Laboratory diagnosis of Yersinia pseudotuberculosis and Yersinia enterocolitica

Full Text

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ ОБ ЭНТЕРОПАТОГЕННЫХ ИЕРСИНИЯХ

Энтеропатогенные иерсинии, относящиеся к семейству Yersiniaceae и роду Yersinia, являются возбудителями псевдотуберкулёза (Yersinia pseudotuberculosis) и кишечного иерсиниоза (Yersinia enterocolitica) [1]. Эти два вида имеют широкое распространение во всём мире, особенно в странах с умеренным и холодным климатом. Иерсиниозы проявляются в виде спорадической, групповой заболеваемости или эпидемических вспышек. Эпидемиология псевдотуберкулёза характеризуется вспышечной заболеваемостью, из них наиболее крупные зарегистрированы в Российской Федерации (Сибирь, Дальний Восток), Японии и Финляндии [2]. Ежегодно в Российской Федерации фиксируется более 800 тыс. случаев заражения, показатель заболеваемости составляет 0,58 на 100 тыс. населения (в промилле, ‰).

В отличие от псевдотуберкулёза, кишечный иерсиниоз более широко распространён в мире, а в европейских странах с высокоразвитой пищевой индустрией занимает третье место после сальмонеллёза и кампилобактериоза, однако чаще всего выявляется в виде спорадических случаев. Так, заболеваемость во Франции составляет 16,0‰ на 100 тыс. населения, в Европе ― 1,6‰, в США ― 0,3‰ [3], в России ― 1,1‰ (данные 2014−2018 гг.), однако эти показатели не отражают истинного положения дел. Начиная с 1972 года в литературе описан ряд эпидемических вспышек кишечного иерсиниоза, зарегистрированных в Японии, США, Индии, Норвегии.

Псевдотуберкулёз и кишечный иерсиниоз классифицируются как природноочаговые сапрозоонозы, резервуаром которых служат мелкие млекопитающие (дикие и синантропные грызуны), сельскохозяйственные и домашние животные (крупный рогатый скот, свиньи, собаки, кошки). Механизм передачи энтеропатогенных иерсиний ― фекально-оральный, который при псевдотуберкулёзе реализуется через загрязнённые выделениями грызунов продукты растительного, а при кишечном иерсиниозе ― животного происхождения, употребляемых в пищу в сыром или недостаточно термически обработанном виде.

Как психрофильный микроорганизм Yersinia способны размножаться при температуре +4…+10°C, накапливаться в продуктах при длительном хранении [4], обусловливая их потенциальную биологическую опасность для человека. Частота обнаружения патогенных Y. enterocolitica в свином мясе составляет 15,2%, в свиных субпродуктах ― 67−83%, курином мясе ― 32,5%, говяжьем мясе и фарше ― от 10 до 47%, в овощных салатах и воде ― от 3 до 15% [5]. Достоверно установлены факты передачи Y. enterocolitica при употреблении молочного шоколадного напитка [6], молока, соевого сыра тофу [7], воды, пахты [8], свиного мяса [9].

В России, в период неблагоприятной эпидемиологической ситуации на Дальнем Востоке, выявлен высокий процент инфицированности Y. pseudotuberculosis сырых овощей ― капусты (37,5%), репчатого лука (26,7%), моркови (30,9%), причём возбудитель накапливался на овощах при их хранении с осени до зимы [10]. Показано, что заражение детей псевдотуберкулёзом в 75,6% осуществлялось именно через свежие овощи, употребляемые в виде овощного салата и винегрета, в состав которых чаще всего входили белокочанная капуста и/или репчатый лук. Несмотря на преобладающее выделение псевдотуберкулёзного микроба с овощей и корнеплодов, исследованиями, проведёнными в Эстонии, Латвии и Ленинградской области в период с 2004 по 2007 г., выявлено от 1,5 до 7% инфицированных Y. pseudotuberculosis О:3 серовара свиней, что указывало на наличие дополнительного резервуара возбудителя псевдотуберкулёзной инфекции [11].

Вид Y. pseudotuberculosis биохимически однороден. Однако установлено, что западноевропейские изоляты возбудителя (Евразия, Северная и Южная Америка, Австралия) не ферментируют мелибиозу, в то время как азиатские штаммы, выделенные в Японии и России, ферментируют указанный дисахарид. В настоящее время известно, что из 21 серологического варианта Y. pseudotuberculosis одиннадцать сероваров (О:1а; О:1b; О:1с; О:2а; О:2b; О:2с; О:3; О:4а; О:4b; О:5а; О:5b) имеют значение в патологии человека, а остальные (О:6; О:7; О:8; О:9; О:10; О:11; О:12; О:13; О:14; О:15) выделяются только от мелких млекопитающих и из объектов окружающей среды и никогда не обнаруживаются у больных, в связи с чем эти серовары, по-видимому, могут быть отнесены к сапрофитным формам Y. pseudotuberculosis [12].

Установлена генетическая неоднородность штаммов Y. pseudotuberculosis, изолированных на территориях Северо-Западного, Сибирского и Дальневосточного регионов России, а также Японии и стран Европы, по наличию суперантигена YPMa, «острова высокой патогенности» НPI, пилей адгезии YAPI и плазмиды pVM 82 MDa, что определяет форму заболевания по тяжести клинического течения с определённым симптомокомплексом [12].

Вид Y. enterocolitica классифицируется по 6 биохимическим типам (1А; 1В; 2; 3; 4; 5), различающимся по ферментации трегалозы, ксилозы, эскулину/салицину, наличию индола и липазы. Патогенный потенциал возбудителя неоднороден. Y. enterocolitica биотипов 1В, 2−5 являются патогенными, в них всегда обнаруживаются ген термостабильного энтеротоксина ystА, плазмида вирулентности pYV 42−47 MDа и ген адгезии-инвазии ail. До сих пор нет однозначного мнения о патогенности Y. enterocolitica биотипа 1А. Несмотря на то, что этот микроорганизм не имеет вышеперечисленных маркеров вирулентности, некоторые штаммы Y. enterocolitica биотипа 1А способны вызывать случаи диареи у людей и даже небольшие вспышки. Нами показано, что у 81,3% штаммов Y. enterocolitica 1А присутствует ген ystB термостабильного токсина YSTb, в том числе и у всех штаммов, изолированных от больных с выраженной клинической симптоматикой энтерита и энтероколита. Биотипы Y. enterocolitica включают в себя 34 серологических группы, однако заболевание человека вызывает ограниченное число штаммов, относящихся к патогенным Y. enterocolitica серотипам/биотипам: О:3/4; О:3/3; О:5; 27/2; О:8/1b; О:9/2 и О:13. В исследованиях ряда авторов показана географическая неоднородность циркуляции патогенных кишечных иерсиний. Самыми распространёнными серотипами в странах Европы (90%) являются О:3 и О:9, в Японии ― О:3/3 [12], в США ― О:8/1b; О:3/4 и О:5, 27/2, в Сибири и на Дальнем Востоке РФ ― О:3 (0,41−5,84%).

ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ЭНТЕРОПАТОГЕННЫХ ИЕРСИНИЙ

Для обнаружения Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica в настоящее время используются культуральные, серологические и молекулярно-генетические методы. Культуральный (бактериологический) метод является золотым стандартом, поскольку позволяет выделить чистую культуру и изучить её биологические и молекулярно-генетические свойства. Метод включает ряд процедур:

1) взятие материала, транспортировку и прямой посев;

2) селективное обогащение на жидких питательных средах, или холодовое обогащение и щелочную обработку;

3) выделение чистой культуры на дифференциально-диагностических средах;

4) идентификацию и дифференциацию изолятов с использованием биохимических, серологических и молекулярно-генетических тестов.

Взятие материала, транспортировка и прямой посев

Биологический материал, пробы пищевых продуктов и образцы объектов окружающей среды отбираются согласно стандартным микробиологическим процедурам в герметические контейнеры с забуференным физиологическим раствором (рН 7,6) в соотношении 1:10. Вид исследуемого материала, его количество, сроки и правила взятия регламентируются нормативно-методическим документом (в России МУ 4.2.3019-12¹). Эффективность изоляции иерсиний повышается при увеличении объёма и количества отобранных проб, фильтровании образцов воды через мембранные фильтры.

Прямой высев исследуемого материала обычно малоэффективен из-за обильного роста посторонней микрофлоры, хотя может иметь положительный эффект при исследовании копрофильтратов больных во время фазы острого гастроэнтерита при кишечном иерсиниозе [13], при исследовании паренхиматозных органов.

Селективное обогащение на жидких питательных средах

В качестве сред накопления используют забуференный физиологический раствор, 1% забуференную пептонную воду, буферно-казеиново-дрожжевую и пептонно-калиевую среду. Последняя превосходит буферно-казеиново-дрожжевую по частоте выделения и скорости накопления иерсиний и хорошо себя зарекомендовала при исследовании не только материала от больных, но и пищевых продуктов, воды и объектов окружающей среды. По данным зарубежных авторов [14], для ускорения процесса роста микроорганизмов в забуференный пептонный раствор добавляют сорбитол/маннит 1% и соли желчных кислот 0,15% (желчный бульон с сорбитом ― sorbitol peptone broth and bile salts, PSB).

Некоторые исследователи добивались повышения селективности сред путём специальных добавок к бульонам и высокой температуры инкубации. В частности, бульон с иpгазаном, тетрациклином и хлоратом калия (среда irgasan ticarcillin and potassium chlorate broth, ITC), модифицированный бульон Раппопорт с малахитовой зеленью, карбенициллином и хлоридом натрия (среда malachite green broth, MRB) использовали специально для изоляции Y. enterocolitica О:3/4 в пищевых продуктах, термостатируя исследуемый материал при 25−30°С в течение 2−4 дней [15, 16]. Среда с полимиксином и новобиоцином (бульон триптиказеино-соевый ― trypticasein soy broth, TSB) при инкубации в течение 3 дней при 18°С применялась для изоляции Y. enterocolitica О:3 из молока [14]. Использование среды с содержанием желчи, оксалатов и сорбозы (bile-oxalate-sorbose, BOS) увеличивало высеваемость Y. enterocolitica 1B/О:8 из клинического материала [17, 18]. H. Fukushima и соавт. (1995) [18] для селективного выделения Y. pseudotuberculosis и патогенных Y. enterocolitica из проб воды предлагали использовать клетки HeLa, способные адгезировать на своей поверхности патогенные иерсинии, а Е. Koujitani и соавт. (2006) [19] для изоляции Y. enterocolitica О:8 применяли метод иммуномагнитного разделения с антииерсиниозными антителами.

Холодовое обогащение и щелочная обработка

В связи с уникальной возможностью Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica размножаться в условиях низких температур на минимальных средах J.S. Peterson и R.A. Cook (1963) предложили для выделения возбудителя использовать метод «холодового обогащения», при котором исследуемый материал выдерживается в накопительной среде в холодильнике при +4…+10°С от 8 дней до 3 нед с периодическими высевами на плотные питательные среды на 3, 7, 14 (материал от больных) и 21-е сут (материал из объектов окружающей среды), что позволяет повысить высеваемость иерсиний [20]. Недостатком данного метода служит значительное размножение непатогенных Y. enterocolitica и других психрофильных микроорганизмов в течение длительного (21 день) инкубационного периода, что затрудняет изоляцию энтеропатогенных иерсиний. В связи с этим С.С. Aulisio и соавт. (1980) [21] и Н. Fukushima и соавт. (1985) [22] предлагают непосредственно перед высевом проводить щелочную обработку проб, при которой ввиду резистентности Yersinia к щёлочи можно избавиться от посторонней микрофлоры. Щелочная обработка проводится с третьего дня холодового обогащения путём смешивания 0,5 мл исследуемого материала с 0,5 мл 0,72% КОН (гидроокись калия) на 0,54% NaCl (хлорид натрия) в течение 30 сек, в результате чего подавляется рост микроорганизмов, таких как Pseudomonas, Proteus, Serratia.

Выделение чистой культуры на дифференциально-диагностических средах

Для изоляции Y. enterocolitica за рубежом широко используют питательные среды: агар Мак-Конки (MacConkey agar base), цефсулодин-иргазан-новобиоциновая среда (cefsulodin-irgazan-novobiocin, СIN агар, Difco, Oxoid) и Salmonella-Shigella дезоксихолатный агар (SSDC), которые включены в протоколы Международной организации по стандартизации (International Organization for Standardization, ISO, 10273:2003), Комитета северных стран по анализу пищевых продуктов (Nordic Committee on Food Analysis, NCFA, 117:1996) и Управления по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (Food and Drug Administration, FDA, 2007) [16]. Для дифференциации патогенных и авирулентных Y. enterocolitica применяют СIN агар, содержащий 0,1% эфирных масел и 0,05% цитрата железа (VYE агар) [22], или хромогенную среду с целлобиозой (YeCM) [23]. Что касается Y. pseudotuberculosis, то наиболее приемлемой питательной средой считают СIN агар и Мак-Конки.

В России в качестве дифференциально-диагностических сред применяют среду Эндо, однако работа с этой средой требует высокого профессионализма бактериолога ввиду обильного роста посторонней микрофлоры и затруднения дифференциации колоний иерсиний от других энтеробактерий, поэтому исследуемый материал рекомендуется подвергать щелочной обработке. Отдельными отечественными авторами [24] проводились исследования по усовершенствованию питательных сред с целью ускорения скорости роста и возможности дифференциации иерсиний, в первую очередь Y. pseudotuberculosis, от других бактерий, так как именно этот возбудитель с конца 60-х годов вызывал массовые эпидемические вспышки на Дальнем Востоке. С 1998 года осуществляется промышленный выпуск среды СБТС (Питательная среда для выделения возбудителей кишечного иерсиниоза и псевдотуберкулёза, сухая, производства ГНЦПМ, п. Оболенск), входящей в российский стандарт лабораторной диагностики иерсиниозов МУ 4.2.3019-12².

Результативность бактериологического метода зависит от интенсивности эпидемического процесса, периода заболевания, исследуемого биологического субстрата и применяемых питательных сред. Культуры Y. pseudotuberculosis чаще (55,4±6,6%) выделяли в период вспышек, в сравнении со спорадическими случаями заболевания (7,5±2,0%) [10]. Значительно легче удавалось изолировать возбудителя от больных и носителей (например, свиней), чем из объектов окружающей среды и пищевых продуктов, поскольку при инфекционном процессе возбудитель псевдотуберкулёза является доминирующим [16]. Максимальное число изолятов регистрировалось при исследовании копрофильтратов в течение всего периода болезни [25]. Н. Fukushima и соавт. (1985) [22] показали, что выделение возбудителя через кишечник отмечалось в течение 10−14 дней в количестве 10⁵−10⁸ м.к./г, затем высеваемость патогена снижалась до 10⁴−10⁶ м.к./г, на 28−30-й дни болезни микроорганизм обнаруживался в копрофильтрате в количестве 10² м.к./г, т.е. бактериологическое исследование сывороток крови целесообразно проводить только в период лихорадки. Г.Я. Ценева и соавт. (1993) [24] показали, что при параллельном высеве материала от больных псевдотуберкулёзом и острыми кишечными заболеваниями на среды Серова, Эндо, Мак-Конки и дезоксихолатный агар, преимущество по выделению иерсиний имеют среда Мак-Конки (4,7%) и дезоксихолатный агар (5,2%), менее эффективны среды Серова (3,8%) и Эндо (3,3%). По данным авторов, при исследовании копрофильтратов больных частота выделения Y. pseudotuberculosis на среде с бромтимоловым синим составила 27,2%, при анализе тонких кишечников мелких млекопитающих ― 5,6%. Высеваемость возбудителя на указанной среде со смывов с объектов окружающей среды, по данным М.В. Чесноковой и соавт. (1993) [10], составила 0,9%. Изоляция Y. enterocolitica из свиных миндалин на CIN агаре установлена в пределах 27,5−65,2%, на среде Мак-Конки ― 42,3%, исследование свиного мяса на CIN агаре дало положительный результат в 3,9% случаев [16, 26].

Идентификация и дифференциация чистых культур иерсиний

Yersinia spp. ― полиморфные грамотрицательные палочки, при росте на плотных питательных средах обладают типичной морфологией. Оксидазонегативные и уреазоположительные колонии идентифицируют по набору биохимических тестов, основными из которых являются ферментативная активность (сахароза, рамноза, рафиноза, мелибиоза), подвижность, реакция Фогеса−Проскауэра, декарбоксилирование аминокислот (орнитиндекарбоксилаза), дезаминирование фенилаланина и индолообразование. Предложенные тесты позволяют в комплексе чётко провести идентификацию и дифференциацию видов иерсиний (табл. 1).

 

Таблица 1. Основные биохимические свойства бактерий рода Yersinia (26±2)°С / Table 1. Main biochemical characteristics of bacteria of the Yersinia species (26±2)°С

Тест или субстрат

Y. pestis

Y. pseudotuberculosis

Y. enterocolitica

Y. frederiksenii

Y. intermedia

Y. kristensenii

Y. ruckeri

Y. aldovae

Y. rohdei

Y. mollaretti

Y. bercovieri

Y. aleksiciae

Y. wautersii

Биотипы

I

II

III

IV

V

IA

IB

Гидролиз мочевины

-

+

+

+

+

+

+

+

[+]

[+]

[+]

-

[+]

B

[-]

B

+

+

Образование индола

-

-

+

+

B

-

-

-

+

+

B

-

-

-

-

-

+

-

Подвижность (22±2)°С

(22±2)°С

-

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

B

+

+

+

+

+

+

(37±1)°С

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

Реакция Фогеса−Проскауэра

(26±2)°С

-

-

+

+

+

+

+

+

+

+

-

-

+

-

-

-

-

-

(37±1)°С

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

Фенилаланиндезаминаза

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

Орнитиндекарбоксилаза

-

-

+

+

+

+

+

В

+

+

+

+

В

[-]

[+]

[+]

+

-

Лизиндекарбоксилаза

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

B

-

-

-

-

+

-

Липаза (Твин-80)

-

-

+

+

-

-

-

-

В

В

В

В

-

-

-

-

-

-

Цитрат Симмонса

-

-

-

-

-

-

-

-

B

+

-

+

+

-

-

-

-

-

Гидролиз эскулина

B

+

[+]

-

-

-

-

-

[+]

+

-

-

-

-

-

[-]

-

+

Образование кислоты:

• из D-ксилозы

+

+

+

+

+

+

-

B

+

+

[+]

-

B

B

B

+

+

+

• мальтозы

[+]

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

-

-

B

+

+

+

• мелибиозы

[-]

В

-

-

-

-

-

-

-

[+]

-

-

-

В

-

-

-

-

• L-рамнозы

-

B

-

-

-

-

-

-

+

+

-

-

-

-

-

-

-

+

• рафинозы

-

[-]

-

-

-

-

-

-

В

В

-

-

-

В

-

-

-

+

• салицина

B

[-]

+

-

-

-

-

-

+

+

[-]

-

-

-

[-]

[-]

-

-

• сахарозы

-

-

+

+

+

+

+

B

+

+

-

-

[-]

+

+

+

-

-

• D-сорбитола

B

-

+

+

+

+

+

-

+

+

+

B

B

+

+

+

+

-

• трегалозы

+

+

+

+

+

+

+

-

+

+

+

+

[+]

+

+

+

+

+

Примечание. «+» ― положительная реакция у ≥90% штаммов; [+] ― положительная реакция у 76−89% штаммов; В ― положительная реакция у 26−75% штаммов; [-] ― положительная реакция у 11−25% штаммов; «-» ― отрицательная реакция у ≥90% штаммов.

Note: «+» ― positivereactionwithmore 90% ofstrains; [+] ― positivereactionwith 76−89% of strains; В ― positivereactionwith 26−75% of strains; [-] ― positivereactionwith 11−25% of strains; «-» ― negative reaction with more 90% of strains.

 

Описаны случаи выделения штаммов Y. enterocolitica с отрицательной реакцией Фогеса−Проскауэра и/или не ферментирующие сахарозу [26], а также мелибиозанегативные штаммы Y. pseudotuberculosis [12]. Установлены трудности дифференциации Y. pseudotuberculosis от штаммов Yersinia similis и Yersinia pekkanenii в связи с аналогичными результатами биохимических тестов [27]. В этом случае идентификация может быть проведена с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) или методом ДНК-гибридизации. Традиционно для идентификации Y. pseudotuberculosis и дифференциации его от других энтеробактерий применяют псевдотуберкулёзный бактериофаг. Однако в ряде случаев отмечается отсутствие фаголизиса свежевыделенных штаммов Y. pseudotuberculosis на питательных средах с повышенным содержанием NaCl (0,6−0,7%). Наиболее высокая чувствительность псевдотуберкулёзного микроба к специфическому бактериофагу (93,7%) отмечена на среде с содержанием 0,3% NaCl и наличием фосфатно-щелочной буферной системы.

В качестве экспрессных методов идентификации микроорганизмов всё большее применение находят АPI-тест-системы и биохимические автоматизированные анализаторы. Показано, что при исследовании 105 клинических изолятов Yersinia spp., инкубированных при 28°С, процент совпадений пробирочных биохимических тестов с идентификацией в тест-системе АPI 20Е составил 93%. Исследование 212 изолятов 10 видов Yersinia с помощью автоматизированной системы для биохимической идентификации Vitek GNI позволило подтвердить правильность идентификации до рода в 96,3%, до вида ― в 57,4% изолятов от входящих в базу данных Vitek GNI [28, 29].

БИО- И СЕРОТИПИРОВАНИЕ ИЕРСИНИЙ

Биотипирование Y. enterocolitica определяют с помощью обычных биохимических тестов, представленных в табл. 2.

 

Таблица 2. Биотипирование Yersinia enterocolitica (28°С, 24 ч) / Table 2. Biotyping of Yersinia enterocolitica (28°С, 24 h)

Реакция	Биотипы
	1А	1В	2	3	4	5
Салицин	+	-	-	-	-	-
Лецитиназа (липаза)	+	+	-	-	-	-
Индол	+	+	+	-	-	-
Ксилоза	+	+	+	+	-	-
Трегалоза	+	+	+	+	+	-

 

Серологическое типирование изолятов, связанных с заболеваниями человека, проводят с помощью реакции агглютинации на стекле с использованием коммерческих типоспецифических О-антисывороток к наиболее распространённым серотипам О:3; О:5; О:9 и О:8 для Y. enterocolitica (Denka Seiken, Токио, Япония) и О:1−О:6 для Y. pseudotuberculosis (Denka Seiken) [20]. В России эти сыворотки выпускает Санкт-Петербургский институт имени Пастера. Альтернативным серотипированию Y. pseudotuberculosis методом считается О-генотипирование 21 сероварианта этого возбудителя с использованием схемы на основе ПЦР [30].

ИЗУЧЕНИЕ ПАТОГЕННОСТИ ИЕРСИНИЙ

Для оценки патогенности необходимо учитывать, что все Y. pseudotuberculosis, но не все Y. enterocolitica считаются потенциально патогенными. В связи с этим определение маркеров вирулентности позволяет провести дифференциацию вирулентных Y. enterocolitica, имеющих эпидемиологическое значение, от авирулентных. Вирулентные иерсинии содержат родоспецифическую плазмиду вирулентности pYV 42−48 МDа, кодирующую белки наружной мембраны Yad А, способствующие адгезии и инвазии бактерий, а также белки Yops, которые участвуют в подавлении фагоцитарной активности клеток иммунной системы хозяина, размножении бактерий в пейеровых бляшках и лимфоидной ткани. Плазмида pYV 42−48 МDа имеется у всех свежевыделенных штаммов Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica, относящихся к биотипам 1В-5. Наличие плазмиды ассоциируется с выявлением маркеров патогенности: аутоагглютинацией на бульоне Хоттингера при 35−37°С [31], ограниченным ростом на средах с дефицитом кальция при 35−37°С и связыванием конго красного или кристаллического фиолетового при 35−37°С [32]; способностью вызывать гнойный кератоконъюнктивит у морских свинок (тест Sereny) через 48−72 ч после инфицирования глаз [33], летальностью для биопробных мышей при оральном, внутрибрюшинном или внутривенном пути заражения. Для оценки вирулентных свойств иерсиний представляет интерес пиразинаминазный тест, позволяющий по отсутствию пиразин-карбоксилазной активности дифференцировать патогенные Y. enterocolitica. Вместе с тем в практических лабораториях для выявления белков наружной мембраны (Yad А), детерминированных плазмидой pYV, используется реакция агглютинации на стекле с диагностической сывороткой к вирулентным иерсиниям, выпускаемой НИИЭМ имени Пастера.

ЭКСПРЕСС-МЕТОДЫ ИНДИКАЦИИ И ИДЕНТИФИКАЦИИ ИЕРСИНИЙ

В 80−90-е годы в Российской Федерации проводились широкие научные исследования по разработке и апробации ряда диагностических тест-систем: гемагглютинационных (РНГА, РТНГА), агглютинационных (реакции коагглютинации и латекс-агглютинации) и твердофазных иммунохимических (иммуноферментный анализ), обладающих определённой эффективностью, но не нашедших широкого практического применения ввиду отсутствия сертифицированных тест-систем.

В настоящее время для экспрессного выявления и последующей идентификации возбудителей энтеропатогенных иерсиний используют метод флюоресцирующих антител и ПЦР. Чувствительность метода флюоресцирующих антител составляет 10⁵−10⁶ м.к./мл, время постановки ― 1,5−2 ч. Оптимальные сроки исследования всех видов материала от больных ― первые 3−5 дней болезни, трупов мелких млекопитающих ― первые часы после гибели, смывов из объектов окружающей среды ― по эпидпоказаниям. Для проведения анализа необходимо иметь люминесцентный микроскоп и лиофилизат для диагностических целей (Иммуноглобулины диагностические псевдотуберкулёзные люминесцирующие; РосНИПЧИ «Микроб», Саратов).

ПЦР ― быстрому и надёжному методу обнаружения энтеропатогенных иерсиний в клиническом материале, пищевых продуктах и в воде [34, 35] ― отводится первостепенное значение, поскольку данный метод отличается высокой чувствительностью (10²−10³ м.к./мл), специфичностью и экспрессивностью (5−6 ч). ПЦР позволяет выявлять специфические генетические детерминанты патогенности иерсиний. Все вирулентные энтеропатогенные иерсинии содержат гены virF и yadA, локализованные на плазмиде [36]. Существенным хромосомным фактором вирулентности для Y. pseudotuberculosis служат гены инвазивности inv [37], ail [38] или lcrF, для Y. enterocolitica ― гены ail [39], энтеротоксин ystA и rfbC [40].

Используя мишеневые гены, в настоящее время разработаны несколько вариантов ПЦР для детекции Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica в клиническом материале, объектах окружающей среды, пищевых продуктах: однопраймерная ПЦР с электрофоретической детекцией продуктов амплификации [41], вложенная ПЦР (nested PCR) [42], ПЦР в режиме реального времени (real-time ТaqMan и SYBR Green) [38, 43], мультиплексная ПЦР в режиме реального времени с одновременной детекцией в одной пробирке двух патогенов (Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica) [43, 44]. ПЦР в режиме реального времени (real-time Tag-man, SYBR Green) наиболее предпочтительна из-за более быстрого получения ответа, отсутствия ряда этапов обработки и подготовки проб с целью их концентрирования, и т.д. Этот метод позволяет не только идентифицировать возбудителя, но и определять его количество в пробе. При реализации мультиплексной ПЦР с использованием комбинации праймеров на плазмидные и хромосомные гены следует учитывать возможность одновременного обнаружения в материале энтеропатогенных иерсиний, имеющих и не имеющих плазмиду pYV (pYV+ и pYV-). Элиминация этой плазмиды легко происходит на питательных средах под влиянием антибиотиков (новобиоцина) и повышения температуры инкубирования до 37^оС. W.J. Wannet и соавт. [41] предложили использовать праймеры на ген 16S РНК, определяющий видоспецифичность Y. enterocolitica, и на ген ail, определяющий механизм прикрепления (инвазии) микроба к клеткам лимфоидной ткани тонкого кишечника. Мультиплексная ПЦР в таком варианте определяет как патогенные (ампликоны 425 нуклеотидных пар для ail и 330 нуклеотидных пар для 16S РНК), так и непатогенные (один ампликон размером 330 нуклеотидных пар для гена 16S РНК) Y. enterocolitica.

Несмотря на то, что чувствительность метода ПЦР исключительно высока при анализе чистых культур, она снижается при исследовании проб из объектов окружающей среды, клинического материала, пищевых продуктов; кроме того, возможна регистрация ложноотрицательных результатов при наличии в образце ингибиторов реакции (биологические агенты деградации тканей, ферменты, полисахариды и другие компоненты исследуемого материала) [45]. Именно поэтому для успешной ПЦР-диагностики обязательным условием является предварительная подготовка материала, направленная на получение тотальной ДНК и удаление или нейтрализацию ингибиторов.

Пробоподготовка может включать обогащение, разбавление, фильтрацию, центрифугирование, адсорбцию, седиментацию, флотацию анализируемого материала. Обогащение используется всегда на первом этапе обработки пробы для увеличения количества живых иерсиний. Испражнения, образцы пищевых продуктов, почвы необходимо суспендировать в забуференном физиологическом растворе или жидких средах для уменьшения действия ингибиторов и ДНК фоновых микроорганизмов. Центрифугирование на малых оборотах обычно используют для удаления грубых частиц (матрикса) с пищевых продуктов, испражнений, почвы и т.п., тогда как высокоскоростное (>5000 об/мин) центрифугирование необходимо для концентрации живых клеток и удаления ингибиторных компонентов. Фильтрация может быть использована для концентрации энтеропатогенных иерсиний из водных образцов. Для подготовки проб испражнений и смывов с объектов окружающей среды разработан способ, основанный на использовании щелочной обработки материала, при которой бÓльшая часть индигенной микрофлоры погибает и удаляется в виде супернатанта при центрифугировании, а относительно устойчивые к щелочи иерсинии выживают. При исследовании бактериальных взвесей чаще всего используется ДНК-экстракция образца в форме простого прогревания при 100°С. В литературе описаны методы пробоподготовки крови, мочи, воды, почвы [37], основанные на лизисе бактериальных клеток (обычно в растворе 7М гуанидинизотиоционата или 2% растворе натрия додецилсульфата), с последующей сорбцией ДНК на носителе (суспензия SiO₂), отмывкой от ингибирующих компонентов и элюцией ДНК. Выпускаемые в России коммерческие наборы «ДНК-сорб-В» (Амплисенс, Москва), наборы для выделения ДНК ООО «Лаборатория Медиген» (Новосибирск) работают по этому принципу и позволяют получать препарат ДНК микроорганизмов из различных субстратов высокой степени чистоты, пригодный не только для ПЦР, но и для других молекулярно-генетических манипуляций.

H. Fukushima и соавт. (2011) [20] приводят типовой протокол для быстрого разделения и концентрации патогенных микроорганизмов в образцах пищевых продуктов с использованием фильтрации, центрифугирования в градиенте плавучей плотности. Показано, что такая пробоподготовка приводит к концентрации микробной массы в 250 раз в течение 2 ч.

В России для постановки ПЦР используют тест-систему «Амплисенс Yersinia pseudotuberculosis / Yersinia enterocolitica-FL» ― вариант с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени (ФГУН ЦНИИ эпидемиологии, Москва).

Накоплен опыт по конструированию тест-систем для дот-иммуноанализа на основе антител, меченных наночастицами коллоидных металлов, в частности золота и серебра, для экспресс-детекции возбудителя псевдотуберкулёза. Дот-иммуноанализ имеет достаточно выигрышные позиции: простота постановки, миниатюризация (объём исследуемых образцов ― 1 мкл), экспрессивность (общее время проведения анализа ~2 ч), отсутствие потребности в ридерах и других дорогостоящих приборах, достаточно высокие специфичность и чувствительность (сравнимая по своей эффективности с ПЦР) делают его перспективным методом индикации Y. pseudotuberculosis, особенно в режиме чрезвычайных ситуаций.

Использование времяпролётной масс-спектрометрии с матрично-активированной лазерной десорбцией-ионизацией (matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry, МALDI-TOF MS) позволяет провести индикацию и идентификацию возбудителя в течение нескольких минут после внесения образца в рабочую зону прибора. Сущность метода заключается в сравнении специфических белковых спектров (прямое белковое профилирование) подозрительных колоний со спектрами возбудителей из баз данных [46].

УНИФИЦИРОВАННЫЙ АЛГОРИТМ ЛАБОРАТОРНОГО ИССЛЕДОВАНИЯ НА ЭНТЕРОПАТОГЕННЫЕ ИЕРСИНИИ

На основе многолетних мониторинговых исследований нами предлагается унифицированный алгоритм лабораторного исследования на энтеропатогенные иерсинии с учётом использования ПЦР и масс-спектрометрии. Работу целесообразно проводить по оптимизированной нами схеме: холодовое обогащение материала при +4…+ 6°С в течение 2−7 дней; использование метода ПЦР в реальном времени с сертифицированным набором «Ампли-Сенс Yersinia enterocolitica / Yersinia pseudotuberculosis-FL» с гибридизационно-флуоресцентной детекцией; посев на среду с бромтимоловым синим с инкубацией в течение 48 ч при +37°С и последующим визуальным отбором характерных колоний для детекции на MALDI-TOF MS. В случае положительного результата на Yersinia рекомендуются посевы на КД-агар (кормовые дрожжи) с инкубацией в течение 24 ч при +28°С; дифференциально-диагностические тесты и расширенная идентификация выделенных штаммов (ПЦР О-серогенотипирование Y. pseudotuberculosis); определение факторов патогенности Y. pseudotuberculosis (inv, HPI, YAPI, pYV, ypm) и Y. enterocolitica (ail, ystA, ystB); био- и серотипирование Y. enterocolitica; изучение плазмидного спектра штаммов; генотипирование выделенных штаммов (VNTR, PFGA, секвенирование и др.). При положительной ПЦР и отрицательных результатах бактериологического исследования необходимо проведение второго (на 2−3-е сут), а в некоторых случаях ― третьего (на 5−7-е сут) высева. При двукратном отрицательном анализе ПЦР дальнейшее бактериологическое исследование нецелесообразно. Предложенный алгоритм лабораторной диагностики позволяет увеличить частоту и спектр выделения патогенных иерсиний при микробиологическом мониторинге природных и антропургических очагов иерсиниозов в системе эпидемиологического надзора. Проведение ПЦР на этапе экспресс-индикации/идентификации подозрительных колоний позволяет проводить типирование микроба по основным генным детерминантам (серотип, способность к адгезии-инвазии, наличие генов суперантигена энтеротоксинов, островов патогенности); рисунок.

 

Рис. Схема выявления и идентификации энтеропатогенных иерсиний. Примечание. ПЦР — полимеразная цепная реакция, DIA — дот-иммуноанализ, Y.ptbc — Yersinia pseudotuderculosis, Y.ent — Yersinia enterocolitica, МФА — метод флюоресцирующих антител, inv — ген инвазивности, HPI — остров высокой патогенности иерсиний, YAPI — адгезивный остров патогенности иерсиний, pYV — плазмида вирулентности Y. pseudotuderculosis, ymp — ген токсина суперантигена А/С Y. pseudotuderculosis, ail — ген адгезии-инвазии Y. enterocolitica, yst A — ген энтеротоксина А, yst В — ген энтеротоксина B, VNTR — вариабельное число тандемных повторов, PFGA — электрофорез в пульсирующем поле. / Fig. Scheme of Yersinia’s detection and identification. Note: ПЦР — polymerase chain reaction, DIA — Dot immunoassay, Y.ptbc — Yersinia pseudotuderculosis, Y.ent — Yersinia enterocolitica, МФА — Fluorescent antibody method, inv — invasiveness gene, HPI — High Pathogenicity Island, YAPI — Yersinia Adhesion Pathogenicity Island, pYV — Plasmid associated with Yesinia Virulence Y. pseudotuderculosis, ypm A/C — gene Y. pseudotuberculosis-derived Mitogen A/C, ail — gene of adhesion-invasion Y. enterocolitica, yst А — gene Y. enterocolitica stable Toxin A, yst В — gene Y. enterocolitica stable Toxin B, VNTR — Variable Number of Tandem Repeat, PFGA — Pulsed-Field Gel Electrophoresis.

 

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Энтеропатогенные виды Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica являются объектом интенсивного изучения в лабораториях мира и России в связи с их удивительной пластичностью выживания и сохранением патогенных свойств в биотической и абиотической окружающей среде, эпидемически неожиданным проявлением заболеваний спорадического и вспышечного характера. В последние годы лабораторная диагностика иерсиний претерпела существенные изменения: в практику внедрены высокоспецифичный и чувствительный ПЦР-анализ, позволяющий в течение нескольких часов обнаруживать патогенные иерсинии; масс-спектрометрия, являясь эффективным методом ускоренной идентификации выделенных микроорганизмов, сокращает сроки определения их таксономической принадлежности. Сочетание классического микробиологического и молекулярно-генетического методов оперативно определяет наличие или отсутствие патогена в образце, что позволяет целенаправленно использовать бактериологическое исследование для выделения культуры с целью верификации клинического диагноза, подтверждения факторов передачи и планирования противоэпидемических мероприятий.

ДОПОЛНИТЕЛЬНО

Источник финансирования. Поисково-аналитическая работа проведена на личные средства авторского коллектива.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с проведением поисково-аналитической работы и публикацией статьи.

Вклад авторов. Все авторы подтверждают соответствие своего авторства международным критериям ICMJE (все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции, проведение поисково-аналитической работы и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией). Наибольший вклад распределён следующим образом: М.В. Чеснокова ― дизайн научного обзора, анализ литературы, написание обзорной статьи; В.Т. Климов ― поисково-аналитическая работа при написании обзорной статьи, написание раздела «Изучение патогенности иерсиний», «Экспресс-методы индикации и идентификации иерсиний», редактирование текста статьи; Т.В. Каримова ― анализ литературы; Т.Ю. Загоскина ― анализ и обобщение данных литературы, доработка рукописи, направление статьи на публикацию; А.Л. Панин ― сбор литературных источников, редактирование статьи.

ADDITIONAL INFORMATION

Funding source. This article was not supported by any external sources of funding.

Competing interests. The authors declare that they have no competing interests.

Authors’ contribution. All authors made a substantial contribution to the conception of the work, acquisition, analysis, interpretation of data for the work, drafting and revising the work, final approval of the version to be published and agree to be accountable for all aspects of the work. M.V. Chesnokova ― design of the scientific review, the literature analyzing, writing a review article; V.T. Klimov ― search and analytical work when writing a review article, writing the section “Studying the pathogenicity of Yersinia”, “Express methods for Yersinia’s indicating and identifying”, editing the text of the article; T.V. Karimova ― literature analysis; T.Yu. Zagoskina ― analysis and generalization of literature data, revision of the manuscript, submission of the article for publication; A.L. Panin ― collection of literary sources, editing of the article.

 

¹ МУК 4.2.3019-12. 4.2. Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Организация и проведение лабораторных исследований на иерсиниозы на территориальном, региональном и федеральном уровнях. Режим доступа: https://docs.cntd.ru/document/1200104594. Дата обращения: 15.04.2021.

² МУК 4.2.3019-12. 4.2. Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Организация и проведение лабораторных исследований на иерсиниозы на территориальном, региональном и федеральном уровнях. Режим доступа: https://docs.cntd.ru/document/1200104594. Дата обращения: 15.04.2021.

About the authors

Margarita V. Chesnokova

Irkutsk Antiplague Research Institute of Siberia and Far East

Author for correspondence.
Email: mar_chumin@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-5489-9363
SPIN-code: 2005-4321

MD, Dr. Sci. (Med), Professor

Russian Federation, 78, Trilissera street, Irkutsk, 664047

Valeriy T. Klimov

Irkutsk Antiplague Research Institute of Siberia and Far East

Email: 41vklimov@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-0036-0017
SPIN-code: 1382-9190

MD, Cand. Sci. (Med), Senior Research Assistant

Russian Federation, 78, Trilissera street, Irkutsk, 664047

Tatiana V. Karimova

Administration of Rospotrebnadzor in Novosibirsk Region

Email: tatianakarimova357@gmail.com
ORCID iD: 0000-0001-9099-3621
SPIN-code: 7101-4016

MD, Cand. Sci. (Med.)

Russian Federation, Novosibirsk

Tatiana Yu. Zagoskina

Irkutsk Antiplague Research Institute of Siberia and Far East

Email: t_y_z_@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-9302-7143
SPIN-code: 5891-7130

MD, Dr. Sci. (Med.)

Russian Federation, 78, Trilissera street, Irkutsk, 664047

Alexander L. Panin

Saint-Petersburg Pasteur Institute

Email: alp.1952@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-6411-0274
SPIN-code: 4690-3587

Junior Research Assistant

Russian Federation, Saint Petersburg

References

Supplementary files