Heterogeneity by antibiotic sensitivity and genotype of Vibrio Cholerae El Tor strains isolated from environmental objects in Russia

Cover Page


Cite item

Abstract

BACKGROUND: Waterborne diseases kill 3.4 million people worldwide each year. Cholera is one such disease. Up to 4 million cases of this infection occur in the world every year, leading to more than 100,000 deaths. The plasticity of the genome of the causative agent of cholera, the mobility of genetic elements carrying factors of pathogenicity and antibiotic resistance, contribute to the variability and unpredictability of the spectrum of resistance, the formation of new pheno- and genotypes. A single Vibrio cholerae isolate can contain up to 40 different genes that can confer resistance to 22 antibiotics, representing nine different classes of antimicrobial drugs. The ability of Vibrio cholerae to long-term survival in aquatic ecosystems in which there is an active exchange of genetic information and new ecological lines may arise that have potential advantages in the adaptation of microorganisms to adverse conditions, emphasizes the complexity of the ways of transmission of this infection and the need for studies at the environmental level. Periodic deliveries of cholera to the territory of the Russian Federation with (without) the spread of the infectious agent, V. cholerae contamination of surface water bodies used as sources of water supply and for recreational water use, the possibility of implementing the main route for cholera (water) the pathway for the spread of the pathogen of the infection indicate the need for conducting annual monitoring of antimicrobial resistance as part of the epidemiological surveillance of cholera in order to obtain information on the distribution, nature and dynamics of resistance in a specific period of time in a given territory.

AIM: Analysis of the spectrum of antibiotic resistance of Vibrio cholerae O1 serogroup strains isolated from environmental objects in various territories of the Russian Federation in 2020.

MATERIALS AND METHODS: 25 strains V. cholerae О1 El Tor, isolated from environmental objects in the Russian Federation in 2020. The sensitivity / resistance of the studied strains to 13 antibacterial drugs was determined by the method of serial dilutions on a solid nutrient medium in accordance with guidelines. PCR-genotyping of strains V. cholerae El Tor was performed for 14 target genes, followed by cluster analysis.

RESULTS: The strains showed resistance markers to furazolidone, trimethoprim/sulfamethoxazole, ampicillin, nalidixic acid, ceftriaxone, which formed 5 phenotypes. PCR-genotyping genotyping of 14 target genes divided the strains into five genotypes (A1–A5), corresponding to certain territories. The antibiotic resistance profiles within the same genotype in V. cholerae О1 El Tor belonging to different territories were both the same and different.

CONCLUSION: The genotypic diversity of isolated strains was revealed, the variability of resistance markers even in one region, which indicates both changes in the V. cholerae population and the possibility of circulation of various geno- and phenotypes, which emphasizes the importance of constant monitoring of these pathogens.

Full Text

Обоснование

Ежегодно во всём мире от болезней, передаваемых через воду, умирает 3,4 млн человек [1]. Холера ― одно из таких заболеваний. Ежегодно в мире возникает до 4 млн случаев этой инфекции, приводящих более чем к 100 тыс. смертей [2]. Пластичность генома возбудителя холеры, мобильность генетических элементов, несущих факторы патогенности и антибиотикорезистентности, способствуют вариабельности и непредсказуемости спектра устойчивости, формированию новых фено- и генотипов. Результаты исследований свидетельствуют о широком распространении антибиотикоустойчивости среди холерных вибрионов. Один изолят Vibrio cholerae может содержать до 40 различных генов, которые могут придавать устойчивость к 22 антибиотикам, представляющим 9 различных классов противомикробных препаратов [3].

Способность холерного вибриона к долгосрочному выживанию в водных экосистемах, в которых активно идёт обмен генетической информацией и могут возникать новые экологические линии с потенциальным преимуществом к адаптации микроорганизмов к неблагоприятным условиям, подчёркивает сложность путей передачи этой инфекции и необходимость проведения исследований на уровне окружающей среды [4].

Периодические завозы холеры на территорию Российской Федерации с/без распространения возбудителя инфекции; контаминация V. cholerae О1 El Tor ctxA+tcpA+, V. cholerae О1 El Tor ctxA-tcpA+, V. cholerae О1 El Tor ctxA-tcpA- поверхностных водоёмов, используемых в качестве источников водоснабжения и с целью рекреационного водопользования, а также возможность реализации основного при холере (водного) пути распространения возбудителя инфекции [5] свидетельствуют о необходимости проведения ежегодного мониторинга антимикробной резистентности в рамках эпидемиологического надзора за холерой с целью получения информации о распространении, характере и динамике резистентности в конкретный период времени на данной территории. Эти данные могут быть использованы при разработке и внедрении более эффективных подходов к лечению, сдерживанию появления и распространения антимикробной резистентности на локальном, региональном, национальном и международном уровнях.

Цель исследования ― анализ спектра антибиотикорезистентности штаммов холерных вибрионов серогруппы О1, выделенных из объектов окружающей среды на различных территориях Российской Федерации в 2020 г.

Материал и методы

Штаммы

Из музея живых культур ФКУЗ «Ростовский-на-Дону ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора были взяты штаммы V. cholerae О1 El Tor, выделенные в 2020 г. из объектов окружающей среды в Российской Федерации: Иркутской области (3 штамма), Удмуртской Республике (5 штаммов), Республике Татарстан (2 штамма), Ростовской области (9 штаммов), Забайкальском крае (4 штамма), Приморском крае и Республике Бурятия (по 1 штамму). Все штаммы не содержали гена холерного токсина сtxА; только 8 штаммов (Ростовская область) несли ген tcpА.

Антибактериальные препараты

Препараты отечественного производства: доксициклин, тетрациклин, левомицетин (хлорамфеникол), рифампицин, стрептомицин, канамицин, гентамицин, ампициллин, фуразолидон, ципрофлоксацин, триметоприм/сульфаметоксазол, цефтриаксон.

Препараты зарубежного производства: налидиксовая кислота (Невиграмон, Chinoin, Венгрия).

Чувствительность/устойчивость изучаемых штаммов к антибактериальным препаратам определяли методом серийных разведений на плотной питательной среде: агар Мюллера–Хинтона, рН 7,5 (HIMEDIA, Индия). Посевная доза взвесей 16–18-часовых агаровых культур составляла n×106 м.к. по отраслевому стандарту мутности ФГБУ НЦЭСМП (ОСО-42-28-86). Интерпретацию результатов проводили в соответствии с МУК 4.2.2495-09 [6], используя контрольные антибиотикочувствительные штаммы: V. cholerae О1 El Tor Р-5879 (сtx+tcp+, выделен от больного в Ростовской области в 1972 г.) и V. cholerae non О1/non О139 Р-9741 (КМ162) (сtx-tcp-, выделен из воды в Ростовской области в 1979 г.).

ПЦР-генотипирование штаммов V. cholerae El Tor проводили по 14 генам-мишеням с последующим кластерным анализом [7].

Результаты

Данные антибиотикограмм показали, что все изученные штаммы характеризовались чувствительностью к тетрациклинам (тетрациклину и доксициклину), левомицетину, ципрофлоксацину, аминогликозидам (стрептомицину, канамицину, гентамицину) (рисунок).

 

Рис. Чувствительность к антибактериальным препаратам культур холерных вибрионов Эль-Тор, выделенных в 2020 г.

 

Все холерные вибрионы Эль-Тор обладали устойчивостью либо пониженной чувствительностью к фуразолидону, а 16 штаммов ― к триметоприму/сульфаметоксазолу. У 13 вибрионов выявлена резистентность к ампициллину, а у 5 ― к налидиксовой кислоте либо к цефтриаксону. Спектр резистентности штаммов V. cholerae О1 El Tor (ctxА-tcpА-), выделенных из объектов окружающей среды на территории Российской Федерации в предыдущие годы (2005–2019), дополнительно включал стрептомицин, гентамицин, рифампицин, левомицетин с преобладанием устойчивости к фуразолидону и триметоприму/сульфаметоксазолу [8].

При отсутствии культур, чувствительных одновременно ко всем антибактериальным препаратам, взятым в исследование, холерные вибрионы по антибиотикоустойчивости распределились на 5 фенотипов и содержали от 1 до 6 маркеров антибиотикорезистентности (табл. 1).

 

Таблица 1. Фенотипы антибиотикорезистентности и ПЦР-генотипы штаммов V. cholerae О1 El Tor, выделенных на различных территориях Российской Федерации

Table 1. Antibiotic resistance phenotypes and Polymerase Chain Reaction-genotypes of strains V. cholerae О1 El Tor, allocated in various territories of the Russian

Число r-детерминант

Профили резистентности

Количество штаммов

ПЦР-генотип

Территории

1

Furr

1

А3

Республика Татарстан

6

А1, А2

Ростовская область

2

FurrAp

1

А5

Иркутская область

1

А2

Ростовская область

3

FurrTmpSmz

2

А3

Иркутская область

1

А3

Удмуртская Республика

2

А1, А2

Ростовская область

4

FurrTmpSmzAp

1

А3

Приморский край

1

А3

Республика Татарстан

4

А3

Удмуртская Республика

6

FurrTmpSmzApCtrNalr

4

А3, А4

Забайкальский край

1

А3

Республика Бурятия

Примечание. Устойчивость: Furr ― к фуразолидону; Tmp ― триметоприму; Smz ― сульфаметоксазолу; Nalr ― налидиксовой кислоте, Ap ― ампициллину, Ctr ― цефтриаксону.

Note. Resistance: Furr ― to furazolidone; Tmp ― trimethoprim; Smz ― sulfamethoxazole; Nalr ― nalidixic acid, Ap ― ampicillin, Ctr ― ceftriaxone.

 

Наибольшее количество штаммов (7) было нечувствительно к одному антибактериальному препарату (Furr). Пять штаммов несли по три и по шесть маркеров устойчивости. Свыше половины изолятов (16) характеризовались множественной антибиотикорезистентностью (к трём или более препаратам). Такие штаммы в настоящее время повсеместно распространены. Так, все V. cholerae О1 El Tor, выделенные из объектов окружающей среды в 2015–2016 гг. в Гане, были устойчивы к одному или нескольким из восьми использованных антибиотиков. Множественная устойчивость наблюдалась более чем в 97% случаев [9]. В Китае в 2018 г. около 57,6% экологических изолятов обладали 57 фенотипами множественной лекарственной устойчивости [10]; 99% штаммов V. cholerae в Индии были устойчивы более чем к двум антибиотикам [11].

С целью выявления сходств и различий между штаммами мы провели их ПЦР-генотипирование по 14 генам-мишеням, в результате чего штаммы распределились на 5 генотипов (А1–А5), соответствующих определённым территориям (см. табл. 1). Так, штаммы холерного вибриона, выделенные в 2020 г. в Ростовской области, были отнесены к двум генотипам ― А1 и А2. В Иркутской области и Забайкальском крае штаммы V. cholerae О1 имели генотипы А3 и А5, а также А3 и А4 соответственно. Самым распространённым оказался генотип А3, который был выявлен у 13 штаммов, изолированных из объектов окружающей среды на 6 административных территориях России (Республики Бурятия, Татарстан, Удмуртия, Иркутская область, Забайкальский и Приморский края). Данный генотип характеризовался наличием генов системы секреции третьего типа, а также генов активатора и активного домена MARTX и маннозочувствительных пилей адгезии; остальные гены были представлены в различных сочетаниях (табл. 2).

 

Таблица 2. Генетическая характеристика штаммов холерных вибрионов О1 Эль-Тор, входящих в генотип А3

Table 2. Genetic characteristics of Vibrio cholerae strains О1 El Tor, included in the A3 genotype

Административная территория

№ штамма

Серовар

Фаголизабельность фаг Эль-Тор

Генотип

rstA

tcpAelt

int

nanH

vce

rtxC

acd-rtxA

acd-vgrG1

pbd-vgrG3

vasK

vcsN2

vspD

mshA

stn/sto

Подгруппа

Иркутская область

1-20

Инаба

ДРТ

А3

-

-

+

+

-

+

+

-

+

+

+

+

+

-

I

Забайкальский край

100

Инаба

отр.

II

Иркутская область

2-20

Инаба

ДРТ

I

Республика Татарстан

50863

Инаба

ДРТ

Удмуртская Республика

177

Инаба

отр.

II

Забайкальский край

2336

Инаба

ДРТ

I

Республика Бурятия

1557

Инаба

ДРТ

Удмуртская Республика

51

Инаба

отр.

II

Удмуртская Республика

8/24Б

Инаба

отр.

Удмуртская Республика

9/24Б

Инаба

отр.

Удмуртская Республика

12/24Б

Инаба

отр.

Приморский край

541в-2020

Инаба

отр.

Республика Татарстан

10349

Огава

ДРТ

III

Примечание. ДРТ ― диагностический рабочий титр.

Note. ДРТ ― diagnostic working title.

 

Однако при проведении комплексного изучения биологических свойств путём распределения изолятов V. cholerae O1 на группы по критерию отличительных признаков (фенотипических и генотипических) установлено их распределение на 3 подгруппы:

  • I ― чувствительность к фагу Эль-Тор в диагностическом рабочем титре (ДРТ), принадлежность к серовару Инаба, генотип А3;
  • II ― устойчивость к фагу Эль-Тор, принадлежность к серовару Инаба, генотип А3;
  • III ― чувствительность к фагу Эль-Тор в ДРТ, принадлежность к серовару Огава, генотип А3.

Обсуждение

Таким образом, в пределах выявленных генотипов штаммы обладали индивидуальными особенностями. Возможно, это есть проявление генетических рекомбинаций, активно происходящих в водных экосистемах [4]. Холерные вибрионы способны изменять свой геном для структурирования метаболических процессов, развития лекарственной устойчивости, изменения патогенных и других признаков, которые позволяют быстро адаптироваться к неблагоприятным условиям окружающей среды [12]. Имеются сообщения о постоянной смене генетических линий V. cholerae O1, циркулирующих в Калькутте (Индия) [13].

Сопоставив характеристики вибрионов по профилям антибиотикорезистентности, территориям выделения и ПЦР-генотипам, мы сделали вывод, что в пределах одного генотипа V. cholerae О1 El Tor, принадлежащих к разным территориям, могут обладать как одинаковой, так и разной чувствительностью. Так, штаммы генотипа А3 с фенотипом FurrTmpSmzAp изолированы в Приморском крае, Татарстане и Удмуртии. В то же время один штамм А3 из Удмуртской Республики обладал фенотипом FurrTmpSmz, а из Республики Татарстан ― фенотипом Furr. Особенно отличались профили резистентности изолятов генотипа А3 из Забайкальского края и Республики Бурятии: эти штаммы обладали максимальным числом маркеров устойчивости (6), включая цефтриаксон и налидиксовую кислоту (см. табл. 1).

Фенотипы (Furr и FurrTmpSmz), аналогичные тем, которые были характерны для штаммов генотипа А3, выявлены и у вибрионов из Ростовской области, которые являлись самыми многочисленными в данном исследовании (9) и принадлежали к генотипам А1 или А2 (см. табл. 1).

Заключение

В проведённом исследовании выявлено генотипическое разнообразие изолированных штаммов, вариабельность маркеров резистентности, появление одних и утрата других в короткий промежуток времени даже в одном регионе, что свидетельствует как об изменениях в популяции холерного вибриона, так и о возможности циркуляции различных гено- и фенотипов, что подчёркивает важность постоянного наблюдения за данными патогенами.

Дополнительная информация

Источник финансирования. Авторы заявляют об отсутствии внешнего финансирования при проведении исследования.

Funding source. This study was not supported by any external sources of funding.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Competing interests. The authors declare that they have no competing interests.

Вклад авторов. Все авторы подтверждают соответствие своего авторства международным критериям ICMJE (все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией).

Authors’ contribution. All authors made a substantial contribution to the conception of the work, acquisition, analysis, interpretation of data for the work, drafting and revising the work, final approval of the version to be published and agree to be accountable for all aspects of the work.

×

About the authors

Nadechda Selynskaya

The Federal Government Health Institution Rostov-on-Don Plague Control Researsh Institute of the Federal Service for Surveillance in the Sphere of Consumers Rights Protection and Human Welfare

Email: ppdn@inbox.ru
ORCID iD: 0000-0002-0008-4705
SPIN-code: 7920-3340

MD, Cand. Sci. (Med.)

Russian Federation, 117/40 M. Gorkij street, 344002 Rostov-on-Don

Daria Alexandrovna Levchenko

The Federal Government Health Institution Rostov-on-Don Plague Control Researsh Institute of the Federal Service for Surveillance in the Sphere of Consumers Rights Protection and Human Welfare

Email: levchenko_da@antiplague.ru
ORCID iD: 0000-0002-4676-0377
SPIN-code: 7896-9092

MD, Cand. Sci. (Med.)

Russian Federation, 117/40 M. Gorkij street, 344002 Rostov-on-Don

Liana Egiazarjan

The Federal Government Health Institution Rostov-on-Don Plague Control Researsh Institute of the Federal Service for Surveillance in the Sphere of Consumers Rights Protection and Human Welfare

Email: caturyanliana@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-6350-065X
SPIN-code: 1300-9523

младший научный сотрудник лаборатории биологической безопасности и лечения ООИ

Russian Federation, 117/40 M. Gorkij street, 344002 Rostov-on-Don

Nina Pasyukova

The Federal Government Health Institution Rostov-on-Don Plague Control Researsh Institute of the Federal Service for Surveillance in the Sphere of Consumers Rights Protection and Human Welfare

Author for correspondence.
Email: ppdn@inbox.ru
ORCID iD: 0000-0002-1525-5693
SPIN-code: 9950-9439

научный сотрудник лаборатории  экспериментально-биологических моделей

Russian Federation, 117/40 M. Gorkij street, 344002 Rostov-on-Don

References

  1. Moehling TJ, Lee DH, Henderson ME, et al. A smartphone-based particle diffusometry platform for sub-attomolar detection of Vibrio cholerae in environmental water. Biosens Bioelectron. 2020;167:112497. doi: 10.1016/j.bios.2020.112497
  2. Ali M, Nelson AR, Lopez AL, Sack D. Updated global burden of cholera in endemic countries. PLoS Negl Trop Dis. 2015; 9(6):e0003832. doi: 10.1371/ journal.pntd.0003832
  3. Wozniak RA, Waldor MK. Integrative and conjugative elements: mosaic mobile genetic elements enabling dynamic lateral gene flow. Nat Rev Microbiol. 2010;8(8):552–563. doi: 10.1038/nrmicro2382
  4. Mavian C, Paisie TK, Alam MT, et al. Toxigenic Vibrio cholera evolution and establishment of reservoirs in aquatic ecosystems. Proc Natl Acad Sci USA. 2020;117(14):7897–7904. doi: 10.1073/pnas.1918763117
  5. Moskvitina EA, Yanovich EG, Kurilenko ML, et al. Cholera: monitoring of epidemiological situation around the world and in Russia (2010–2019). Forecast for 2020. Problems of Particularly Dangerous Infections. 2020;(2):38–47. (In Russ). doi: 10.21055/0370-1069-2020-2-38-47
  6. Guidelines 4.2.2495-09 Determination of the sensitivity of pathogens of dangerous bacterial infections (plague, anthrax, cholera, tularemia, brucellosis, sap, melioidosis) to antibacterial drugs. Moscow; 2009. 59 р. (In Russ).
  7. Kruglikov VD, Levchenko DA, Vodopyanov AS, Nepomnyashchaya NB. PCR genotyping of non-toxigenic Vibrio cholerae strains as one of approaches to their actualization in terms of epidemiological surveillance of cholera. Epidemiology and Infectious Disease. Current Issues. 2018;(2):28–35. (In Russ). doi: 10.18565/epidem.2018.2.28-35
  8. Selyanskaya NA, Egiazaryan IA, Ezhova MI, et al. Analysis of antibiotic resistance of Vibrio cholerae isolated from environmental objects in Russia in 2019. Antibiotics and chemotherapy. 2021;66 (3-4):4–11. (In Russ). doi: 10.37489/0235-2990-2021-66-3-4-4-11
  9. Abana D, Gyamfi E, Dogbe M, et al. Investigating the virulence genes and antibiotic susceptibility patterns of Vibrio cholerae O1 in environmental and clinical isolates in Accra, Ghana. BMC Infect Dis. 2019;19(1):76. doi: 10.1186/s12879-019-3714-z
  10. Fu H, Yu P, Liang W, et al. Virulence, resistance, and genomic fingerprint traits of vibrio cholerae isolated from 12 species of aquatic products in shanghai, China. Microb Drug Resist. 2020;26(12):1526–1539. doi: 10.1089/mdr.2020.0269
  11. Verma J, Bag S, Saha B, et al. Genomic plasticity associated with antimicrobial resistance in Vibrio cholerae. Proc Natl Acad Sci USA. 2019;116(13):6226–6231. doi: 10.1073/pnas.1900141116
  12. Das B, Verma J, Kumar P, et al. Antibiotic resistance in Vibrio cholerae: Understanding the ecology of resistance genes and mechanisms. Vaccine. 2020;38(Suppl 1):A83–A92. doi: 10.1016/j.vaccine.2019.06.031
  13. Imamura D, Morita M, Sekizuka T, et al. Comparative genome analysis of VSP-II and SNPs reveals heterogenic variation in contemporary strains of Vibrio cholerae O1 isolated from cholera patients in Kolkata, India. PLoS Negl Trop Dis. 2017; 11(2):e0005386. doi: 10.1371/journal.pntd.0005386

Supplementary files

Supplementary Files
Action
1. Fig. Sensitivity to antibacterial drugs of Vibrio cholerae cultures El Tor, allocated in 2020.

Download (144KB)

Copyright (c) 2020 Eco-vector



This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies