BACKGROUND: Vibrio cholerae can exist in planktonic and biofilm forms. There are no unified methods for recording the formation of a biofilm and the quantitative determination of microorganisms; the known methods are laborious and do not allow an objective assessment of the concentration of V. cholerae in biofilms.
AIM: This study aimed to evaluate the method for the quantitative determination of V. cholerae in biofilm and planktonic forms based on real-time PCR.
MATERIALS AND METHODS: The concentration of V. cholerae in plankton was determined by the bacteriological method based on the number of colony-forming units per 1 ml; in biofilms, the method of imprint depletion on agar plates was used. Real-time PCR was performed using the primers and probes described in the literature for detecting the hlyA and ctx genes. V. cholerae were quantified using built-in software and standard preparations with a known concentration of bacterial cells. The results were processed in Microsoft Office Excel 2016 spreadsheets using the decimal logarithm; statistical analysis was performed using the Statistica 13.3 program.
RESULTS: During the observation period, the concentration of V. cholerae in biofilms on chitin and plastic increases as the incubation period increases. The amount of V. cholerae in the composition of biofilms and plankton on/above chitin exceeded those when used as a plastic substrate. On the 30th day, the difference was two or more orders of magnitude. The results of the two methods were reproducible and comparable; at the same stages, the concentration of V. cholerae varied within the same order of magnitude, which indicated the reliability of the PCR-RT results.
CONCLUSION: The bacteriological method is informative in the qualitative assessment of biofilms, in determining the viability of cholera vibrios. However, due to its complexity, with the impossibility of quickly determining the concentration of V. cholerae in a biofilm on chitin, it is preferable to use real-time PCR, which allows you to assess the concentration of V. cholerae in plankton and biofilm accurately and quickly.
Обоснование. Холерные вибрионы могут существовать в планктонной и биоплёночной формах. Унифицированных методов, регистрирующих образование биоплёнки и количественное определение микроорганизмов, нет, а известные методы трудоёмки и не позволяют объективно оценить концентрацию холерных вибрионов в биоплёнках.
Цель исследования — оценить метод количественного определения холерных вибрионов в биоплёночной и планктонной формах на основе ПЦР-РВ.
Материалы и методы. Бактериологическим методом концентрацию Vibrio сholerae в планктоне определяли по числу колониеобразующих единиц в 1 мл, в биоплёнках применяли метод истощения отпечатков на пластинах агара. ПЦР-РВ проводили с использованием описанных в литературе праймеров и зондов для выявления генов hlyA и ctx. Холерные вибрионы определяли количественно с использованием встроенного программного обеспечения и стандартных препаратов с известной концентрацией бактериальных клеток. Обработку полученных результатов осуществляли в электронных таблицах Microsoft Office Excel 2016, используя десятичный логарифм, статистический анализ проводили с использованием программы Statistica 13.3.
Результаты. В течение срока наблюдения концентрация холерных вибрионов в биоплёнках на хитине и пластике нарастает по мере увеличения сроков инкубации. Количество V. cholerae в составе биоплёнок и планктона на хитине или над ним превосходило аналогичные показатели при использовании в качестве субстрата пластика. На 30-е сутки разница составила два и более порядка. Результаты двух методов были воспроизводимы, сопоставимы. На одинаковых этапах концентрация V. cholerae варьировала в пределах одного порядка, что свидетельствовало о достоверности результатов ПЦР-РВ.
Заключение. Бактериологический метод информативен при качественной оценке биоплёнок в определении жизнеспособности холерных вибрионов. Однако из-за его трудоёмкости, невозможности быстро определить концентрацию холерных вибрионов в биоплёнке на хитине предпочтительнее использование ПЦР-РВ, которая позволяет оценить концентрацию холерных вибрионов в планктоне и биоплёнке точно и быстро.