APPLICATION OF ELISA-IGM (MAC-ELISA) FOR DETERMINING ETIOLOGICAL LINK VIRUS TYPES IN CONCRET CASES OF THE DISEASE

Full Text

Введение Лихорадка денге (ЛД), занимающая по числу регистрируемых случаев заболевания 1-е место среди других арбовирусных инфекций, широко распространена в тропических и субтропических регионах мира. Существует 4 вируса денге (которые часто называют типами, серотипами или генотипами): денге-1, денге-2, денге-3 и денге-4 (семейство Flaviviridae, род Flavivirus) [1]. Гомология по нуклеотидным последовательностям между ними составляет 60-80% [2-4]. Каждый тип вируса денге вызывает у реконвалесцентов длительную (возможно, пожизненную) невосприимчивость к гомологичному возбудителю, но только кратковременный иммунитет (2-3 мес) против гетерологичных вирусов денге [1, 5]. Известны различные формы клинического течения этой болезни: классическая лихорадка денге, геморрагическая лихорадка денге (ГЛД) и ГЛД с шоковым синдромом (ШСД). Риск развития ГЛД и ШСД возрастает при вторичном заражении гетерологичным вирусом денге или другими флавивирусами за счет антителозависимого феномена [4, 6], поэтому определение типов вируса денге, циркулирующих на эндемичных территориях, имеет значение для прогнозирования характера вспышек и эпидемий ЛД в тропических и субтропических регионах. Задача настоящего исследования заключалась в изучении эффективности методов ИФА-IgM (МАС-ELISA) и ОТ-ПЦР для идентификации типов вируса денге, вызвавшего конкретные случаи этого заболевания. Материалы и методы 105 сывороток крови больных ЛД (n = 101), госпитализированных в Инфекционную клиническую больницу № 1 Москвы после возвращения в Россию из тропических стран, были обследованы методами ИФА-IgM в лаборатории биологии и индикации арбовирусов ФНИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи, а 21 проба из этих 105 - методом ОТ-ПЦР в ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора. Метод ИФА-IgM. Обследование сывороток на специфические IgM антитела к вирусам денге проводили методом ИФА (MAC-ELISA) [3] с использованием моноспецифических тест-систем, включающих специфические антигены каждого из 4 типов вируса, а также нормальные (контрольные) антигены, анти-поли-денге-пероксидазный конъюгат (приготовленный из иммуноглобулина, полученного из асцитных жидкостей мышей, иммунизированных 4 типами вируса денге). Статистические методы. Статистическую значимость различий относительных показателей проводили с использованием критерия χ2 Пирсона при уровне значимости p = 0,05 по формуле: r c (Oij - Eij)2 χ2 = ∑ ∑---------, i = 1 j = 1 Eij где i - номер строки (от 1 до r), j - номер столбца (от 1 до с), Oij - фактическое количество наблюдений в ячейке ij, Eij - ожидаемое число наблюдений в ячейке ij. Результаты и обсуждение Все 105 использованных в работе сывороток, по данным предварительного тестирования в поливалентной ИФА-IgM [3], содержали группоспецифичные антитела класса М к вирусам денге. 65 из этих проб (1-я группа) были взяты в период с 1-го до 7-го дня заболевания (61,9%), остальные 40 сывороток (2-я группа) - в период с 8-го до 25-го дня болезни (38,1%). В 1-й группе тип вируса денге, вызвавшего заболевание (по величине оптической плотности (ОП)), был установлен при обследовании 19 (29,2%) сывороток, в которых ОП в лунках с антигеном одного из 4 типов превышала ОП с остальными 3 типами в 2 и более раз. По этим данным, 7 (36,8%) больных были инфицированы вирусом денге-1, 8 (42,1%) - денге-2; 2 (10,5%) - денге-3 и 2 (10,5%) - денге-4 (табл. 1). Во 2-й группе специфичность антител в отношении одного из типов вирусов денге по величине ОП удалось определить в 11 сыворотках (27,5%). В этой группе заболевание пациентов оказалось связанным с вирусами денге-1 (в 4 случаях, 36,4%), с денге-3 (в 4 случаях, 36,4%) с денге-4 (в 3 случаях, 27,3%) (табл. 2). В 46 сыворотках 1-й группы, содержащих группоспецифичные IgM к вирусам денге (по величине ОП), были определены титры антител в моновалентных ИФА-IgM тест-системах, что позволило дополнительно установить этиологическое значение двух типов денге в 8 (17,4%) случаях. В 5 из них (10,9%) установлено значение вируса денге-1, в 3 (6,5%) - денге 3. Среди сывороток, взятых в более поздний период болезни (с 8-го дня и позднее), одна сыворотка (1181; 2,5%) специфически реагировала с антигеном вируса денге-1 (табл. 3) При обследовании парных сывороток больного с антигеном одного типа вируса денге избирательно реагировала 1-я проба, взятая на 2-й день болезни. На 7-й день болезни наблюдался группоспецифический ответ с антигенами всех 4 вирусов денге (табл. 4). В итоге обследования 105 сывороток крови больных ЛД в моноспецифичных ИФА-IgM тест-системах (по результатам сравнения показателей ОП) в 39 (37,1%) случаях удалось идентифицировать типы вируса денге, вызвавшие заболевание. При обследовании 65 сывороток, взятых в первые 7 дней болезни, и 40 сывороток, взятых в период от 8-го до 25-го дня после начала заболевания, этиологическое значение одного из вирусов денге 1-го, 2-го, 3-го и 4-го типов (с учетом показателей ОП и титров антител) установлено в 41,5 и 30% случаев соответственно (табл. 5). При статистической оценке результатов в сыворотках, взятых на 1-7-й и 8-25-й день болезни, с использованием критерия χ2 значимых (достоверных) различий выявлено не было (p > 0,05). Результаты обследования 66 из 105 сывороток не позволили идентифицировать типы вирусов денге, которыми были инфицированы больные ЛД. В 7 (10,6%) из этих проб выявлялись группоспецифические антитела к 2 типам вирусов денге, в 11 (16,7%) - к 3, в 48 (72,7%) - к 4. 23 сыворотки крови больных были обследованы параллельно методом ОТ-ПЦР и ИФА-IgM. РНК вирусов была обнаружена в 21 пробе (92%), полученной на 3-13-й дни болезни. РНК-изоляты были идентифицированы как денге-1 (в 13 случаях; 61,9%), денге-2 (в 2 случаях; 9,5%), денге-3 (в 6 случаях; 28,6%). Результаты тестирования 2 образцов, взятых на 7-й день болезни, оказались отрицательными. Результаты идентификации типов вирусов денге, полученные при обследовании 21 РНК-позитивной пробы сыворотки методом ИФА-IgM (в моновалентном варианте), совпали в 14 (66,7%) случаях. В 3 случаях (сыворотки №№ 3, 2114, 2080) изоляты РНК были интерпретированы как денге-1, хотя данные ИФА-IgM указывали на этиологическое значение вирусов денге 3-го и 4-го типов. При обследовании в ИФА-IgM сывороток №№ 4, 2115, 2128, 2141 выявлялись группоспецифические ответы антител, указывающие на возможное значение разных типов вирусов денге: 1, 2, 3, 4; 1, 2, 3; 1, 3; 1, 2, 3, изоляты РНК, полученные из этих проб типированы как денге-1 (табл. 6). Заключение Представленные результаты свидетельствуют о возможности идентификации типа вируса - этиологического агента лихорадки денге в среднем в 37,1% случаев при обследовании сывороток больных (взятых с 1-го по 23-й дни заболевания) в моновалентных ИФА-IgM тест-системах. Статистически достоверной разницы в специфичности IgM антител к 4 типам вирусам денге при обследовании сывороток, взятых на 1-7-й или 8-25-й дни после начала болезни, не выявлено. Максимальная эффективность определения этиологической роли конкретного генотипа вируса денге (91,3%) отмечалась при обследовании сывороток крови больных лихорадкой денге (полученных на 3-13-й день заболевания) методом ОТ-ПЦР. При тестировании РНК-позитивных проб совпадение результатов ОТ-ПЦР и ИФА-IgM наблюдалось в 66,7% случаев.

About the authors

Yuliya A. Akinshina

ZAO «ECOlab»

Email: akinshina.opr@mail.ru
microbiologist of development department of ZAO «EСOlab» 142530, Electrogorsk, Russion Federation

V. F Larichev

The N.F. Gamaleya Federal Research Center for Epidemiology and Microbiology, The D.I.Ivanovsky Institute of Virology

Email: arboelisa@mail.ru
12309818, Moscow, Russion Federation

M. A Sayfullin

Сlinical Infectious Diseases Hospital № 1 of the Department of Health care of Moskow

Email: dr_saifullin@mail.ru
123367, Moscow, Russion Federation

S. G Mardanly

ZAO «ECOlab»

Email: ekolab-president@mail.ru
142530, Electrogorsk, Russion Federation

A. M Butenko

The N.F. Gamaleya Federal Research Center for Epidemiology and Microbiology, The D.I.Ivanovsky Institute of Virology

12309818, Moscow, Russion Federation

References

Supplementary files