THE STUDY OF TOXICITY AND THE PROTECTIVE PROPERTIES OF IFN-A2B WITH ANTIOXIDANTS AND SPECIFIC ANTIVIRAL CHEMO DRUGS FOR HERPES VIRAL INFECTIONS "IN VITRO" AND "IN VIVO"

Full Text

Широкое распространение вируса простого герпеса (ВПГ) и цитомегаловируса (ЦМВ) в человеческой популяции представляет особую опасность для беременных женщин и для новорожденных детей. Существует несколько лекарственных препаратов, 29 ЭПИДЕМИОЛОГИЯ И ИНФЕКЦИОННЫЕ БОЛЕЗНИ, № 2, 2012 применяемых при лечении герпес-вирусных инфекций, однако большинство из них не разрешены для лечения указанной выше группы [15]. Недостатками химиопрепаратов являются их высокая токсичность и при длительном использовании развитие лекарственной устойчивости [14]. В связи с этим в настоящее время проводится поиск новых средств и новых схем терапии, позволяющих избежать проявления побочных токсических эффектов при сохранении высокой противовирусной эффективности. Одно из направлений, развиваемых в этой области исследований, состоит в разработке принципов терапии, заключающихся в одновременном воздействии на различные функции организма больного. В связи с этим для лечения герпес-вирусных инфекций представляло интерес изучить эффективность комбинированного применения препаратов, содержащих интерферон (ИФН)-а2Ь в комплексе с антиоксидантами и специфических химиопрепаратов. ИФН-а2Ь обладает широким спектром противовирусной активности, а также иммуномодулирующими и антипролиферативными свойствами. В настоящий момент на территории России зарегистрирован препарат ВИФЕРОН®, содержащий ИФН-а2Ь в комплексе с антиоксидантами, в различных лекарственных формах (суппозитории ректальные, мазь для наружного и местного применения, гель для наружного и местного применения). Препараты под торговым наименованием ВИФЕРОН® разрешены для лечения широкого спектра заболеваний у взрослых и детей, в том числе у беременных женщин и новорожденных. Недавно была разработана новая лекарственная форма (НЛФ) - ВИФЕРОН® - раствор для местного применения, включающая ИФН-а2Ь человеческий рекомбинантный, комплекс антиоксидантов и вспомогательные вещества. Ранее была показана активность НЛФ против ВПГ-инфекции в клеточной системе in vitro при профилактическом использовании [1, 18]. Целью настоящего исследования была оценка эффективности схемы мультимодальной терапии герпес-вирусной инфекции НЛФ ВИФЕРОН®, раствор для местного применения в сочетании со специфическими противовирусными химиопрепаратами, in vitro и in vivo. Материалы и методы Мыши. Опыты проводили на мышах линии DBA, самках массой тела 18-22 г, полученных из Центрального питомника лабораторных животных “Крюково” РАМН. Культуры клеток. В работе использовали первичную культуру диплоидных фибробластов легкого эмбриона человека (ФЛЭЧ) и перевиваемую линию клеток Vero, полученные из лаборатории клеточных культур ФГУ НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского Минздравсоцразвития России. Клетки ФЛЭЧ культивировали на среде DMEM (‘ПанЭко”, Россия), клетки Vero - в среде Игла MEM (“ПанЭко”, Россия) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС, “ПанЭко”, Россия), 2 мМ L-глутамина (“ПанЭко”, Россия), 50 мкг/мл гентамицина (“ПанЭко”, Россия). Вирусы. Использовали референс-штамм ЦМВ че ловека AD 169 и референс-штамм F ВПГ1, любезно предоставленные проф. D. Emanuel (США) и проф. L. Pereira (США) соответственно. ЦМВ размножали и титровали на культуре клеток ФЛЭЧ, ВПГ - на культуре клеток Vero по общепринятой методике. Определение инфекционной активности ВПГ и ЦМВ. Инфекционный титр ВПГ и ЦМВ определяли в культуре клеток модифицированным методом бляшек (очагов инфицированных клеток). Для титрования готовили образцы вируса и вносили в 96-луночные планшеты с монослоем клеток Vero (ВПГ) или ФЛЭЧ (ЦМВ). Панели с материалом инкубировали при 37°С в течение 7 дней. Бляшки выявляли иммуноцитохи-мическим методом с использованием моноклональных антител (МкА) к белкам ВПГ или ЦМВ [3, 4]. Титр вируса определяли по формуле: А = ахЬ/v, где А - число бляшкообразующих единиц на клетку в 1 мл (БОЕ/мл); a - среднее число бляшек на одну лунку; Ь -разведение вируса; v - объем вносимого вируссодержащего материала. Титр вируса составлял в среднем 1 · 107 БОЕ/мл для ВПГ и 1 · 105 БОЕ/мл для ЦМВ. Препараты. В работе использовали следующие препараты: ганцикловир (ГЦВ, Цимевен®, “Роше”, Швейцария), исходная концентрация 500 мг/мл; Ацикловир (АЦВ, Зовиракс®, “ГлаксоСмитКляйн Вэллком”, Великобритания), исходная концентрация 250 мг/мл; интерферон-а2Ь (НЛФ, ВИФЕРОН®, раствор для местного применения, 40 000 МЕ/мл, ООО “ФЕРОН”, Россия). Препарат ВИФЕРОН®, раствор для местного применения в качестве действующего вещества, содержит ИФН-а2Ь человеческий рекомбинантный 40 000 МЕ/мл, а также компоненты, обладающие антиоксидантными свойствами: димеркап-топропансульфонат натрия (унитиол) и моногидрат лимонной кислоты (активные компоненты), а также другие вспомогательные вещества. Определение цитотоксичности исследуемых препаратов. Оценку цитотоксичности исследуемых препаратов проводили следующим образом: к сформированному на стандартных 96-луночных планшетах клеточному монослою добавляли последовательные разведения приготовленных растворов исследуемых препаратов с конечной концентрацией 2,0, 1,5, 1,0, 0,5, 0,1 мг/мл для ГЦВ и аЦв и 5000, 10 000, 20 000 и 40 000 МЕ/мл для НЛФ. За 50% тканевую цитотоксическую дозу (ЦД50) принимали такую концентрацию препарата, которая вызывала гибель 50% клеток на 3-и сутки после внесения образцов. Оценка противовирусного действия препаратов in vitro. Противовирусную активность препаратов анализировали в лечебной схеме. Химиопрепараты (ГЦВ и АЦВ) изучали в 5 концентрациях: 100, 10, 1,0, 0,2 и 0,1 мкг/мл. НЛФ исследовали в двух концентрациях: 20 000 и 10 000 МЕ/мл. Для определения противовирусной активности препаратов клетки ФЛЭЧ заражали ЦМВ с инфекционной множественностью 0,01 БОЕ/мл, клетки Vero - ВПГ1 с ИМ 0,001 БОЕ/мл. Для оценки комбинированного противовирусного эффекта препараты вносили в различных концентрациях и сочетаниях. В качестве контроля использовали зараженные клетки, не обработанные препаратами. 30 Противовирусную активность веществ определяли по степени ингибирования цитопатического действия (ЦПД) вирусов, которую выражали в процентах. Концентрацию соединения, подавляющую ЦПД на 50% по отношению к контролю, принимали за ингибирующую дозу (ИД50). Индекс селективности (ИС) рассчитывали как отношение ЦД50 к ИД50. Анализ токсичности НЛФ in vivo изучали на беспородных мышах при интраназальном введении в кон-центрации4000МЕ/мышь,привнутрижелудочномвве-дении в концентрации 10 000 МЕ/мышь и внутрибрю-шинном введении в концентрации 20 000 МЕ/мышь. В каждой группе использовали по 12 животных. Анализировали следующие показатели: массу тела, гибель и общее состояние животных, гематологические и биохимические показатели крови, анализ мочи и данные патоморфологического исследования органов и тканей. Животных наблюдали в течение 28 сут. Изучение протективных свойств препаратов in vivo. Защитное действие препаратов против ВПГ исследовали в лечебной схеме, используя 13 групп животных по 10 мышей линии DBA в каждой группе. Мышей заражали внутрибрюшинно ВПГ1, вводя по 20 50% летальных доз в 1 мл (20 ЛД50/мл). Лечение начинали через 24 ч. Количества препаратов и продолжительность их введения представлены в разделе «Результаты и обсуждение». Лечебные свойства оценивали по способности исследуемого вещества защищать животных от летального заражения ВПГ1. Наблюдение проводили в течение 21 дня. Определение противовирусной активности комбинации АЦВ и НЛФ in vivo. Концентрации одного вещества и другого в комбинации и по отдельности, которые приводили к 50% защите животных, обозначали как 50% эффективная доза (ЭД50). Для оценки эффективности комбинации использовали понятие индекса суммарной фракционной ингибирующей концентрации (ФИК), значение которого вычисляли по формуле: индекс ФИК = ФИКА + мг/мл ГЦВ 5000 10000 АЦВ Рис. 1. Анализ цитотоксического действия препаратов. а - определение 50% цитотоксической дозы ГЦВ (квадраты) и АЦВ (треугольники). По оси абсцисс - концентрация АЦВ и ГЦВ; по оси ординат - ингибирование ЦПД вирусов по отношению к зараженным клеткам; б - определение 50% цитотоксической дозы НЛФ ВИФЕРОН®, раствор для местного применения. По оси абсцисс - концентрация; по оси ординат - ингибирование ЦПД вирусов по отношению к зараженным клеткам. ФИКБ, где ФИКА равна отношению ЭД50 АЦВ в комбинации к ЭД50 АЦВ, ФИКБ равна отношению ЭД50 НЛФ в комбинации к ЭД50 НЛФ. Статистическую обработку результатов осуществляли, применяя двусторонний точный критерий Фишера и критерий χ2. Различия показателей считали статистически значимыми при р < 0,05. Результаты и обсуждение В первой серия экспериментов была изучена цитотоксичность используемых препаратов in vitro. Данные по оценке ЦД50 для каждого из исследованных соединений представлены на рис. 1. Показано, что в условиях наших опытов ЦД50 для ГЦВ, рассчитанная по графику, составила 0,89 мг/мл, для АЦВ - 1,1 мг/мл (см. рис. 1, а), для НЛФ - 30 000 МЕ/ мл (см. рис. 1, б). Методика определения противовирусной активности препаратов изложена в разделе «Материалы и методы». Анализ противовирусного действия показал, что оба химиопрепарата в максимальной изученной концентрации (100 мкг/мл) полностью подавляли ЦПД вирусов (рис. 2, а, б). ИД50, рассчитанная по графику, для ГЦВ составила 0,12 мкг/мл (см. рис. 2, а), для АЦВ - 0,7 мкг/мл (см. рис. 2, б). ИС для ГЦВ составил 7417, для АЦВ -1571. Однократное введение НЛФ в концентрациях 10 000 и 20 000 МЕ/мл вызывало подавление цМв-инфекции на 83 и 88% соответственно, подавление ВПГ-инфекции - на 45 и 65% соответственно. ИД50 для НЛФ против ВПГ составила 12 500 МЕ/мл. В следующей серии опытов изучали эффективность комбинаций препаратов. Химиопрепараты использовали в низких концентрациях (1,0, 0,2, 0,1 и 0,01 мкг/мл), НЛФ - в концентрациях 20 000 и 10 000 МЕ/мл. Было установлено, что добавление НЛФ в концентрации 20 000 МЕ/мл к ГЦВ в концентрации 0,1 мкг/мл увеличивало противовирусное действие последнего с 42 до 77% ( см. рис. 2, а). Добавление НЛФ в той же концентрации к ГЦВ в концентрации 0,01 мкг/мл увеличивало ингибирующий эффект с 15 до 35%. Эффект сочетанного действия ГЦВ и НЛФ против ЦМВ-инфекции в обоих вариантах опыта был статистически значимо выше по сравнению с действием одного ГНЦ (р < 0,05). ИД50, рассчитанная по графику (см. рис. 2, а), для двух препаратов (ГНЦ + НЛФ) составила 0,038 мкг/мл. Добавление НЛФ к АЦВ в концентрации 1 мкг/мл не привело к значимому увеличению противовирусной активности смеси по сравнению с использованием одного АЦВ (см. рис. 2, б). При использовании более низких концентраций АЦВ (0,2, 0,1 20000 МЕ/мл 40000 31 ЭПИДЕМИОЛОГИЯ И ИНФЕКЦИОННЫЕ БОЛЕЗНИ, № 2, 2012 80 50 40 - Л........*........ / Ж " К' 1 ^ 1 ^ ^111 0,01 10 100 к гнц 0,1 1,0 мкг/мл - ГНЦ+НЛФ 20000 МЕ/мл -к- АЦВ 0,1 1,0 10 100 мкг/мл - АЦВ+НЛФ 20000 МЕ/мл Рис. 2. Сравнительный анализ противовирусной активности химиопрепаратов в отдельности и в комбинации с НЛФ ВИФЕРОН®, раствор для местного применения. а - противовирусная активность ГЦВ (треугольники) и комбинации ГЦВ с НЛФ (квадраты) при заражении клеток ФЛЭЧ ЦМВ с ИМ 0,01 БОЕ/мл; б - противовирусная активность АЦВ (треугольники) и комбинации АЦВ с НЛФ (квадраты) при заражении клеток Vero ВПГ 1-го типа с ИМ 0,001 БОЕ/мл. По оси абсцисс - концентрация препаратов; по оси ординат - ингибирование ЦПД вируса в культуре клеток. и 0,01 мкг/мл) в смеси с НЛФ ингибирование ВПГ-инфекции отмечено на 71, 70 и 20% соответственно, тогда как при использовании одного АЦВ ингибирующий эффект составлял 35, 20 и 5% соответственно (р < 0,05). ИД50 для смеси АЦВ + НЛФ составила 0,035 мкг/мл (см. рис. 2, б). Таким образом, сочетанное использование НЛФ снижает ИД50 ГНЦ в 3 раза (с 0,12 до 0,038 мкг/мл) и ИД50 АЦВ - в 20 раз (с 0,7 до 0,035 мкг/мл). Следующая часть работы была посвящена изучению противовирусного действия данных соединений in vivo - на модели экспериментальной инфекции лабораторных животных. Сочетанное действие препаратов тестировали в отношении летальной инфекции, вызванной ВПГ1 у мышей. На первом этапе исследовали токсичность НЛФ. Показано, что НЛФ при однократном (острая токсичность) интраназальном, внутрижелудочном и внутрибрюшинном введении в концентрациях 4000, 10 000 и 20 000 МЕ/мышь соответственно не обладала токсическим действием на организм животных. При изучении токсичности при повторном введении в течение 15 дней (подострая токсичность) не было установлено видимых признаков изменения общего клинического состояния. На протяжении курса введения и в период отмены динамика изменения массы тела животных была положительной. При проведении клинических лабораторных исследований не было установлено влияния НЛФ на состав периферической крови и показатели мочи животных. В результате проведенного патоморфологического исследования не установлено морфологических изменений в органах и тканях мышей. В дальнейших экспериментах использовали концентрации НЛФ, не превышающие уровней, испытанных при анализе токсичности. Противовирусные свойства препаратов анализировали в лечебной схеме. Схема, сроки и результаты терапии представлены в таблице. Наиболее вы раженный протективный ответ представлен на рис. 3. Из таблицы видно, что в контрольной 12-й группе в течение 10 дней после заражения погибли все 100% (10/10) животных. Все животные 13-й группы оставались живыми в течение 21 дня опыта и в следующие 30 дней (время наблюдения). Однократное введение НЛФ в концентрации 20 000 МЕ/мышь (3-я группа) привело к защите 60% (6/10) животных, однако различия оказались статистически незначимыми; р = 0,087 (см. таблицу, рис. 3). В 1, 2, 4, 5 и 6-й группах терапевтический эффект выявлен не был. Применение в 7-й группе более длительной схемы терапии (50 мг/кг АЦВ каждые 12 ч в течение 3 сут) привело к 100% (10/10) защите животных (см. таблицу). Использование АЦВ в концентрации 5 мг/кг в 3-дневной схеме защищало 40% (4/10) животных 7-й группы (см. таблицу, рис. 3). У животных 9-й и 10-й групп наблюдали 30% протективный эффект. Совместное применение НЛФ в концентрации 2000 МЕ/мышь и АЦВ в концентрации 5 мг/кг (11-я группа) позволило статистически значимо увеличить защитный эффект - с 40 до 100%; р = 0,11 (см. таблицу, рис. 3). Рассчитанная по графику ЭД50 для АЦВ составила 12,5 мг/кг, а в сочетании с НЛФ - 3 мг/кг, ФИКА равна 0,24. Для НЛФ значение ЭД50 составило 18 333 Сутки АЦВ 50 мг/кг АЦВ 5 мг/кг+НЛФ 2000 МЕ/мышь Контроль, не обработанные препаратами АЦВ 5 мг/кг НЛФ 20 000 МЕ/мышь, однократно Рис. 3. Протективные свойства АЦВ и комбинации АЦВ с НЛФ ВИФЕРОН®, раствор для местного применения при заражении мышей ВПГ 1-го типа в дозе 20 ЛД50/мл. По оси абсцисс - время наблюдения; по оси ординат - доля выживших животных. 32 Режим лечения летальной герпес-вирусной инфекции мышей противовирусным препаратом «Ацикловир» в сочетании с НЛф ВИфЕРОН®, раствор для местного применения. Группа живот ных Препараты Количество выживших животных, % Схема введения 1 АЦВ 50 мг/кг 0/10 0,5 мл через 24 ч после заражения, однократно, вну-трибрюшинно 2 АЦВ 5 мг/кг 0/10 3 НЛФ 20 000 МЕ/мышь 6/10 (60%) 4 НЛФ 10 000 МЕ/мышь 0/10 5 АЦВ 50 мг/кг + НЛФ 2000 МЕ/мышь 0/10 6 АЦВ 5 мг/кг + НЛФ 2000 МЕ/мышь 0/10 7 АЦВ 50 мг/кг 10/10 (100%) 8 АЦВ 5 мг/кг 4/10 (40%) 9 АЦВ 5 мг/кг + НЛФ 1000 МЕ/мышь 3/10 (30%) 10 АЦВ 2,5 мг/кг + НЛФ 2000 МЕ/мышь 3/10 (30%) 11 АЦВ 5 мг/кг + НЛФ 2000 МЕ/мышь 10/10 (100%) 12 Инфицированные мыши, не обработанные препаратами (контроль) 0/10 МЕ/мышь, а в сочетании с АЦВ - 1090 МЕ/мышь, ФИК равна 0,06. На основе полученных результатов было определено значение индекса ФИК для двух изученных препаратов, которое составило 0,3, что свидетельствует о синергидном действии препаратов. Таким образом, снижение концентраций АЦВ и НЛФ в 10 раз при совместном введении в течение 3 дней обеспечивало 100% защиту экспериментальных лабораторных животных от летального заражения ВПГ1 в дозе 20 ЛД50/мл. В настоящее время АЦВ, специфически ингибирующий активность вирусной ДНК-полимеразы, является препаратом выбора для лечения ВПГ-инфекции у новорожденных детей. Длительность лечения составляет 14 сут при инфицировании кожи, глаз и/или ротовой области и 21 сут для лечения генерализованной инфекции и заболеваний ЦНС [9]. Несмотря на то что при использовании данной терапии смертность от энцефалитов снижается до 15%, только 50% выживших детей развиваются нормально [7]. В связи с токсичностью ГЦВ важной проблемой является выбор адекватного курса терапии новорожденных, в том числе недоношенных, с ЦМВ-инфекцией [13]. Хорошие результаты дает препарат «Цитотект»® («Biotest Pharma», Германия), содержащий антитела к ЦМВ, однако этот импортный препарат является дорогостоящим и малодоступным. В настоящее время накоплен опыт лечения ЦМВ-инфекции препаратами иммуноглобулинового ряда (пентаглобин), лекарственными средствами на основе цитокинов (виферон, ронколейкин), индукторов интерферона (неовир, ци-клоферон). Однако, несмотря на лечение этими препаратами, смертность при генерализованной неонатальной герпес-вирусной инфекции остается высокой, составляя от 40 до 65% [8]. В ряде исследований предприняты попытки усилить терапевтическое действие патентованных химиопрепаратов, противовирусное действие которых хорошо изучено. К этому побудили не только данные о токсическом действии этих препаратов, но также сведения о том, что задержка с началом лечения тяжелых форм ВПГ-инфекции даже на 24 ч делает использование АЦВ малоэффективным. Недавно была изучена противовирусная активность новых соединений: ингибитора тимидинкиназы и геликаза-праймазного комплекса ВПГ [6, 7]. Комбинированное действие ингибиторов с АЦВ защищало мышей от герпетического энцефалита. И хотя в опытах использовали относительно высокие дозы препаратов, авторы полагают, что дальнейшие исследования в этом направлении перспективны. Ранее в работе Т. Спектор и соавт. [17] было установлено, что инактиватор еще одного фермента ВПГ - рибону-клеотидредуктазы - усиливает действие АЦВ против ВПГ. Поиск новых молекулярных мишеней проводится и в отношении ЦМВ-инфекции, однако ингибиторы вирусной протеинкиназы UL97 и терминазы ЦМВ не дали обнадеживающих результатов при клинических испытаниях [11, 12]. В настоящей работе был использован другой подход, направленный не на расширение спектра ингибиторов вирусных ферментов, а на разработку комплексной терапии, включающей препараты, воздействующие как на вирус, так и на инфицированный организм. Основным действующим компонентом НЛФ является ИФН-а2Ь - полифункциональный цито-кин, который индуцирует экспрессию генов системы ИФН и оказывает иммуномодулирующее и противовирусное действие. Кроме того, препарат содержит два антиоксиданта (унитиол и лимонную кислоту), препятствующих повреждающему действию свободнорадикального окисления. Ранее было установлено, что комбинация из этих двух антиоксидантов с ИФН-а2Ь позволяет усилить противовирусную активность ИФН-а2Ь в опытах in vitro в несколько раз [2]. В настоящей работе впервые показана высокая активность НЛФ против ЦМВ-инфекции. Следует отметить, что эффективность НЛФ в подавлении ЦМВ-инфекции превосходила таковую против ВПГ-инфекции почти в 2 раза (83% против 45%). Больший терапевтический эффект НЛФ, полученный при ЦМВ-инфекции по сравнению с ВПГ-инфекцией, возможно, связан с различиями в жизненном цикле обоих вирусов. Известно, что ЦМВ-инфекция развивает 20 ЛД50 ВПГ1, вну-трибрюшинно 13 неинфицированные мыши, обрабо- 10/10 (100%) 0,5 мл физиологитанные физиологическим раствором ческого раствора, (плацебо) внутрибрюшинно 0,5 мл через 24 ч после заражения, 2 раза в сутки, в течение 3 суток, внутрибрюшинно 33 ЭПИДЕМИОЛОГИЯ И ИНФЕКЦИОННЫЕ БОЛЕЗНИ, № 2, 2012 ся медленнее, чем ВПГ-инфекция. В культуре клеток первые инфекционно активные вирионы ЦМВ высвобождаются из клеток через 96 ч после инфицирования, тогда как вирионы ВПГ - через 8 ч [16]. НЛФ, внесенный через 24 ч после заражения клеток ЦМВ, по-видимому, воздействует на более ранние стадии вирусной инфекции, предшествующие репликации вирусной ДНК, запуская ряд механизмов, эффективно ингибирующих вирусное ЦПД. АЦВ и ГЦВ в составе комплексной терапии с иммунопрепаратом подавляют репликацию вирусной ДНК, дополняя и усиливая действие каждого из компонентов в отдельности. В пользу этого предположения свидетельствуют данные анализа эффективности сочетанного действия КП с химиопрепаратами in vitro [2]. В настоящей работе в опытах на клеточных культурах это заключение нашло подтверждение на примерах ВПГ- и ЦМВ-инфекций: было показано, что сочетанное применение НЛФ и химиопрепаратов позволяет значительно снизить эффективную концентрацию последних. Наиболее важной характеристикой любого исследуемого препарата является его низкая токсичность и способность защищать зараженный организм от летальных доз вируса. В настоящей работе показано, что НЛФ в максимально изученной концентрации (20 000 МЕ/мышь) не обладает токсическим действием на животных при различных способах введения. Впервые показано, что даже однократное введение НЛФ в концентрации 20 000 МЕ/мышь защищает 60% мышей, а в комбинации с АЦВ - 100% мышей от 20 ЛД50 ВПГ 1-го типа. Наибольший протективный эффект был достигнут при 3-дневном комплексном лечении животных. При этом удалось снизить дозу обоих соединений в 10 раз по сравнению со стандартной схемой терапии АЦВ, используемой при лечении более легких форм ВПГ-инфекции у животных [5, 7]. Ранее было установлено, что НЛФ в сочетании со специфическими химиопрепаратами оказывают синергическое действие в отношении ряда вирусных инфекций in vitro [2]. Представляло интерес выяснить характер взаимодействия препаратов в ситуации in vivo. Было определено значение индекса ФИК, которое составило 0,3. Согласно имеющимся данным, значение индекса ФИК, меньшее или равное 0,5, свидетельствует о синергидном характере взаимодействия изученных препаратов [10]. Таким образом, показанная в данной работе возможность комбинирования новой лекарственной формы ВИФЕРОНА®, раствора для местного применения, 40 000 МЕ/мл (ООО «ФЕРОН», Россия) с химиопрепаратами дает основание для разработки новых схем мультимодальной терапии герпес-вирусных инфекций человека, позволяющих снизить терапевтические концентрации лекарственных соединений, сократить продолжительность лечения и, следовательно, избежать проявления побочных токсических эффектов при сохранении высокой противовирусной эффективности. Выводы 1. Впервые установлено, что НЛФ ВИФЕРОН®, раствор для местного применения, в концентрации 20 000 МЕ/мл на 83% ингибирует ЦМВ-инфекцию в терапевтической схеме in vitro. 2. Опыты острой и подострой токсичности на животных при интраназальном, внутрижелудочном и внутрибрюшинном введении НЛФ препарата ВИ-ФЕРОН® продемонстрировали отсутствие изменений по следующим показателям: масса тела, гибель и общее состояние животных, гематологические и биохимические показатели крови, анализ мочи и патоморфологии органов и тканей. 3. Показано, что НЛФ препарата ВИФЕРОН®, раствора для местного применения, усиливает специфическую противовирусную активность химиопрепаратов в лечебной схеме in vitro, позволяя значительно снизить эффективную ингибирующую концентрацию последних: для ГЦВ в 3 раза, для АЦВ в 20 раз. 4. В экспериментах in vivo продемонстрировано, что НЛФ препарата ВИФЕРОН®, раствора для местного применения, однократно введенного через 24 ч после внутрибрюшинного заражения мышей ВПГ1, защищает 60% животных от летальной (20 ЛД50/мл) герпес-вирусной инфекции. 5. Использование НЛФ препарата ВИФЕРОН®, раствора для местного применения, в сочетании с АЦВ в лечебной схеме in vivo позволило: а) уменьшить дозы обоих препаратов в 10 раз (до 2000 МЕ/мл и 5 мг/кг соответственно) по сравнению с применением каждого препарата в отдельности; б) достичь лечебного эффекта при использовании короткой схемы терапии - 3 сут; в) обеспечить полную защиту (100%) животных от летального заражения (20 ЛД50/мл) ВПГ1. 6. Высокий протективный эффект мультимодальной терапии летальной герпес-вирусной инфекции in vivo обусловлен синергидным характером взаимодействия использованных препаратов.

About the authors

A. N. Vasiliev

Center for examination and control of proprietary medicines, Federal State Institution National Research Center for Medicinal Products Quality Control of Ministry of Public Health and Social Development

R. R. Klimova

Federal State Budget-Financed Institution “D. I. Ivanovsky Institute of Virology”

Yu. A. Tyulenev

Federal State Budget-Financed Institution “D. I. Ivanovsky Institute of Virology”

References

Supplementary files