QUANTITATIVE DETERMINATION OF VIBRIO CHOLERAE CELLS IN BIOFILMS BY RT-PCR

Abstract

Introduction Vibrio cholerae can exist in planktonic and biofilm forms. There are no unified methods for recording the formation of a biofilm and the quantitative determination of microorganisms; the known methods [3-6] are laborious and do not allow an objective assessment of the concentration of V. cholerae in biofilms.
Aims - to evaluate the method for the quantitative determination of Vibrio cholerae in biofilm and planktonic forms based on real-time PCR.
Materials and methods The concentration of Vibrio сholerae in plankton was determined by the bacteriological method by the number of colony-forming units per 1 ml; in biofilms, the method of imprint depletion on agar plates was used. Real-time PCR was performed using the primers and probes described in the literature for the detection of the hlyA and ctx genes. Vibrio cholerae were quantified using built-in software and standard preparations with a known concentration of bacterial cells. The results were processed in Microsoft Office Excel 2016 spreadsheets using the decimal logarithm; statistical analysis was performed using the STATISTICA 13.3 program.
Results During the observation period, the concentration of V. cholerae in biofilms on chitin and plastic increases as the incubation period increases. The amount of V. cholerae in the composition of biofilms and plankton on/above chitin exceeded those when used as a plastic substrate. On the 30th day, the difference was two or more orders of magnitude. The results of the two methods were reproducible and comparable; at the same stages, the concentration of V. cholerae varied within the same order of magnitude, which indicated the reliability of the PCR–RT results.
Conclusion The bacteriological method is informative in the qualitative assessment of biofilms, in determining the viability of cholera vibrios. However, due to its complexity, the impossibility of quickly determining the concentration of V. cholerae in a biofilm on chitin, it is preferable to use real-time PCR, which allows you to assess the concentration of V. cholerae in plankton and biofilm accurately and quickly.

Full Text

Введение.

В практической микробиологии существует несколько способов определения количества бактерий у планктонных форм. Наиболее распространенными являются: чашечный метод (посев суспензии исследуемых микроорганизмов на пластины агара после десятикратных разведений), подсчет колоний на мембранных фильтрах, метод предельных разведений [1, 2]. При вычислении концентрации микробных клеток устанавливается процентное содержание жизнеспособных клеток, определяемое числом живых клеток на единицу объема суспензии (число колониеобразующих единиц в мл -КОЕ/мл).

Холерные вибрионы, как и большинство микроорганизмов, могут существовать в планктонной форме и форме биопленки. На сегодняшний день еще нет унифицированных методов, регистрирующих образование биопленки и определение количества составляющих ее микроорганизмов. Наиболее часто используют визуальные и фотометрические методы, основанные на поглощении генцианвиолета микроорганизмами, по которому можно произвести качественную и количественную оценку микробных биопленок [3-6]. Есть и другие способы подсчета, так численность клеток холерных вибрионов в биопленках определяют ресуспендированием и диспергированием путем обработки в ультразвуковой водяной бане [7], методом отпечатков на пластинах агара биопленок, образованных на покровных стеклах [8].

Однако эти способы достаточно трудоемки и не позволяют объективно оценить концентрацию холерных вибрионов в биопленках, образованных на биотических субстратах. Поэтому мы, впервые использовали методику полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР-РВ) для подсчета концентрации холерных вибрионов в биопленках, сформированных на различных субстратах.

Цель - оценить метод количественного определения холерных вибрионов в биопленочной и планктонной формах на основе ПЦР-РВ.

Материалы и методы

В работе использовали штаммы Vibrio сholerae О1 ElT or ctx+:19613, 18210, 18336, 18337 и V. сholerae classical 17917 (ctx+); V. сholerae О1 El Tor 20000 (ctx-) выделенные на территории Российской Федерации. Штаммы получены из лаборатории «Коллекция живых культур микроорганизмов» ФКУЗ Ростовский-на-Дону противочумный институт Роспотребнадзора. 

Для изучения способности холерными вибрионами формировать биопленку на биотических, абиотических субстратах и приготовления калибровочных стандартов в методике ПЦР-РВ использовали суточную культуру, выращенную на агаре Мартена (pH 7,6- 7,8) при температуре 37о С. Взвесь холерных вибрионов готовили по стандарту мутности ГИСК им. Л.А. Тарасевича (ОСО-42-25-59-86П), которую десятикратно последовательно разводили до нужной по условиям эксперимента концентрации (109- 102 КОЕ/мл).

Биопленки холерных вибрионов получали запатентованными способами, описанным ранее: в 30 мл стерильной речной воды, при комнатной температуре культивирования, в качестве твердого субстрата использовали пластинки из пищевого пластика и фрагменты хитина размером 0,5×0,5 см [9-12]. В качестве контроля все исследуемые штаммы засевали во флаконы с 30 мл речной автоклавированной воды без субстратов. Для выполнения поставленной цели концентрацию холерных вибрионов в планктоне и биопленках количественно оценивали в двумя способами: бактериологическим методом и ПЦР-РВ.

Бактериологическим методом концентрацию холерных вибрионов в планктоне определяли по числу колониеобразующих единиц (КОЕ) в 1 мл. Для этого высевали 0,1 мл планктона нативного материала или соответствующего его разведения на пластины с агаром Мартена (pH 7,6- 7,8). После инкубации при температуре 37оС подсчитывали КОЕ с последующей статистической обработкой полученных данных. Для подсчета концентрации холерных вибрионов в биопленках, образованных на пластинках пластика и хитина, их извлекали из флаконов, отмывали забуференным физиологическим раствором (PBS) от неадгезированных вибрионов, высушивали на листе фильтровальной бумаги, помещали на агаровые пластины, поэтапно переворачивая и придавливая к агару, с помощью пинцета. Процедуру проводили до полного истощения культуры на твердом субстрате. Далее также, как и с планктонной культурой, после инкубации при температуре 37оС подсчитывали КОЕ с последующей статистической обработкой полученных данных.

В ряде экспериментов количество вибрионов в биопленках подсчитывали, удаляя биопленочный материал с пластинки в PBS острозаточенным скальпелем, или диспергированием адгезированных клеток на приборе «Vortex» в режиме максимальной мощности в течение одной минуты с последующим посевом полученных взвесей методом серийных разведений на пластины агара Мартена.

С помощью молекулярно-генетических методов количественное определение токсигенных холерных вибрионов проводили способом, предложенным Huang J. Et al. (2009 г.) [13], для нетоксигенных использовали методику, предложенную Lyon W.J. в 2001 г. [14]. С этой целью 0,5 мл взвеси планктонной формы помещали в пробирки типа «эппендорф» емкостью 1,5 мл, пластины с биопленками после промывания также помещали в пробирки, содержащие 0,5 мл деионизированной воды. Лизис клеток биопленки и планктонной формы проводили путем прогревания в течение 30 минут при 99оС с последующим высевом для подтверждения стерильности. Олигонуклеотидные зонды, меченные по концам флюорофорами гасителем BHQ1, синтезированы НПФ фирмой «Евроген» (Москва). Амплификацию в формате реального времени ставили в амплификаторе ДТ-лайт (НПФ «ДНК-технология», Москва). В качестве стандарта использовали 1 млрд. взвесь V. сholerae О1 El Tor 19191 в соответствующих серийных разведениях, обработанную аналогичным способом. Состав амплификационной смеси описан нами ранее [15]. Амплификацию проводили по следующей схеме: денатурация при 95 °С - 3 мин (1 цикл); затем 35 циклов: денатурация при 95 °С - 20 с, отжиг и регистрация при 60 °С - 20 с, синтез при 72 °С - 20 с. Количественный учет результатов числа бактериальных клеток в пробе проводили с использованием встроенного программного обеспечения амплификатора. С этой целью в соответствующие графы таблицы протокола вносили количественные показатели стандартов, по которым программа выстраивала кривую линию, в соответствии с которой проводится автоматический расчет концентрации исследуемых проб. Учет детекции флуоресцентного свечения проводили согласно инструкции производителя.

Эксперименты по оценке концентрации холерных вибрионов в биопленке и планктоне проводили в трехкратной повторности. Накопление, корректировка, систематизация исходной информации и визуализация полученных результатов осуществлялись в электронных таблицах MicrosoftOfficeExcel 2016, используя десятичный логарифм. Статистический анализ проводился с использованием программы STATISTICA 13.3 (разработчик - StatSoft.Inc). Полученные данные объединяли в вариационные ряды, в которых проводили расчет средних арифметических величин (M) в качестве ошибки среднего представляли стандартное отклонение. Если концентрация холерных вибрионов была в пределах одного порядка, то эти значения оценивали, как идентичные.

Все работы с ПБА осуществляли в соответствии с СанПиНом 3.3686-21 «Санитарно-эпидемиологические требования по профилактике инфекционных болезней».

Результаты и обсуждения

С помощью методики последовательных отпечатков биопленки холерных вибрионов на пластинах агара Мартена и механическим удалением биопленочного материала с покровных стекол (пластинок пластика) в PBS с дальнейшим высевом на пластины агара Мартена получены идентичные результаты по КОЕ. На рисунке 1 представлен результат отпечатков биопленки V. cholerae 19613 на пластинах агара Мартена.

Рисунок 1 - Биопленка V. choleraе El Tor 19613на покровных стеклах в отпечатках на пластинах агара.

Figure 1-V. cholerae El Tor 19613 biofilm on cover glasses in prints on agar plates.

Аналогичный эксперимент был проведен в отношении шести штаммов: V. сholerae О1 El Tor ctx+: 19613, 18210, 18336, 18337 и V. сholerae classical 17917 (ctx+); V. сholerae О1 El Tor 20000 (ctx-). Результаты, полученные бактериологическим методом, представлены в таблице 1.

Таблица 1 - Сравнение концентрации холерных вибрионов методом отпечатков биопленок на пластинах агара и механическим удалением с поверхности стекла/пластика.

Table 1-Comparison of the concentration of Vibrio cholerae by the method of biofilm prints on agar plates and mechanical removal from the surface of glass/plastic.

сутки

day

Биопленка V. choleraе El Tor на стекле/ пластике(КОЕ/мл)

V. cholerae El Tor biofilm on glass / plastic (CFU/ml)

Метод отпечатков биопленки на агаре

Method of biofilm prints on agar

Метод механического удаления биопленки

Mechanical biofilm removal method

КОЕ

LоgКОЕ

КОЕ

LоgКОЕ

1

n×104

4

n×104

4

5

n×105

5

n×105

5

7

n×107

7

n×107

7

n – значение концентраций холерных вибрионов

Как видно из таблицы 1, наблюдается динамика увеличения концентрации холерных вибрионов в зависимости от времени инкубации. Количество клеток испытуемых штаммов (КОЕ/мл) в одинаковые интервалы времени было в пределах одного порядка разведения, а при переводе в десятичные логарифмические единицы их различия становились незначительными. Чтобы не перегружать таблицу, значения исследуемых штаммов не введены, а представлены символом «n», который был в пределах от 1-6. Ранее таким же способом изучен состав и соотношение сигнатур полимикробных биопленок [10].

На примере двух штаммов V. cholerae El Tor 19613 (ctx+) и V. cholerae El Tor 20000 (ctx-) в таблице 2 представлена концентрация планктонных и биопленочных форм в динамике на протяжении одной недели. В качестве биотического субстрата биопленки использован хитин речного рака. В момент внесения холерных вибрионов токсигенных и нетоксигенных штаммов в пробы их концентрация в планктоне составляла 104 КОЕ/мл, биопленка была без холерных вибрионов. Через сутки исследования наблюдалась адгезия клеток V. cholerae, на пятые сутки была сформирована биопленка, что подтверждено появлением экзополисахарида при специфическом окрашивании. Сходная динамика образования биопленок холерных вибрионов представлена в предыдущей работе [8].

Таблица 2 -Концентрация V. cholerae El Tor ctx+, ctx-  штаммов в планктоне и биопленке на хитиновом субстрате.

Table 2-Concentration of V. cholerae El Tor ctx+, ctx- - strains in plankton and biofilm on chitin substrate.

сутки

day

V. cholerae El Tor 19613 ctxА+

(lgКОЕ/мл)

V. cholerae El Tor 20000 ctxА-

(lgКОЕ/мл)

Планктон

Plankton

Биопленка

Biofilm

Планктон

Plankton

Биопленка

Biofilm

до 1часа

4,06±0,04

0

4,09±0,05

0

1

5,05±0,04

30 отпечатков – сливн. рост

30 prints-drained. height

6,09±0,05

30 отпечатков – сливн. рост

30 prints-drained. height

5

5,74±0,09

30 отпечатков – сливн. рост

30 prints-drained. height

7,08±0,04

30 отпечатков – сливн. рост

30 prints-drained. height

7

6,08±0,13

60 отпечатков – сливн. рост

60 prints-drained. height

7,62±0,02

60 отпечатков – сливн. рост

60 prints-drained. height

Примечание 0–отсутствие холерных вибрионов в отпечатках

Note 0-absence of vibrio cholerae in the prints

В ходе исследований через сутки после высева исследуемых проб концентрация холерных вибрионов в планктоне увеличилась на один – два порядка от исходной и составила 5,05±0,04 у штамма V. cholerae 19613 ctx+ и 6,09±0,05 lgКОЕ/мл у штамма V. cholerae 20000 ctx-, а из биопленки эти культуры росли сплошным газоном у обоих штаммов. Через неделю концентрация холерных вибрионов в планктоне увеличилась и колебалась от 6,08±0,13 до 7,62±0,02 lgКОЕ/мл, соответственно, а культуры из биопленки росли в виде сплошного газона.

С помощью методики отпечатывания биопленок холерных вибрионов на пластинах агара их концентрацию на хитиновом субстрате подсчитать не удалось. По всей площади пластины агара (30 отпечатков) культура образовывала сливной рост.

При продолжительных исследованиях до месяца и более структура хитина изменялась, и отпечатать его с помощью пинцета или скальпеля на пластинах агара стало не возможным из-за его хрупкости. Поэтому данный способ был оправдан только для подтверждения жизнеспособности культуры холерных вибрионов.

Как видно, бактериологический метод достаточно трудоемок и проблематичен при использовании мягких абиотических субстратов, таких как, мягкие сорта пластика, а также биотических субстратов, в частности, фрагментов хитина речного рака, чешуи рыбы и других. В экспериментах края, перечисленных выше субстратов сворачиваются, что создает проблемы, в виде неполных отпечатков на пластинах агара и соответственно неточность в подсчете КОЕ холерных вибрионов в биопленках.

При использовании биотического субстрата - хитина речного рака происходит быстрое увеличение концентрации, и точно определить количество холерных вибрионов в биопленке не представляется возможным из-за сливного роста колоний холерных вибрионов. Поэтому количественное определение холерных вибрионов в биопленке и планктоне проводили методом ПЦР-РВ, который был успешно применен для выявления возбудителей инфекций в мочевыводящих путях с определением количества микробных клеток в биологических жидкостях [16] и при изучении биопленок, образуемых парагемолитическими вибрионами на биотических субстратах [17].

Вначале методом ПЦР-РВ сравнили концентрации одномиллиардных взвесей холерных вибрионов, определяемые двумя способами: путем десятикратных последовательных разведений и высевов на пластины агара Мартена с последующим пересчетом КОЕ на 1 мл исследуемой пробы и с помощью способа ПЦР-РВ. Результаты представлены в таблице 3.

Таблица 3 Сравнительная количественная оценка одномиллиардных взвесей разных штаммов V. cholerae на основе бактериологического и ПЦР-РВ методов

Table 3 Comparative quantitative assessment of one-billion suspensions of different V. cholerae strains based on bacteriological and RT-PCR methods

Штаммы

Strains

Бактериологический метод (lg КОЕ/мл)

Bacteriological method (lg CFU/ml)

ПЦР - РВ

(lgкопийДНК/млилиlgм.к./мл)

RT-PCR (lg copies of DNA/ml or lgmk/ml)

 

1

2

3

V.cholerae El Tor 19613

9,29±0,08

9,37±0,03

V. cholerae El Tor 18210

9,29±0,08

9,57±0,01

V.cholerae El Tor 18336

9,32±0,01

9,34±0,01

V.cholerae El Tor 18337

9,33±0,02

9,50±0,01

V.cholerae El Tor 20000

9,04±0,03

9,07±0,02

V.cholerae classical 17917

9,05±0,04

9,10±0,04

 

Согласно полученным результатам (таблица 3), концентрация холерных вибрионов, установленная бактериологическим методом, колебалась от 9,04±0,03 до 9,33±0,02 lgКОЕ/мл. Данные, полученные на основе ПЦР-РВ, были в пределах от 9,07±0,02 до 9,57±0,01 lg м.к./мл.

Как видно из таблицы 3, результаты определения концентрации одномиллиардных взвесей были практически идентичными. Для подтверждения достоверности результатов, полученных методом ПЦР – РВ и установлении чувствительности данного метода в следующих экспериментах использовали пробы последовательных десятикратных разведений. Установлена концентрация холерных вибрионов равная 1,0×106; 1,0×105; 1,0×104 КОЕ/мл, соответствующая их разведениям.

Дальнейшее определение концентрации холерных вибрионов осуществляли на трех экспериментальных пробах: сформированная биопленка холерных вибрионов на биотическом субстрате (хитин речного рака), на абиотическом – пищевой пластик и планктонной пробе над пластиком. Из каждой пробы исследованию подвергались исходная проба и два последовательных десятикратных разведения. Полученные количественные результаты на седьмые сутки культивирования, представлены в таблице 4.

Таблица 4 - Концентрация холерных вибрионов в биопленках с помощью метода ПЦР-РВ.

Table 4 – Concentration of Vibrio cholerae in biofilms using the RT-PCR method.

Проба№

SampleNo

Штамм

strain

Субстрат

substrate

Разведение

Breeding

ПЦР-РВlg КОЕ/мл

RT-PCRlgCFU / ml

1

2

3

4

5

1

V.cholerae 19613

Хитин

chitin

 

Биопленка

biofilm

8,12±0,12

2

10-1 (1:10)

6,90±0,04

3

10-2 (1:100)

5,88±0,03

4

Пластик

plastic

Биопленка

biofilm

6,56±0,08

5

10-1 (1:10)

5,33±0,14

6

10-2 (1:100)

4,56±0,08

7

Планктон над пластиком

Planktonoverplastic

Цельное

Solid

6,14±0,30

8

10-1 (1:10)

4,89±0,04

9

10-2 (1:100)

4,31±0,15

По результатам таблицы 4 видно, что концентрация холерных вибрионов в биопленке зависит от субстрата и разведения пробы. На хитине концентрация клеток холерных вибрионов в несколько раз выше, чем на пластике. Концентрация холерных вибрионов в планктоне над пластиком и на самом пластике были приблизительно одинаковыми. В последовательных десятикратных разведениях концентрация холерных вибрионов соответственно уменьшается. Получить эти значения, используя бактериологический метод, было бы невозможно из-за сливного роста культуры на пластинах агара.

Удостоверившись в идентичности экспериментальных данных, полученных бактериологическим методом и методом ПЦР-РВ в отношении численности холерных вибрионов исследуемых проб, в дальнейших экспериментах, для количественного определения V. cholerae в биопленочной и планктонной формах использовали методику на основе ПЦР-РВ (таблица 5).

Таблица 5 Концентрация холерных вибрионов в биопленках на хитине и пластике в динамике

Table 5– The concentration of Vibrio cholerae in biofilms on chitin and plastic in dynamics

V.cholerae El Tor19613

сутки

day

Биопленка (lgм.к./мл)

Biofilm (lgmk/ml)

Планктон (lgм.к./мл)

Plankton (lgmk/ml)

Контроль (lgм.к./мл)

Control (lgmk/ml)

Хитин

chitin

Пластик

plastic

Хитин

chitin

Пластик

plastic

до 1 час

0

0

3,96±0,02

3,57±0,07

3,50±0,02

10

7,76±0,01

3,85±0,01

7,47±0,05

4,74±0,3

4,35±0,04

30

9,35±0,02

4,53±0,01

8,91±0,01

6,08±0,08

4,06±0,04

Примечание: 0 – отсутствие холерных вибрионов в отпечатках

Note: 0-absence of vibrio cholerae in the prints

В таблице 5 приведена, как пример, концентрация одного токсигенного штамма V.cholerae El Tor 19613, подсчитанная методом ПЦР-РВ в биопленках, образованных на абиотическом (пластик) и биотическом (хитин) субстратах, а так же планктонных формах и контрольных пробах без субстратов в течение одного месяца при комнатной температуре. Холерные вибрионы, как и в предыдущих экспериментах, cформировали биопленку на пятые сутки. К десятым суткам инкубации количество клеток холерных вибрионов в биопленках на хитине достигло концентрации 7,76±0,01 lgм.к./мл, в планктоне над хитином - 7,47±0,05 lgм.к./мл, на пластике 3,85±0,01 lgм.к./мл, а в планктоне над пластиком - 4,74±0,3 lgм.к./мл. В течение срока наблюдения (1 месяц) происходило увеличение концентрации холерных вибрионов. К 30 суткам концентрация холерных вибрионов в биопленках на хитине и в планктоне над хитином составляла 9,35±0,02 и 8,91±0,01 lgм.к./мл, соответственно, а на пластике - 4,53±0,01 lgм.к./мл, в планктоне над пластиком - 6,08±0,08 lgм.к./мл. В контрольных пробах концентрация холерных вибрионов в конце периода наблюдения осталась на уровне исходных значений 4,06±0,04 lgм.к./мл. Как видно из таблицы 5 количество клеток V. cholerae в биопленке на хитине и планктоне над хитином было больше чем в биопленках на пластике и планктоне над пластиком на два и более порядка. Жизнеспособность холерных вибрионов подтверждена бактериологическим методом. Ранее нами было показана интенсивность биопленкообразования V. cholerae на хитине речного рака [12], что вероятно связано с хитинолитическим комплексом, обуславливающим утилизацию хитина, как основного питательного субстрата [18-21].

Обсуждение Таким образом, число клеток холерных вибрионов в биопленках на хитине и пластике нарастает по мере увеличения сроков инкубации. Сравнительные данные количества клеток холерных вибрионов свидетельствуют, что в биопленках на хитине их во много раз больше, чем на пластике и подсчитать их крайне затруднительно. Результаты, полученные бактериологическим методом и методом ПЦР-РВ, воспроизводимы, сопоставимы и при аналогичных разведениях концентрация V. cholerae была идентичной, что свидетельствовало о достоверности результатов ПЦР–РВ метода. Бактериологический метод является «золотым» стандартом в микробиологии при изучении микроорганизмов, в том числе и в составе биопленок холерных вибрионов, в определении их жизнеспособности.

Заключение из-за трудоемкости бактериологического метода и невозможности определить точно концентрацию холерных вибрионов в биопленке на биотических субстратах, предпочтительнее использование молекулярно-генетических методов, позволяющих оценить концентрацию холерных вибрионов в планктоне и биопленке точно и быстро.

 

Источник финансирования

Работа проведена в рамках отраслевой научно-исследовательской программы Роспотребнадзора. Исследование не имело спонсорской поддержки.

Конфликт интересов

Авторы данной статьи подтвердили отсутствие конфликта интересов, о котором необходимо сообщить.

×

References

  1. Okulich VK, Kabanova AA, Plotnikov FV. Mikrobnyye bioplenki v klinicheskoy mikrobiologii i antibakterial′noy terapii. – Vitebsk: VGMU, 2017. – 300 s.: il. ISBN 978-985-466-896-0. (in Russ.)
  2. Opredeleniye kontsentratsii mikrobnykh kletok: Obshchaya farmakopeynaya stat′ya. OFS.1.7.2.000815// Gos.farmakop. Ros.Fed., XIII izd.T.II.- Moskva, 2015-624-636. (in Russ.)
  3. O’Toole GA, Kolter R. Flagellar and twitching motility are necessary for Pseudomonas aeruginosa biofilm development. Mol. Microbiol. 1998; 30(2): 295-304.
  4. Romanova YUM, Gintsburg AL. Bakterial′nyye bioplenki kak yestestvennaya forma sushchestvovaniya bakteriy v okruzhayushchey srede i organizme khozyaina. Zhurn. mikrobiol., epidemiol. i immunobiol. 2011; 3:99-109. (in Russ.)
  5. Augustine N, Peter AW, Kerkar S, Thomas S. Arctic actinomycetes as potential inhibitors of Vibrio cholerae biofilm. Curr. Microbiol. 2012; 64(4):338-342.
  6. Kharseyeva GG, Mironov AYU. Frolova YAN, Labushkina AV Sposobnost′ k formirovaniyu bioplenki vozbuditelem difterii. Klinicheskaya laboratornaya diagnostika. 2013; 2:36-8. (in Russ.)
  7. Tamayor R, Patimalla B, Camilli A. Growth in a Biofilm Induces a Hyperinfectious Phenotype in Vibrio cholera. Infect.immun. 2010; 78:3560-3569. doi: 10.1128/IAI.00048-10
  8. Titova SV, Verkina LM. The modeling of biofilms of comma bacillus on solid surfaces (glass and plastic) and their visualization in light and luminescent microscopes. Klinicheskaya Laboratornaya Diagnostika (Russian Clinical Laboratory Diagnostics) 2016; 61 (4): 238-241. (in Russ.) doi: 10.18821/0869-2084-2016-61-4-238-241
  9. Titova S.V., Kushnareva E.V. Patent RU 8420 № 2559546 ot 10.08.2015 Sposob modelirovaniya obrazovaniya bioplenok kholernykh vibrionov v usloviyakh eksperimenta i ustroystvo dlya yego osushchestvleniya. (in Russ.)
  10. Vodop′yanov SO, Titova SV, Vodop′yanov AS, Verkina LM, Oleynikov IP, Pisanov RV, Lysova LK, Selyanskaya NA, Rykovskaya OA. Izucheniye mezhvidovoy konkurentsii Vibrio cholerae v bioplenkakh. Zhurnal «Zdorov′ye naseleniya i sreda obitaniya». 2017; 3 (288): 51-54. doi: 10.35627/2219-5238/2017-288-3-51-54 (in Russ.)
  11. Vodop′yanov S.O., Vodop′yanov A.S., Men′shikova E.A., Kurbatova E.M., Titova S.V. A method for modeling biofilms formed by Vibrio cholerae O1 serogroup on the surface of chitin. Patent 2685878 Russian Federation, №2685878; 2019.
  12. Men′shikova YeA, Kurbatova YeM, Vodop′yanov SO, Pisanov RV, Titova SV. Otsenka sposobnosti kholernykh vibrionov formirovat′ bioplёnku na poverkhnosti khitinovogo pantsirya rechnogo raka. Zhurnal mikrobiologii, epidemiologii i immunobiologii. 2021;98(4):434–439. DOI: https://doi.org/10.36233/0372-9311-99 (in Russ.)
  13. Huang, J, Zhu Y, Wen H. Quadruplex real-time PCR assay for detection and identification of Vibrio cholerae O1 and O139 strains and determination of their toxigenic potential. Appl. Environ. Microbiology. 2009; 75(22): 6981–6985. doi: 10.1128/IAI.00048-10
  14. Lyon, W.J. TaqMan PCR for detection of Vibrio cholerae O1, O139, non-O1, and non-O139 in pure cultures, raw oysters, and synthetic seawater // Appl. Environ Microbiol. 2001. 67(10). P.4685–4693. doi: 10.1128/AEM.67.10.4685-4693.2001
  15. Vodop′yanov AS, Vodop′yanov SO, Oleynikov IP, Pisanov RV. Vyyavleniye shtammov Vibrio cholerae «gaityanskoy» gruppy s pomoshch′yu polimeraznoy tsepnoy reaktsii na osnove INDEL-tipirovaniya. Zhurnal mikrobiologii, epidemiologii i immunobiologii. 2020; 97(3): 265–270. DOI: https://doi.org/10.36233/0372-9311-2020-97-3-9 (in Russ.)
  16. Khusnutdinova TA, Savochkina YUA, Gushchin AE, Shipitsyna YeV, Savicheva AM. Primeneniye kolichestvennoy mul′tipleksnoy PTSR v real′nom vremeni dlya vyyavleniya vozbuditeley infektsiy mochevyvodyashchikh putey u beremennykh zhenshchin. Pediatr. 2014; 3: 37-41. (in Russ.)
  17. Poleyeva MV, Chemisova OS, Vodop′yanov SO, Men′shikova YeA, Kurbatova YeM. Eksperimental′noye izucheniye osobennostey formirovaniya paragemoliticheskimi vibrionami bioplenki na poverkhnosti bioticheskikh ob′′yektov. Vestnik Permskogo universiteta. 2019; 4: 417-425. doi: 10.17072/1994-9952-2019-4-417-425. (in Russ.)
  18. Hunt DE, Gevers D, Vahora NM, Polz MF. Conservation of the chitin utilization pathway in the Vibrionaceae. Appl. Environ. Microbiol. 2008; 74(1): 44-51. DOI: http://doi.org/10.1128/AEM.01412-07
  19. Stauder M, Vezzulli L, Pezzati E, Repetto B, Pruzzo C. Temperature affects Vibrio cholerae O1 El Tor persistence in the aquatic environment via an enhanced expression of GbpA and MSHA adhesions. Microbiol. Rep. 2010; 2(1): 140-4. DOI: http://doi.org/10.1111/j.1758-2229.2009.00121.x
  20. Markov YeYU, Kulikalova YeS, Urbanovich LYA, Vishnyakov VS, Balakhonov SV. Khitin i produkty yego gidroliza v ekologii Vibrio cholerae (obzor). Biokhimiya. 2015; 80(9): 1334-43. DOI: http://doi.org/10.1134/S0006297915090023 (in Russ.)
  21. Duvanova, OV, Mishan′kin BN, Sorokin VM, Titova SV. Otsenka vliyaniya temperatury kul′tivirovaniya na aktivnost′ N-atsetil- β-D-glyukozaminidazy u kholernykh vibrionov. ZNiSO. 2016; 4:42-44. (in Russ.)
  22. Organizatsiya raboty laboratoriy, ispol′zuyushchikh metody amplifikatsii nukleinovykh kislot pri rabote s materialom, soderzhashchim mikroorganizmy I-IV grupp patogennosti: MU1.3.2569-09. M.: Federal′nyy tsentr gigiyeny i epidemiologii Rospotrebnadzora, 2010. 51 c. (in Russ.)
  23. Rukovodstvo po ekspluatatsii. Amplifikator detektiruyushchiy DTlayt. CHAST′ I. Rabota s priborom. TU 9443-003-96301278-2010. S.50 (in Russ.)
  24. SanPiN 3.3686-21 Sanitarno-epidemiologicheskiye trebovaniya po profilaktike infektsionnykh bolezney. (Postanovleniye Glavnogo sanitarnogo vracha RF ot 28.01.2021 № 4). Dostupno po www. consultant. Ru. (in Russ.)

Supplementary files

There are no supplementary files to display.


Copyright (c) Eco-vector



СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).
Регистрационный номер и дата принятия решения о регистрации СМИ: 014448 от 08.02.1996
СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).
Регистрационный номер и дата принятия решения о регистрации СМИ: серия ЭЛ № ФС 77 - 80652 от 15.03.2021
.


This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies