Гетерогенность по признаку антибиотикочувствительности и генотипу штаммов холерных вибрионов Эль-Тор, выделенных из объектов окружающей среды на территории России

Полный текст

Обоснование

Ежегодно во всём мире от болезней, передаваемых через воду, умирает 3,4 млн человек [1]. Холера ― одно из таких заболеваний. Ежегодно в мире возникает до 4 млн случаев этой инфекции, приводящих более чем к 100 тыс. смертей [2]. Пластичность генома возбудителя холеры, мобильность генетических элементов, несущих факторы патогенности и антибиотикорезистентности, способствуют вариабельности и непредсказуемости спектра устойчивости, формированию новых фено- и генотипов. Результаты исследований свидетельствуют о широком распространении антибиотикоустойчивости среди холерных вибрионов. Один изолят Vibrio cholerae может содержать до 40 различных генов, которые могут придавать устойчивость к 22 антибиотикам, представляющим 9 различных классов противомикробных препаратов [3].

Способность холерного вибриона к долгосрочному выживанию в водных экосистемах, в которых активно идёт обмен генетической информацией и могут возникать новые экологические линии с потенциальным преимуществом к адаптации микроорганизмов к неблагоприятным условиям, подчёркивает сложность путей передачи этой инфекции и необходимость проведения исследований на уровне окружающей среды [4].

Периодические завозы холеры на территорию Российской Федерации с/без распространения возбудителя инфекции; контаминация V. cholerae О1 El Tor ctxA+tcpA+, V. cholerae О1 El Tor ctxA-tcpA+, V. cholerae О1 El Tor ctxA-tcpA- поверхностных водоёмов, используемых в качестве источников водоснабжения и с целью рекреационного водопользования, а также возможность реализации основного при холере (водного) пути распространения возбудителя инфекции [5] свидетельствуют о необходимости проведения ежегодного мониторинга антимикробной резистентности в рамках эпидемиологического надзора за холерой с целью получения информации о распространении, характере и динамике резистентности в конкретный период времени на данной территории. Эти данные могут быть использованы при разработке и внедрении более эффективных подходов к лечению, сдерживанию появления и распространения антимикробной резистентности на локальном, региональном, национальном и международном уровнях.

Цель исследования ― анализ спектра антибиотикорезистентности штаммов холерных вибрионов серогруппы О1, выделенных из объектов окружающей среды на различных территориях Российской Федерации в 2020 г.

Материал и методы

Штаммы

Из музея живых культур ФКУЗ «Ростовский-на-Дону ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора были взяты штаммы V. cholerae О1 El Tor, выделенные в 2020 г. из объектов окружающей среды в Российской Федерации: Иркутской области (3 штамма), Удмуртской Республике (5 штаммов), Республике Татарстан (2 штамма), Ростовской области (9 штаммов), Забайкальском крае (4 штамма), Приморском крае и Республике Бурятия (по 1 штамму). Все штаммы не содержали гена холерного токсина сtxА; только 8 штаммов (Ростовская область) несли ген tcpА.

Антибактериальные препараты

Препараты отечественного производства: доксициклин, тетрациклин, левомицетин (хлорамфеникол), рифампицин, стрептомицин, канамицин, гентамицин, ампициллин, фуразолидон, ципрофлоксацин, триметоприм/сульфаметоксазол, цефтриаксон.

Препараты зарубежного производства: налидиксовая кислота (Невиграмон, Chinoin, Венгрия).

Чувствительность/устойчивость изучаемых штаммов к антибактериальным препаратам определяли методом серийных разведений на плотной питательной среде: агар Мюллера–Хинтона, рН 7,5 (HIMEDIA, Индия). Посевная доза взвесей 16–18-часовых агаровых культур составляла n×10⁶ м.к. по отраслевому стандарту мутности ФГБУ НЦЭСМП (ОСО-42-28-86). Интерпретацию результатов проводили в соответствии с МУК 4.2.2495-09 [6], используя контрольные антибиотикочувствительные штаммы: V. cholerae О1 El Tor Р-5879 (сtx+tcp+, выделен от больного в Ростовской области в 1972 г.) и V. cholerae non О1/non О139 Р-9741 (КМ162) (сtx-tcp-, выделен из воды в Ростовской области в 1979 г.).

ПЦР-генотипирование штаммов V. cholerae El Tor проводили по 14 генам-мишеням с последующим кластерным анализом [7].

Результаты

Данные антибиотикограмм показали, что все изученные штаммы характеризовались чувствительностью к тетрациклинам (тетрациклину и доксициклину), левомицетину, ципрофлоксацину, аминогликозидам (стрептомицину, канамицину, гентамицину) (рисунок).

 

Рис. Чувствительность к антибактериальным препаратам культур холерных вибрионов Эль-Тор, выделенных в 2020 г.

 

Все холерные вибрионы Эль-Тор обладали устойчивостью либо пониженной чувствительностью к фуразолидону, а 16 штаммов ― к триметоприму/сульфаметоксазолу. У 13 вибрионов выявлена резистентность к ампициллину, а у 5 ― к налидиксовой кислоте либо к цефтриаксону. Спектр резистентности штаммов V. cholerae О1 El Tor (ctxА-tcpА-), выделенных из объектов окружающей среды на территории Российской Федерации в предыдущие годы (2005–2019), дополнительно включал стрептомицин, гентамицин, рифампицин, левомицетин с преобладанием устойчивости к фуразолидону и триметоприму/сульфаметоксазолу [8].

При отсутствии культур, чувствительных одновременно ко всем антибактериальным препаратам, взятым в исследование, холерные вибрионы по антибиотикоустойчивости распределились на 5 фенотипов и содержали от 1 до 6 маркеров антибиотикорезистентности (табл. 1).

 

Таблица 1. Фенотипы антибиотикорезистентности и ПЦР-генотипы штаммов V. cholerae О1 El Tor, выделенных на различных территориях Российской Федерации

Table 1. Antibiotic resistance phenotypes and Polymerase Chain Reaction-genotypes of strains V. cholerae О1 El Tor, allocated in various territories of the Russian

Число r-детерминант	Профили резистентности	Количество штаммов	ПЦР-генотип	Территории
1	Furr	1	А3	Республика Татарстан
		6	А1, А2	Ростовская область
2	FurrAp	1	А5	Иркутская область
		1	А2	Ростовская область
3	FurrTmpSmz	2	А3	Иркутская область
		1	А3	Удмуртская Республика
		2	А1, А2	Ростовская область
4	FurrTmpSmzAp	1	А3	Приморский край
		1	А3	Республика Татарстан
		4	А3	Удмуртская Республика
6	FurrTmpSmzApCtrNalr	4	А3, А4	Забайкальский край
		1	А3	Республика Бурятия

Примечание. Устойчивость: Fur^r ― к фуразолидону; Tmp ― триметоприму; Smz ― сульфаметоксазолу; Nal^r ― налидиксовой кислоте, Ap ― ампициллину, Ctr ― цефтриаксону.

Note. Resistance: Fur^r ― to furazolidone; Tmp ― trimethoprim; Smz ― sulfamethoxazole; Nal^r ― nalidixic acid, Ap ― ampicillin, Ctr ― ceftriaxone.

 

Наибольшее количество штаммов (7) было нечувствительно к одному антибактериальному препарату (Fur^r). Пять штаммов несли по три и по шесть маркеров устойчивости. Свыше половины изолятов (16) характеризовались множественной антибиотикорезистентностью (к трём или более препаратам). Такие штаммы в настоящее время повсеместно распространены. Так, все V. cholerae О1 El Tor, выделенные из объектов окружающей среды в 2015–2016 гг. в Гане, были устойчивы к одному или нескольким из восьми использованных антибиотиков. Множественная устойчивость наблюдалась более чем в 97% случаев [9]. В Китае в 2018 г. около 57,6% экологических изолятов обладали 57 фенотипами множественной лекарственной устойчивости [10]; 99% штаммов V. cholerae в Индии были устойчивы более чем к двум антибиотикам [11].

С целью выявления сходств и различий между штаммами мы провели их ПЦР-генотипирование по 14 генам-мишеням, в результате чего штаммы распределились на 5 генотипов (А1–А5), соответствующих определённым территориям (см. табл. 1). Так, штаммы холерного вибриона, выделенные в 2020 г. в Ростовской области, были отнесены к двум генотипам ― А1 и А2. В Иркутской области и Забайкальском крае штаммы V. cholerae О1 имели генотипы А3 и А5, а также А3 и А4 соответственно. Самым распространённым оказался генотип А3, который был выявлен у 13 штаммов, изолированных из объектов окружающей среды на 6 административных территориях России (Республики Бурятия, Татарстан, Удмуртия, Иркутская область, Забайкальский и Приморский края). Данный генотип характеризовался наличием генов системы секреции третьего типа, а также генов активатора и активного домена MARTX и маннозочувствительных пилей адгезии; остальные гены были представлены в различных сочетаниях (табл. 2).

 

Таблица 2. Генетическая характеристика штаммов холерных вибрионов О1 Эль-Тор, входящих в генотип А3

Table 2. Genetic characteristics of Vibrio cholerae strains О1 El Tor, included in the A3 genotype

Административная территория

№ штамма

Серовар

Фаголизабельность фаг Эль-Тор

Генотип

rstA

tcpAelt

int

nanH

vce

rtxC

acd-rtxA

acd-vgrG1

pbd-vgrG3

vasK

vcsN2

vspD

mshA

stn/sto

Подгруппа

Иркутская область

1-20

Инаба

ДРТ

А3

-

-

+

+

-

+

+

-

+

+

+

+

+

-

I

Забайкальский край

100

Инаба

отр.

II

Иркутская область

2-20

Инаба

ДРТ

I

Республика Татарстан

50863

Инаба

ДРТ

Удмуртская Республика

177

Инаба

отр.

II

Забайкальский край

2336

Инаба

ДРТ

I

Республика Бурятия

1557

Инаба

ДРТ

Удмуртская Республика

51

Инаба

отр.

II

Удмуртская Республика

8/24Б

Инаба

отр.

Удмуртская Республика

9/24Б

Инаба

отр.

Удмуртская Республика

12/24Б

Инаба

отр.

Приморский край

541в-2020

Инаба

отр.

Республика Татарстан

10349

Огава

ДРТ

III

Примечание. ДРТ ― диагностический рабочий титр.

Note. ДРТ ― diagnostic working title.

 

Однако при проведении комплексного изучения биологических свойств путём распределения изолятов V. cholerae O1 на группы по критерию отличительных признаков (фенотипических и генотипических) установлено их распределение на 3 подгруппы:

• I ― чувствительность к фагу Эль-Тор в диагностическом рабочем титре (ДРТ), принадлежность к серовару Инаба, генотип А3;
• II ― устойчивость к фагу Эль-Тор, принадлежность к серовару Инаба, генотип А3;
• III ― чувствительность к фагу Эль-Тор в ДРТ, принадлежность к серовару Огава, генотип А3.

Обсуждение

Таким образом, в пределах выявленных генотипов штаммы обладали индивидуальными особенностями. Возможно, это есть проявление генетических рекомбинаций, активно происходящих в водных экосистемах [4]. Холерные вибрионы способны изменять свой геном для структурирования метаболических процессов, развития лекарственной устойчивости, изменения патогенных и других признаков, которые позволяют быстро адаптироваться к неблагоприятным условиям окружающей среды [12]. Имеются сообщения о постоянной смене генетических линий V. cholerae O1, циркулирующих в Калькутте (Индия) [13].

Сопоставив характеристики вибрионов по профилям антибиотикорезистентности, территориям выделения и ПЦР-генотипам, мы сделали вывод, что в пределах одного генотипа V. cholerae О1 El Tor, принадлежащих к разным территориям, могут обладать как одинаковой, так и разной чувствительностью. Так, штаммы генотипа А3 с фенотипом Fur^rTmpSmzAp изолированы в Приморском крае, Татарстане и Удмуртии. В то же время один штамм А3 из Удмуртской Республики обладал фенотипом Fur^rTmpSmz, а из Республики Татарстан ― фенотипом Fur^r. Особенно отличались профили резистентности изолятов генотипа А3 из Забайкальского края и Республики Бурятии: эти штаммы обладали максимальным числом маркеров устойчивости (6), включая цефтриаксон и налидиксовую кислоту (см. табл. 1).

Фенотипы (Fur^r и Fur^rTmpSmz), аналогичные тем, которые были характерны для штаммов генотипа А3, выявлены и у вибрионов из Ростовской области, которые являлись самыми многочисленными в данном исследовании (9) и принадлежали к генотипам А1 или А2 (см. табл. 1).

Заключение

В проведённом исследовании выявлено генотипическое разнообразие изолированных штаммов, вариабельность маркеров резистентности, появление одних и утрата других в короткий промежуток времени даже в одном регионе, что свидетельствует как об изменениях в популяции холерного вибриона, так и о возможности циркуляции различных гено- и фенотипов, что подчёркивает важность постоянного наблюдения за данными патогенами.

Дополнительная информация

Источник финансирования. Авторы заявляют об отсутствии внешнего финансирования при проведении исследования.

Funding source. This study was not supported by any external sources of funding.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Competing interests. The authors declare that they have no competing interests.

Вклад авторов. Все авторы подтверждают соответствие своего авторства международным критериям ICMJE (все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией).

Authors’ contribution. All authors made a substantial contribution to the conception of the work, acquisition, analysis, interpretation of data for the work, drafting and revising the work, final approval of the version to be published and agree to be accountable for all aspects of the work.

Об авторах

Надежда Александровна Селянская

Ростовский-на-Дону ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский противочумный институт Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Email: ppdn@inbox.ru
ORCID iD: 0000-0002-0008-4705
SPIN-код: 7920-3340

кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник лаборатории экспериментально-биологических моделей

Россия, 344002, Россия, Ростов-на-Дону, ул. М. Горького, 117/40

Дарья Александровна Левченко

Ростовский-на-Дону ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский противочумный институт Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Email: levchenko_da@antiplague.ru
ORCID iD: 0000-0002-4676-0377
SPIN-код: 7896-9092

кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник лаборатории микробиологии холеры

Россия, 344002, Ростов-на-Дону, ул. М. Горького, д. 117/40

Лиана Альбертовна Егиазарян

Ростовский-на-Дону ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский противочумный институт Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Email: caturyanliana@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-6350-065X
SPIN-код: 1300-9523

младший научный сотрудник лаборатории биологической безопасности и лечения ООИ

Россия, 344002, Россия, Ростов-на-Дону, ул. М. Горького, 117/40

Нина Ивановна Пасюкова

Ростовский-на-Дону ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский противочумный институт Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Автор, ответственный за переписку.
Email: ppdn@inbox.ru
ORCID iD: 0000-0002-1525-5693
SPIN-код: 9950-9439

научный сотрудник лаборатории  экспериментально-биологических моделей

Россия, 344002, Ростов-на-Дону, ул. М. Горького, д. 117/40

Список литературы

Дополнительные файлы