institution Chumakov Institute ofpoliomielitis and viral encephalitides ofRAMS, Institut poliomielita

References

Supplementary files