LABORATORY DIAGNOSTICS OF PSEUDOTUBERCULOSIS AND INTESTINAL YERSINIOSIS

Full Text

Open Access Open Access
Restricted Access Access granted
Restricted Access Subscription or Fee Access

Abstract

Enteropathogenic species Y. pseudotuberculosis and Y. enterocolitica are of great importance worldwide due to their ability to survive and preserve pathogenic properties in biotic and abiotic environments. They can cause sporadic and flare-up diseases. Therefore, it is extremely important to use modern methods of diagnosing diseases caused by these pathogens.

The article analyzes the methods of laboratory diagnostics of enteropathogenic Yersinia (Yersinia pseudotuberculosis and Y. enterocolitica), including bacteriological, serological and molecular genetic. Modern data on the use of the PCR method, mass spectrometry (МALDI-Tof MS), dot immunoassay (DIA) are presented. The scheme of the optimal protocol for the detection and identification of Yersinia is given.

The combination of classical microbiological and molecular genetic methods quickly determines the presence or absence of a pathogen in a sample, which allows the bacteriological study to be purposefully used to verify the clinical diagnosis, confirm transmission factors and plan anti-epidemic measures.

Full Text

Общие сведения об энтеропатогенных иерсиниях.

Энтеропатогенные иерсинии, относящиеся к семейству Yersiniaceae и роду Yersinia, являются возбудителями псевдотуберкулеза (Y. pseudotuberculosis) и кишечного иерсиниоза (Y. enterocolitica) [1]. Эти два вида имеют широкое распространение во всем мире, особенно в странах с умеренным и холодным климатом. Иерсиниозы проявляются в виде спорадической, групповой заболеваемости и в виде эпидемических вспышек. Преобладающим эпидемиологическим проявлением псевдотуберкулеза является вспышечная заболеваемость. Крупные эпидемические осложнения зарегистрированы в Российской Федерации (Сибирь, Дальний Восток), Японии и Финляндии [2]. Ежегодно в Российской Федерации переболевают (2014-2018 гг.) более 800 тыс. человек, показатель заболеваемости составляет 0,58 на 100 тыс. населения (%ооо).

В отличие от псевдотуберкулеза, кишечный иерсиниоз более широко распространен в мире, а в европейских странах с высокоразвитой индустрией пищевой промышленности занимает третье место после сальмонеллеза и кампилобактериоза, однако чаще всего он выявляется в виде спорадических случаев. Так, заболеваемость во Франции составляет 16,0 на 100 тыс. населения (%ооо), в Европе – 1, 6 %ооо, в США – 0,3 %ооо [3], в России – 1,1 %ооо (2014-2018гг.), однако эти показатели не отражают истинного положения дел. Начиная с 1972 г., в литературе описан ряд эпидемических вспышек кишечного иерсиниоза, зарегистрированных в Японии, США, Индии, Норвегии.

Псевдотуберкулез и кишечный иерсиниоз классифицируются как природноочаговые сапрозоонозы, резервуаром которых служат мелкие млекопитающие (дикие и синантропные грызуны), сельскохозяйственные и домашние животные (крупный рогатый скот, свиньи, собаки, кошки). Механизм передачи энтеропатогенных иерсиний - фекально-оральный, который при псевдотуберкулезе реализуется через загрязненные выделениями грызунов продукты растительного, а при кишечном иерсиниозе − животного происхождения, употребляемых в пищу в сыром или недостаточно термически обработанном виде.

Как психрофильный микроорганизм Yersinia способны размножаться при температуре +4-10°C, накапливаться в продуктах при длительном хранении [4], обусловливая их потенциальную биологическую опасность для человека.

Частота обнаружения патогенных Y. enterocolitica в свином мясе составляет 15,2 %, свиных субпродуктах − 67-83 %, курином мясе − 32,5 %, говяжьем мясе и фарше от 10 до 47 %, в овощных салатах и воде от 3до 15 % [5]. Описаны достоверно установленные факторы передачи Y. enterocolitica на вспышках: молочный шоколадный напиток [6], молоко, соевый сыр тофу [7], вода, пахта [8], свиное мясо [9].

В России, в период неблагоприятной эпидситуации на Дальнем Востоке, выявлен высокий процент инфицированности Y. pseudotuberculosis сырых овощей: капусты – 37,5 %, репчатого лука – 26,7 %, моркови – 30,9 %, причем возбудитель накапливался на овощах при их хранении с осени до зимы [10]. Показано, что заражение детей псевдотуберкулезом в 75,6 % осуществлялось именно через свежие овощи, употребляемые в виде овощного салата и винегрета, в состав которых чаще всего входила белокочанная капуста и (или) репчатый лук. Несмотря на преобладающее выделение псевдотуберкулезного микроба с овощей и корнеплодов, исследованиями, проведенными в Эстонии, Латвии и Ленинградской области в период с 2004-2007 гг., выявлено от 1,5% до 7 % инфицированных Y. pseudotuberculosis О:3 серовара свиней, что указывало на наличие дополнительного резервуара возбудителя псевдотуберкулезной инфекции [11].

Вид Y. pseudotuberculosis биохимически однороден. Однако установлено, что западноевропейские изоляты возбудителя (Евразия, Северная и Южная Америка, Австралия) не ферментируют мелибиозу, в то время как азиатские штаммы, выделенные в Японии и России, ферментируют указанный дисахарид. В настоящее время известно, что из 21 серологического варианта Y. pseudotuberculosis одиннадцать сероваров – О:1а, О:1b, О:1с, О:2а, О:2b, О:2с, О:3, О:4а, О:4b, О:5а, О:5b - имеют значение в патологии человека, а остальные - О:6, О:7, О:8, О:9, О:10, О:11, О:12, О:13, О:14, О:15 - выделяются только от мелких млекопитающих и из объектов окружающей среды и никогда не обнаруживаются у больных, в связи с чем эти серовары, по-видимому, могут быть отнесены к сапрофитным формам Y. pseudotuberculosis [12].

Установлена генетическая неоднородность штаммов Y. pseudotuberculosis, изолированных на территориях Северо-западного, Сибирского и Дальневосточного регионов России, а также Японии и стран Европы по наличию суперантигена YPMa, «острова высокой патогенности» НPI, пилей адгезии YAPI и плазмиды pVM 82 MDa, что определяет форму заболевания по тяжести клинического течения с определенным симптомокомплексом [12].

Вид Y. enterocolitica классифицируется по шести биохимическим типам (1А, 1В, 2, 3, 4, 5), различающимся по ферментации трегалозы, ксилозы, эскулину/салицину, наличию индола и липазы. Патогенный потенциал возбудителя неоднороден. Y. enterocolitica биотипов 1В, 2-5 являются патогенными, в них всегда обнаруживаются ген термостабильного энтеротоксина ystА, плазмида вирулентности pYV 42-47 MDа и ген адгезии-инвазии ail. До сих пор нет однозначного мнения о патогенности Y. enterocolitica 1А биотипа. Несмотря на то, что этот микроорганизм не имеет вышеперечисленных маркеров вирулентности, некоторые штаммы Y. enterocolitica биотипа 1А способны вызывать случаи диареи у людей и даже небольшие вспышки. Нами показано, что у 81,3 % штаммов Y. enterocolitica 1А присутствует ген ystB термостабильного токсина YSTb, в том числе и у всех штаммов, изолированных от больных с выраженной клинической симптоматикой энтерита и энтероколита. Биотипы Y. enterocolitica включают в себя 34 серологических группы, однако заболевание человека вызывают ограниченное число штаммов, относящихся к патогенным Y. enterocolitica серотипам/биотипам – О:3/4; О:3/3; О:5, 27/2; О:8/1b, О:9/2 и О:13. В исследованиях ряда авторов показана географическая неоднородность циркуляции патогенных кишечных иерсиний. Самым распространенным серотипом в странах Европы (90 %) является О:3 и О:9, в Японии – О:3/3 [12], в США – О:8/1b, О:3/4 и О:5, 27/2, в Сибири и на Дальнем Востоке РФ – О:3 (0,41-5,84 %).

Лабораторная диагностика энтеропатогенных иерсиний.

Для обнаружения Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica в настоящее время используются культуральные, серологические и молекулярно-генетические методы. Культуральный (бактериологический) метод является «золотым стандартом», поскольку позволяет выделить чистую культуру и изучить ее биологические и молекулярно-генетические свойства. Метод включает ряд процедур: 1) забор материала, транспортировку и прямой посев; 2) селективное обогащение на жидких питательных среда, или «холодовое обогащение» и «щелочную обработку»; 3) выделение «чистой культуры» на дифференциально-диагностических средах; 4) идентификацию и дифференциацию изолятов с использованием биохимических, серологических и молекулярно-генетических тестов.

Забор материала, транспортировка и прямой посев. Биологический материал, пробы пищевых продуктов и образцы объектов окружающей среды отбираются согласно стандартным микробиологическим процедурам в герметические контейнеры с забуференным физиологическим раствором (рН 7,6) (ЗФР) в соотношении 1:10. Вид исследуемого материала, его количество, сроки и правила взятия материала регламентируются нормативно-методическим документом (в России МУ 4.2.3019-12). Эффективность изоляции иерсиний повышается при увеличении объема и количества отобранных проб, фильтровании образцов воды через мембранные фильтры.

Прямой высев исследуемого материала обычно малоэффективен из-за обильного роста посторонней микрофлоры, хотя может иметь положительный эффект при исследовании копрофильтратов больных во время фазы острого гастроэнтерита при кишечном иерсиниозе [13], при исследовании паренхиматозных органов.

Селективное обогащение на жидких питательных средах. В качестве сред накопления используют ЗФР, 1% забуференную пептонную воду, буферно-казеиново-дрожжевую (БКД) и пептонно-калиевую среды (ПК). Последняя превосходит среду БКД по частоте выделения и скорости накопления иерсиний и хорошо себя зарекомендовала при исследовании не только материала от больных, но и пищевых продуктов, воды и объектов окружающей среды. По данным зарубежных авторов, для ускорения процесса роста микроорганизмов в забуференный пептонный раствор добавляют сорбитол/ маннит (1%) и соли желчных кислот (0,15 %) (PSB).

  Повышения селективности сред некоторые исследователи добивались применением специальных добавок к бульонам и высокую температуру инкубации. В частности, бульон с иpгазаном, тетрациклином и хлоратом натрия (среда ITC), модифицированный бульон Раппопорт с малахитовой зеленью, карбенициллином и хлоридом натрия (среда MRB) использовали специально для изоляции Y. enterocolitica О:3/4 в пищевых продуктах, термостатируя исследуемый материал при 25-30 °С в течение 2-4 дней [14, 15]. Среда с полимиксином и новобиоцином (среда TSB) при инкубации в течение трех дней при 18 °С применялась для изоляции Y. enterocolitica О:3 из молока [16]. Использование среды с содержанием желчи, оксалатов и сорбозы (BOS) увеличивало высеваемость Y. enterocolitica 1B/О:8 из клинического материала [17, 18]. Fukushuma H. et al. (1995) для селективного выделения Y. pseudotuberculosis и патогенных Y. enterocolitica из проб воды предлагали использовать клетки HeLa, способные адгезировать на своей поверхности патогенные иерсинии, а Koujitani et al. (2006) [19] для изоляции Y. enterocolitica О:8 − применять метод иммуномагнитного разделения с антииерсиниозными антителами.

«Холодовое обогащение» и «щелочная обработка». В связи с уникальной возможностью Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica размножаться в условиях низких температур на минимальных средах J.S. Peterson и R.A. Cook (1963) предложили для выделения возбудителя использовать метод «холодового обогащения», при котором исследуемый материал выдерживается в накопительной среде в холодильнике при +4-10К насто°С от 8 дней до 3-х недель с периодическими высевами на плотные питательные среды на 3-и, 7-е, 14-е (материал от больных) и 21-е сутки (материал из объектов окружающей среды), что позволяет повысить высеваемость иерсиний [20]. Недостатком данного метода служит значительное размножение непатогенных Y. enterocolitica и других психрофильных микроорганизмов в течение длительного 21-дневного инкубационного периода, что затрудняет изоляцию энтеропатогенных иерсиний. В связи с этим Aulisio et al. (1980) и Fukushuma (1985) [21] предлагают непосредственно перед высевом проводить «щелочную обработку» проб, при которой, в виду резистентности Yesinia к щелочи, можно избавиться от посторонней микрофлоры. «Щелочная обработка» проводится с третьего дня «холодового обогащения» путем смешивания 0,5 мл исследуемого материала с 0,5 мл 0,72 % КОН на 0,54 % NaCl в течение 30 сек, в результате чего подавляется рост микроорганизмов, таких как Pseudomonas, Proteus, Serratia.

Выделение «чистой культуры» на дифференциально-диагностических средах.        Для изоляции Y. enterocolitica за рубежом широко используют питательные среды: агар Мак-Конки (Mak Conky agar base), цефсулодин-иргазан-новобиоциновая среда (СIN агар, Difco, Oxoid) и Salmonella-Shigella дезоксихолатный агар (SSDC), которые включены в протоколы International Organization for Standardization (ISO 10273:2003), Nordic Committee on Food Analysis (NCFA 117: 1996) и Food and Drug Administration (FDA 2007) [15]. Для дифференциации патогенных и авирулентных Y. enterocolitica применяют СIN агар, содержащий 0,1 % эфирных масел и 0,05 % цитрата железа (VYE агар) [22] или хромогенную среду с целлобиозой (YeCM) [23]. Что касается Y. pseudotuberculosis, то наиболее приемлемой питательной средой считают СIN агар и среда Мак-Конки.

В России в качестве дифференциально-диагностических сред применяют среду Эндо, однако работа с этой средой требует высокого профессионализма бактериолога в виду обильного роста посторонней микрофлоры и затруднения дифференциации колоний иерсиний от других энтеробактерий, поэтому исследуемый материал рекомендуется подвергать «щелочной обработке». Отдельными отечественными авторами проводились исследования по усовершенствованию питательных сред с целью ускорения скорости роста и возможности дифференциации иерсиний, в первую очередь Y. pseudotuberculosis от других бактерий, так как именно этот возбудитель с конца 60-х годов на Дальнем Востоке вызывал массовые эпидемические осложнения. С 1998 г. осуществляется промышленный выпуск среды СБТС (Питательная среда для выделения возбудителей кишечного иерсиниоза и псевдотуберкулеза, сухая, производства ГНЦПМ п. Оболенск), входящей в российский стандарт лабораторной диагностики иерсиниозов МУ 4.2.3019-12 .    Результативность бактериологического метода зависит от интенсивности эпидемического процесса, периода заболевания, исследуемого биологического субстрата и применяемых питательных сред. Культуры Y. pseudotuberculosis чаще (55,4±6,6 %) выделяли в период вспышек, в сравнении со спорадическими случаями заболевания (7,5±2,0 %) [10].  Значительно легче удавалось изолировать возбудителя от больных и носителей (например, свиней), чем из объектов окружающей среды и пищевых продуктов, поскольку при инфекционном процессе возбудитель псевдотуберкулеза является доминирующим [15]. Максимальное число изолятов регистрировалось при исследовании копрофильтратов в течение всего периода болезни [24]. Fukushuma et al. (1985) [22] показали, что выделение возбудителя через кишечник отмечалось в течение 10-14 дней в количестве 105-108 м.к./г, затем высеваемость патогена снижалась до 104-106 м.к./г, на 28-30-й дни болезни микроорганизм обнаруживался в копрофильтрате в количестве 102 м.к./г. бактериологическое исследование сывороток крови целесообразно проводить только в период лихорадки. Ценева Г. Я. и соавторы (1993)  показали, что при параллельном высеве материала от больных псевдотуберкулезом и ОКЗ на среды Серова, Эндо, Мак-Конки и дезоксихолатный агар, преимущество по выделению иерсиний имеют среда Мак-Конки (4,7 %) и дезоксихолатный агар (5,2 %), менее эффективны среды Серова (3,8 %) и Эндо (3,3 %). По данным этих авторов при исследовании копрофильтратов больных частота выделения Y. pseudotuberculosis на среде с бромтимоловым синим составила 27,2 %, тонких кишечников мелких млекопитающих − 5,6 %. Высеваемость возбудителя на указанной среде со смывов с объектов окружающей среды, по данным М.В. Чесноковой и соавторов (1993), – 0,9 % [10]. Изоляция Y. enterocolitica из свиных миндалин на CIN агаре установлена в пределах 27,5 % - 65,2 %, на среде Мак-Конки − 42,3 %, исследование свиного мяса на CIN агаре дало положительный результат в 3,9 % случаях [15, 25].

        Идентификация и дифференциация «чистых культур» иерсиний.            Yersinia spp. – полиморфные грамотрицательные палочки, при росте на плотных питательных средах обладают типичной морфологией. Оксидазонегативные и уреазоположительные колонии идентифицируют по набору биохимических тестов, основными из которых являются ферментативная активность (сахароза, рамноза, раффиноза, мелибиоза), подвижность, реакция Фогес-Проскауэра, декарбоксилирование аминокислот (орнитиндекарбоксилаза), дезаминирование фенилаланина и индолообразование. Предложенные тесты позволяют в комплексе четко провести идентификацию и дифференциацию видов иерсиний (табл. 1).

        Описаны случаи выделения штаммов Y. enterocolitica с отрицательной реакцией Фогес-Проскауэра и/или не ферментирующие сахарозу [25], а также мелибиоза-негативные штаммы Y. pseudotuberculosis [12]. Установлены трудности дифференциации Y. pseudotuberculosis от штаммов Y. similis и Y. pekkanenii в связи с аналогичными результатами биохимических тестов [26]. В этом случае идентификация может быть проведена с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) или методом ДНК-ДНК гибридизации. Традиционно для идентификации Y. pseudotuberculosis и дифференциации его от других энтеробактерий применяют псевдотуберкулезный бактериофаг. Однако в ряде случаев отмечается отсутствие фаголизиса свежевыделенных штаммов Y. pseudotuberculosis на питательных средах с повышенным содержанием NaCl (0,6-0,7 %). Наиболее высокая чувствительность псевдотуберкулезного микроба к специфическому бактериофагу (93,7 %) отмечена на среде с содержанием 0,3 % NaCl и наличием фосфатно-щелочной буферной системы.

 

 

Таблица 1.

Основные биохимические свойства бактерий рода Yersinia (26±2)0С

Main biochemical characteristics of bacteria of the Yersinia species (26±2)0С

Тест или субстрат

Y. pestis

Y.pseudo-

tuberculosis

Y. enterocolitica

Y. frederiksenii

Y. intermedia

Y. kristensenii

Y. ruckeri

Y. aldovae

Y. rohdei

Y. mollaretti

Y. bercovieri

Y. aleksiciae

Y.wautersii

Биотипы

I

 

 

 

 

II

 

III

 

IV

 

V

IA

IB

Гидролиз мочевины

-

-

+

+

+

+

+

+

+

[+]

[+]

[+]

-

[+]

B

[-]

B

+

+

Образование индола

-

-

-

+

+

B

-

-

-

+

+

B

-

-

-

-

-

+

-

Подвижность (22±2)0С

(22±2)0С

-

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

B

+

+

+

+

+

+

(37±1)0С 0С

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

Реакцияя Фогеса-Проскауэра

(26±2)0С

-

-

+

+

+

+

+

+

+

+

-

-

+

-

-

-

-

-

(37±1)0С 0С

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

Фенилаланиндезаминаза

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

Орнитиндекарбоксилаза

-

-

+

+

+

+

+

В

+

+

+

+

В

[-]

[+]

[+]

+

-

Лизиндекарбоксилаза

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

B

-

-

-

-

+

-

Липаза (Твин-80)

-

-

+

+

-

-

-

-

В

В

В

В

-

-

-

-

-

-

Цитрат Симмонса

-

-

-

-

-

-

-

-

B

+

-

+

+

-

-

-

-

-

Гидролиз  эскулина

B

+

[+]

-

-

-

-

-

[+]

+

-

-

-

-

-

[-]

-

+

Образование кислоты из:

 

 

 

D-ксилозы

+

+

+

+

+

+

-

B

+

+

[+]

-

B

B

B

+

+

+

мальтозы

[+]

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

-

-

B

+

+

+

мелибиозы

[-]

В

-

-

-

-

-

-

-

[+]

-

-

-

В

-

-

-

-

L-рамнозы

-

B

-

-

-

-

-

-

+

+

-

-

-

-

-

-

-

+

раффинозы

-

[-]

-

-

-

-

-

-

В

В

-

-

-

В

-

-

-

+

салицина

B

[-]

+

-

-

-

-

-

+

+

[-]

-

-

-

[-]

[-]

-

-

сахарозы

-

-

+

+

+

+

+

B

+

+

-

-

[-]

+

+

+

-

-

D-сорбитола

B

-

+

+

+

+

+

-

+

+

+

B

B

+

+

+

+

-

трегалозы

+

+

+

+

+

+

+

-

+

+

+

+

[+]

+

+

+

+

+

«+» – положительная реакция у 90 % и более штаммов; «[+]» – положительная реакция у 76-89 % штаммов; «В» – положительная реакция у 26-75 % штаммов; «[-]» – положительная реакция у 11-25 % штаммов; «-» – отрицательная реакция у 90 % и более штаммов.

«+» – positive reaction with more 90% of strains; «[+]» – positive reaction with 76-89 % of strains; «В» – positive reaction with 26-75 % of strains; «[-]» – positive reaction with 11-25 % of strains; «-» – negative reaction with more 90 % of strains.

 

        В качестве экспрессных методов идентификации микроорганизмов все большее применение находят АPI-тест-системы и биохимические автоматизированные анализаторы. Показано, что при исследовании 105 клинических изолятов Yersinia spp., инкубированных при 28°С, процент совпадений пробирочных биохимических тестов с идентификацией в тест-системе АPI 20Е составил 93 %. Исследование 212 изолятов 10 видов Yersinia с помощью автоматизированной системы для биохимической идентификации Vitek GNI позволило подтвердить правильность идентификации до рода в 96,3 %, до вида − у 57,4 % изолятов от входящих в базу данных Vitek GNI [27, 28].  

         Био-и серотипирование иерсиний.         Биотипирование Y. enterocolitica определяют с помощью обычных биохимических тестов, представленных в таблице 2.

Таблица 2

Биотипирование Yersinia enterocolitica (28ºС – 24 ч.)

Biotyping of Yersinia enterocolitica (28ºС – 24 h)

Реакция

Биотипы

2

3

4

5

Салицин

+

-

-

-

-

-

Лецитиназа

(липаза)

+

+

-

-

-

-

Индол

+

+

+

-

-

-

Ксилоза

+

+

+

+

-

-

Трегалоза

+

+

+

+

+

-

 

Серологическое типирование изолятов, связанных с заболеваниями человека, проводят с помощью реакции агглютинации на стекле с использованием коммерческих типоспецифических О-антисывороток к наиболее распространенным серотипам О:3, О:5, О:9 и О:8 для Y. enterocolitica («Denka Seiken», Токио, Япония) и О:1-О:6 для Y. pseudotuberculosis («Denka Seiken») [20]. В России эти сыворотки выпускает Санкт-Петербургский институт им. Пастера. Альтернативным серотипированию Y. pseudotuberculosis методом считается О-генотипирование 21 сероварианта этого возбудителя с использованием схемы на основе ПЦР [29].

         Изучение патогенности иерсиний.        Для оценки патогенности необходимо учитывать, что все Y. pseudotuberculosis, но не все Y. enterocolitica, считаются потенциально патогенными. В связи с этим определение маркеров вирулентности позволяет провести дифференциацию вирулентных Y. enterocolitica, имеющих эпидемиологическое значение, от авирулентных. Вирулентные иерсинии содержат родоспецифическую плазмиду вирулентности pYV 42-48 МDа, кодирующую белки наружной мембраны Yad А, способствующие адгезии и инвазии бактерий, а также белки Yops, которые участвуют в подавлении фагоцитарной активности клеток иммунной системы хозяина, размножении бактерий в пейеровых бляшках и лимфоидной ткани. Плазмида pYV 42-48 МDа имеется у всех свежевыделенных штаммов Y. pseudotuberculosis и у Y. enterocolitica, относящихся к биотипам 1В-5. Наличие плазмиды ассоциируется с выявлением маркеров патогенности: аутоагглютинацией на бульоне Хоттингера при 35-37 °С [30], ограниченным ростом на средах с дефицитом кальция при 35-37 °С и связыванием конго красного или кристаллического фиолетового при 35-37 °С[31]; способностью вызывать гнойный кератоконьюктивит у морских свинок (тест Sereny) через 48-72 часа после инфицирования глаз [32], летальностью для биопробных мышей при оральном, внутрибрюшинном или внутривенном путях заражения. Для оценки вирулентных свойств иерсиний представляет интерес пиразинаминазный тест, позволяющий по отсутствию пиразин-карбоксилазной активности дифференцировать патогенные Y. enterocolitica. Вместе с тем, в практических лабораториях для выявления белков наружной мембраны (Yad А), детерминированных плазмидой pYV, используется реакция агглютинации на стекле с диагностической сывороткой к вирулентным иерсиниям – СВИ, выпускаемой НИИЭМ им. Пастера.

       Экспресс-методы индикации и идентификации иерсиний.   В 80-90-е годы в Российской Федерации проводились широкие научные исследования по разработке и апробации ряда диагностических тест-систем: гемагглютинационных (РНГА, РТНГА), агглютинационных (реакции коагглютинции и латекс-агглютинации) и твердофазных иммунохимических (иммуноферментный анализ - ИФА), обладающих определенной эффективностью, но не нашедших широкого практического применения в виду отсутствия сертифицированных тест-систем.

        В настоящее время для экспрессного выявления и последующей идентификации возбудителей энтеропатогенных иерсиний используются метод флюоресцирующих антител (МФА) и ПЦР. Чувствительность МФА составляет 105-106 м.к./мл, время постановки − 1,5-2 ч. Оптимальные сроки исследования всех видов материала от больных − первые 3-5 дней болезни, трупов мелких млекопитающих − первые часы после гибели, смывов из объектов окружающей среды − по эпидпоказаниям. Для проведения анализа необходимо иметь люминесцентный микроскоп и «Иммуноглобулины диагностические псевдотуберкулезные люминесцирующие» производства РосНИПЧИ “Микроб”, Саратов.

        ПЦР − быстрому и надежному методу обнаружения энтеропатогенных иерсиний в клиническом материале, пищевых продуктах и в воде [33, 34] отводится первостепенное значение, поскольку данный метод отличается высокой чувствительностью (102-103 м.к./мл), специфичностью и экспрессностью (5-6 часов).

ПЦР позволяет выявлять специфические генетические детерминанты патогенности иерсиний. Все вирулентные энтеропатогенные иерсинии содержат гены virF и yadA, локализованные на плазмиде [35]. Существенным хромосомным фактором вирулентности для Y. pseudotuberculosis служит ген инвазивности inv [36], ail [37] или lcrF, для Y. enterocolitica гены ail [38], энтеротоксин ystA и rfbC [39].

Используя мишеневые гены, в настоящее время разработаны несколько вариантов ПЦР для детекции Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica в клиническом материале, объектах окружающей среды, пищевых продуктах: однопраймерная ПЦР с электрофоретической детекцией продуктов амплификации [40], nested PCR [41], real-time ПЦР (ТaqMan и SYBR green) [37, 42], мультиплексная real-time ПЦР с одновременной детекцией в одной пробирке двух патогенов (Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica) [42, 43]. Real-time ПЦР (Tag-man, SYBR-green) наиболее предпочтительна из-за более быстрого получения ответа, отсутствия ряда этапов обработки и подготовки проб с целью их концентрирования и т. д. Этот метод позволяет не только идентифицировать возбудителя, но и определять его количество в пробе. При реализации мультиплексной ПЦР с использованием комбинации праймеров на плазмидные и хромосомные гены следует учитывать возможность одновременного обнаружения в материале энтеропатогенных иерсиний, имеющих и не имеющих плазмиду pYV (pYV+ и pYV-). Элиминация этой плазмиды легко происходит на питательных средах под влиянием антибиотиков (новобиоцина) и повышения температуры инкубирования до 37оС. Wannet W.J.B. et al. [40] предложили использовать праймеры на ген 16S РНК, определяющий видоспецифичность Y. enterocolitica, и на ген ail, определяющий механизм прикрепления-инвазии микроба к клеткам лимфоидной ткани тонкого кишечника. Мультиплексная ПЦР в таком варианте определяет как патогенные Y. enterocolitica (ампликоны 425 н.п. для ail и 330 н.п. для 16S РНК), так и непатогенные – один ампликон размером 330 н.п. для гена 16S РНК.

Несмотря на то, что чувствительность ПЦР-метода исключительно высока при анализе чистых культур, она снижается при исследовании проб из объектов окружающей среды, клинического материала, пищевых продуктов, кроме того, возможна регистрация ложно отрицательных результатов при наличии в образце ингибиторов реакции (биологические агенты деградации тканей, ферменты, полисахариды и другие компонентами исследуемого материала) [44]. Поэтому для успешной ПЦР-диагностики обязательным условием является предварительная подготовка материала, направленная на получение тотальной ДНК и удаление или нейтрализацию ингибиторов.

Пробоподготовка может включать обогащение, разбавление, фильтрацию, центрифугирование, адсорбцию, седиментацию, флотацию анализируемого материала. Обогащение используется всегда на первом этапе обработки пробы для увеличения количества живых иерсиний. Испражнения, образцы пищевых продуктов, почвы необходимо суспендировать в забуференном физиологическом растворе или жидких средах для уменьшения действия ингибиторов и ДНК фоновых микроорганизмов. Центрифугирование на малых оборотах обычно используют для удаления грубых частиц (матрикса) пищевых продуктов, испражнений, почвы и т.п., тогда как высокоскоростное (> 5000 об/мин) − необходимо для концентрации живых клеток и удаления ингибиторных компонентов. Фильтрация может быть использована для концентрации энтеропатогенных иерсиний из водных образцов. Для подготовки проб испражнений и смывов с объектов окружающей среды разработан способ, основанный на использовании «щелочной обработки материала», при которой большая часть индигенной микрофлоры погибает и удаляется в виде супернатанта при центрифигировании, а относительно устойчивые к щелочи иерсинии выживают. При исследовании бактериальных взвесей чаще всего используется ДНК-экстракция образца в форме простого прогревания при 100 °С. В литературе описаны методы пробоподготовки крови, мочи, воды, почвы [36], основанные на лизисе бактериальных клеток (обычно в растворе 7М гуанидинизотиоционата или 2% растворе натрия додецилсульфата), с последующей сорбцией ДНК на носителе (суспензия SiO2), отмывкой от ингибирующих компонентов и элюцией ДНК. Выпускаемые в России коммерческие наборы «ДНК-сорб-В» (фирма «Амплисенс» г. Москва), наборы для выделения ДНК ООО «Лаборатория Медиген» (г. Новосибирск), работают по этому принципу и позволяют получать препарат ДНК микроорганизмов из различных субстратов высокой степени чистоты, пригодный не только для ПЦР, но и для других молекулярно-генетических манипуляций.

 Fukushima H. et al. (2011) [20] приводят типовой протокол для быстрого разделения и концентрации патогенных микроорганизмов в образцах пищевых продуктов с использованием фильтрации, центрифугирования в градиенте плавучей плотности. Показано, что такая пробоподготовка приводит к концентрации микробной массы в 250 раз в течение 2-х часов.

В России для постановки ПЦР используют тест-систему «Амплисенс® Yersinia pseudotuberculosis/Yersinia enterocolitica- FL» вариант с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени» (производства ФГУН ЦНИИ эпидемиологии, Москва).

Накоплен опыт по конструированию тест-систем для дот-иммуноанализа (ДИА) на основе антител, меченых наночастицами коллоидных металлов, в частности, золота и серебра для экспресс-детекции возбудителя псевдотуберкулеза. ДИА имеет достаточно выигрышные позиции: простота постановки, миниатюризация (объем исследуемых образцов – 1 мкл), экспрессность (общее время проведения анализа ~ 2 ч), отсутствие потребности в ридерах и других дорогостоящих приборах, достаточно высокая специфичность и чувствительность (сравнимая по своей эффективности с ПЦР) делают его перспективным методом индикации Y.pseudotuberculosis, особенно в режиме чрезвычайных ситуации.

Использование времяпролетной масс-спектрометрии с матрично-активированной лазерной десорбцией-ионизацией (МALDI-TOF MS), позволяющей провести индикацию и идентификацию возбудителя в течение нескольких минут после внесения образца в рабочую зону прибора. Сущность метода заключается в сравнении специфических белковых спектров (прямое белковое профилирование) подозрительных колоний со спектрами возбудителей из баз данных [45].

На основе многолетних мониторинговых исследований нами предлагается унифицированный алгоритм лабораторного исследования на энтеропатогенные иерсинии с учетом использования ПЦР и масс-спектрометрии. Работу целесообразно проводить по оптимизированной нами схеме: холодовое обогащение материала при +4 – (+ 6) °С в течение 2-7 дней; использование метода real-time ПЦР с сертифицированным набором «Ампли-Сенс Y. enterocolitica/pseudotuberculosis - FL» с гибридизационно-флуоресцентной детекцией; посев на среду с бромтимоловым синим (БТС) с инкубацией в течение 48 ч при +37 °С с последующим визуальным отбором характерных колоний для детекции на MALDI-TOF MS. В случае положительного результата на Yersinia рекомендуется проводить посев на КД-агар с инкубацией в течение 24 ч при +28 °С, проведение дифференциально-диагностических тестов и расширенной идентификации выделенных штаммов: ПЦР О-серогенотипирование Y. pseudotuberculosis; определение факторов патогенности Y. pseudotuberculosis (inv, HPI,YAPI, pYV, ypm) и Y. enterocolitica (ail, yst A, yst B); био- и серотипирование Y. enterocolitica; изучение плазмидного спектра штаммов; генотипирование выделенных штаммов (VNTR,  PFGA, секвенирование и др.). При положительной ПЦР и отрицательных результатах бактериологического исследования необходимо проведение второго (на 2-3 сутки), а в некоторых случаях - третьего высевов (на 5-7 сутки). При двукратном отрицательном анализе ПЦР дальнейшее бактериологическое исследование нецелесообразно. Предложенный алгоритм лабораторной диагностики позволяет увеличить частоту и спектр выделения патогенных иерсиний при проведении микробиологического мониторинга природных и антропургических очагов иерсиниозов в системе эпидемиологического надзора. Проведение ПЦР на этапе экспресс-индикации/идентификации подозрительных колоний позволяет проводить типирование микроба по основным генным детерминантам (серотип, способность к адгезии-инвазии, наличие генов суперантигена энтеротоксинов, островов патогенности) (рис.).  

Заключение.

Энтеропатогенные виды Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica являются объектом интенсивного изучения в лабораториях мира и России в связи с их удивительной пластичностью выживания и сохранением патогенных свойств в биотической и абиотической окружающей среде, эпидемически неожиданным проявлением заболеваний спорадического и вспышечного характера. В последние годы лабораторная диагностика иерсиний претерпела существенные изменения: в практику внедрены высокоспецифичный и чувствительный ПЦР-анализ, позволяющий в течение нескольких часов обнаруживать патогенные иерсинии; массспектометрия, являясь эффективным методом ускоренной идентификации выделенных микроорганизмов, сокращает сроки определения их таксономической принадлежности. Сочетание классического микробиологического и молекулярно-генетического методов оперативно определяет наличие или отсутствие патогена в образце, что позволяет целенаправленно использовать бактериологическое исследование для выделения культуры для верификации клинического диагноза, подтверждения факторов передачи и планирования противоэпидемических мероприятий.

 

 

Посев на питательные среды

(2-3 сут., 5-7 сут., 10, 21 сут.

Экспресс-индикация

(1 сут.; 2-3 сут.)

Исследуемый образец

 

 

Био- и серотипирование Y. enterocolitica

ПЦР, DIA

Экспресс-идентификация

Перевод в жидкую фазу

                                          

Масс-спектрометрия

Концентрирование

МФА

ПЦР, DIA

 

 

 

+

+

Щелочная обработка

-

                       

Y. ent

Y. pstbc

-

+

+

Y. pstbc

Бактериологический анализ

Y.ent

Y.pstbc

Y.ent

Y.pstbcсc

Y. pstbc

Y. ent

ПЦР О-серогенотипирование Y. pseudotuberculosis

 

 

Наличие факторов патогенности Y. pseudotuberculosis (ПЦР): inv, HPI,YAPI, pYV, ypm A/C

 

 

 

 

 

 

 

Наличие факторов патогенности Y. enterocolitica (ПЦР):  ail, yst A, yst B

 

Плазмидный профиль, VNTR, PFGE, секвенирование и др.

 

 

 

 

Рисунок  – Схема выявления и идентификации энтеропатогенных иерсиний

Figure 1– Scheme of Yersinia’s detection and identification

 

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Источник финансирования. Поисково-аналитическая работа проведена на личные средства авторского коллектива.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с проведенным исследованием и публикацией настоящей статьи.

Вклад авторов. Наибольший вклад распределён следующим образом: Чеснокова М.В. – дизайн научного обзора, анализ литературы, написание обзорной статьи; Климов В.Т. – поисково-аналитическая работа при написании обзорной статьи,  написание раздела «Изучение патогенности иерсиний», «Экспресс-методы индикации и идентификации иерсиний»; редактирование текста статьи; Каримова Т.В. – анализ литературы; Загоскина Т.Ю. – анализ и обобщение данных литературы, доработка рукописи, направление статьи на публикацию; Панин А.Л. – сбор литературных источников, редактирование статьи.

Все авторы подтверждают соответствие своего авторства международным критериям ICMJE (все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции, проведение поисково-аналитической работы и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией).

 

ADDITIONAL INFORMATION

Funding source. This study was not supported by any external sources of funding

Competing interests. The authors declare that they have no competing interests.

Author contribution. M.V. Chesnokova – design of the scientific review, the literature analyzing, writing a review article; V.T.Klimov – search and analytical work when writing a review article, writing the section «Studying the pathogenicity of Yersinia», «Express methods for Yersinia’s indicating and identifying »; editing the text of the article; Karimova T.V. – literature analysis; Zagoskina T.Yu. – analysis and generalization of literature data, revision of the manuscript, submission of the article for publication; Panin A.L. – collection of literary sources, editing of the article. All authors made a substantial contribution  to  the  conception  of  the  work,  acquisition,  analysis,  interpretation  of  data for the work, drafting and revising the work, final approval of the version  to  be  published  and  agree  to  be  accountable  for  all  aspects  of  the  work.

×

About the authors

Margaret Chesnokova

Author for correspondence.
Email: mar_chumin@mail.ru

References

Supplementary files

There are no supplementary files to display.


Copyright (c) Eco-vector



Свидетельство о регистрации СМИ № 014448 от 08.02.1996 г. выдано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор). 
Свидетельство о регистрации СМИ ЭЛ № ФС 77 - 80652 от 15.03.2021 г. выдано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).


This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies