COMPARISON OF THE APPLICATION OF DOMESTIC «ELISA-IGM-DENGUE» KIT, DELIVERED IN THE D.I. IVANOVSKY INSTITUTE OF VIROLOGY (MOSCOW, RUSSIAN FEDERATION) AND «ANTI-DENGUE VIRUS ELISA IGM» KIT (EUROIMMUN, GERMANY) FOR THE SERODIAGNOSIS OF DENGUE FEVER

Full Text

Введение Специфическая диагностика лихорадки денге (ЛД) основана на обнаружении вируса, РНК, антигенов и специфических иммуноглобулинов в сыворотке крови больных [1, 2]. Вирусологические и молекулярно-генетические методы диагностики могут быть эффективно использованы в ранний (лихорадочный) период заболевания. Начиная с 3-5-го дня болезни и в течение примерно 2 мес успешно применяют иммуноферментный анализ, позволяющий выявлять специфические IgM [3]. Модификации метода ИФА-IgM (в первую очередь MAC-ELISA) характеризуются специфичностью, чувствительностью, быстротой получения результата и относительной экономичностью [4, 5]. Подобные отечественные тест-системы в настоящее время еще не сертифицированы. Среди зарубежных диагностикумов в России зарегистрированы наборы фирмы Euroimmun (Германия). Однако доступные данные об их применении в нашей стране отсутствуют. Цель работы заключалась в оценке результатов сравнительного применения экспериментальных ИФА-IgMтест-систем производства НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского и фирмы Euroimmun для диагностики ЛД. Материал и методы Методом ИФА-IgM (МАС-ELISA) обследованы 88 сывороток от 86 больных ЛД, госпитализированных в Инфекционную клиническую больницу № 1 Москвы после возвращения из эндемичных тропических стран. В работе использовали тест-систему НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского “ИФА-IgM-денге” (MAC-ELISA) [8]. В лунках полистиролового планшета сорбировали козьи антитела IgG против µ-цепи иммуноглобулина человека. Затем последовательно вносили обследуемые сыворотки, сахарозо-ацетоновый (поливалентный) антиген вируса денге (или нормальный контрольный антиген из мозга неинфицированных новорожденных белых мышей) и анти-поли-денге пероксидазный конъюгат специфического иммуноглобулина, полученного из гипериммунных асцитных жидкостей мышей, иммунизированных четырьмя типами вируса денге. Результаты ИФА регистрировали, измеряя оптическую плотность (ОП) при двух длинах волн - 450 и 620-650 нм. Реакцию считали положительной, если отношение ОП опытных и контрольных образцов составляло ≥3,0 (при ОП ≥ 0,3 для опытных образцов и ≤0,2 в контроле). Образцы с ОП ˃ 0,35 учитывали как положительные. Во всех обследованных сыворотках определяли титры специфических IgM-антител к вирусам денге. Определение специфических IgG-антител к вирусам денге и Западного Нила (ЗН) проводили методом ИФА-IgG [6] в полистироловых планшетах с сорбированными поликлональными мышиными противовирусными антителами IgG. Остальные реагенты вносили в следующей последовательности: специфичный вирусный антиген (или нормальный антиген в качестве контроля), обследуемые сыворотки, мышиные антитела против иммуноглобулинов IgG человека, меченные пероксидазой хрена. Результаты учитывали и интерпретировали так же, как при постановке MAC-ELISA. Тест-система Anti-Dengue Virus ELISA (IgM) производства фирмы Euroimmun основана на методе непрямого ИФА (Indirect-ELISA). В лунках иммуносорбента иммобилизирован цельновирионный лизатный антиген вируса денге 2-го типа, который связывает специфические антитела к вирусу денге. Инкубация с антивидовым конъюгатом (анти-IgM человека, меченые пероксидазой хрена) выявляет специфические IgM по цветной реакции с субстратом. Все сыворотки крови разводят в буферном растворе, содержащем RF-absorbent, и инкубируют в течение 10 мин при комнатной температуре до внесения их в лунки планшета. Качественный учет результатов проводят путем сравнения ОП исследуемой сыворотки с ОП сыворотки-калибратора cut-off, входящей в состав набора. Сыворотки со значением ОП ˂ ОП cut-off считают отрицательными, сыворотки со значением ОП ˃ ОП cut-off - положительными. Полуколичественный учет результатов предусматривает определение коэффициента (Ratio) для каждой сыворотки крови; его высчитывают по формуле: ОП исследуемого образца/ОП сыворотки-калибратора = Ratio. Производитель рекомендует интерпретировать результаты реакции следующим образом: Ratio < 0,8 - отрицательный результат; Ratio = 0,8-1,1 - сомнительный результат; Ratio ≥ 1,1 - положительный результат. Контрольные сыворотки крови больных гетерогенными вирусными инфекциями и методы их обследования. Для оценки специфичности двух сравниваемых тест-систем обследованы 53 сыворотки крови больных, содержащие IgM антитела к цитомегаловирусу (ЦМВ) (n = 43), к вирусам Эпштейна Барр (ВЭБ) (n = 6), простого герпеса (n = 2) и краснухи (n = 2). Для этой цели использовали следующие иммуноферментные тест-системы производства ЗАО «ЭКОлаб» (Электрогорск): набор реагентов «ИФА-Краснуха-IgМ», тест-система иммуноферментная для выявления антител класса М к вирусу краснухи № ФСР 2012/13239 от 20.03.2012; набор реагентов «ИФА-ЦМВ-IgМ», тест-система иммуноферментная для выявления антител класса M к ЦМВ № ФСР 2007/01444от 17.12.2007; набор реагентов «ИФА-ВПГ 1+2-IgM», тест-система иммуноферментная для выявления антител класса M к вирусу простого герпеса 1-го и 2-го типа № ФСР 2007/01443 от 17.12.2007. Контрольные сыворотки от больных ВЭБ обследованы в тест-системе «ВектоВЭБ-VCA-IgМ» - наборе реагентов для иммуноферментного выявления иммуноглобулинов класса М к капсидному антигену VCA ВЭБ в сыворотке (плазме) крови, производства ЗАО «Вектор-Бест», РУ № РЗН 2013/1279. Результаты Были обследованы в экспериментальной тест-системе «ИФА-IgM-денге» и в тест-системе Anti-Dengue Virus ELISA (IgM) производства фирмы Euroimmun 88 сывороток крови больных ЛД, госпитализированных после возвращения из эндемичных регионов. В тест-системе «ИФА-IgM-денге» во всех 88 сыворотках крови больных ЛД обнаружены специфические антитела класса M с титрами от 1:100 до 1:25 600. При обследовании тех же проб в тест-системе Anti-Dengue Virus ELISA (IgM) выявлены 80 положительных сывороток, 2 сомнительных и 6 отрицательных (90; 2,3 и 6,8% соответственно). Три из них (№ 2151, 2137, 2090) содержали высокие концентрации антител класса М в системе «ИФА-IgM-денге» (табл. 1). Для подтверждения специфичности результатов обнаружения антител IgM, полученных при использовании набора «ИФА-IgM-денге», 6 сывороток, отрицательных в тест-системе фирмы Euroimmun, были обследованы в экспериментальных тест-системах «ИФА-IgG-денге» и «ИФА-IgG-ЗН» НИИ вирусологии - во всех случаях с положительными результатами. Причем титры IgG, выявляемые с антигенами вирусов денге, превышали титры антител, реагирующих с антигеном вируса ЗН, в 4 и более раз (табл. 1, 2). С целью определения соотношения между титрами антител IgM в сыворотках крови больных, определяемых в тест-системе «ИФА-IgМ-денге», и значениями коэффициента (Ratio), выявляемыми в наборе Anti-Dengue Virus ELISA (IgM), 80 проб сывороток были разделены на 3 группы в соответствии с титрами IgM-антител в системе «ИФА-IgM-денге»: 1) 10 слабоположительных образцов с титрами от 1:100 до 1:800; 2) 31 сыворотка с титрами от 1:1600 до 1:3200; 3) 39 высокоактивных сывороток с титрами, достигающими значения 1:25 600. Показатели Ratio для большинства сывороток с низкими титрами оказалось в пределах 1,1-3. У сывороток со средними титрами - в диапазоне от 2,1 до 5. Максимальные значения Ratio (от 5,1 до 7) наблюдали при обследовании 20 сывороток (50,3%) с наиболее высокими титрами, выявляемыми в экспериментальной тест-системе «ИФА-IgM-денге» (табл. 3). На фоне такой общей картины среди низкоактивных сывороток (с титрами IgM 1:100-1:800) были обнаружены 2 пробы (20%) с высокими показателями Ratiо (3,1-5). Для оценки специфичности 2-х сравниваемых тест-систем были обследованы 53 сыворотки крови больных гетерогенными вирусными инфекциями, содержащие специфические IgM-антитела к ЦМВ (n = 43), к ВЭБ (n = 6), простого герпеса (n = 2) и краснухи (n = 2). В «ИФА-IgM-денге» из 53 этих контрольных сывороток 51 проба (96,2%) оказалась отрицательной и 2 (3,8%) - ложноположительными (неспецифически взаимодействовали с нормальным антигеном); в тест-системе Anti-Dengue Virus ELISA (IgM) 36 сывороток (67,9%) - отрицательными, 7 (13,2%) - сомнительными (от больных ЦМВ и ВЭБ), 10 (18,9%) - положительными (от больных ЦМВ), при этом 3 из них с Ratio ≥ 3. В общей сложности из 53 контрольных проб 17 (32,1%), тестированных в наборе фирмы Euroimmun, были ложноположительными или сомнительными (табл. 4). Заключение Представленные результаты свидетельствуют о меньшей чувствительности ИФА-тест-систем Anti-Dengue Virus ELISA (IgM) фирмы Euroimmun по сравнению с диагностикумом «ИФА-денге-IgM» экспериментального производства НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского. При обследовании 88 сывороток крови больных лихорадкой денге с использованием наборов НИИ вирусологии выявлено 100% проб, содержащих IgM-антитела к вирусам денге и 91% позитивных проб (n = 80) в наборе Euroimmun. Наличие ложноположительных и сомнительных результатов при обследовании сывороток крови больных гетерогенными вирусными инфекциями (32,1%) указывает также на недостаточную специфичность германской тест-системы.

About the authors

Yu. A Akinshina

ZAO «ECOlab»

Email: akinshina.opr@mail.ru
1, Budennogo str., Electrogorsk, 142530, Russian Federation

V. F Larichev

N.F. Gamaleya Federal Research Center for Epidemiology and Microbiology, The D.I. Ivanovsky Institute of Virology

Email: arboelisa@mail.ru
18, Gamalei str., Moscow, 123098, Russian Federation

M. A Saifullin

Сlinical Infectious Diseases Hospital No 1

Email: dr_saifullin@mail.ru
63, Volokolamskoye Sh., Moscow, 123367, Russian Federation

S. G Mardanly

ZAO «ECOlab»

Email: ekolab-president@mail.ru
1, Budennogo str., Electrogorsk, 142530, Russian Federation

A. M Butenko

N.F. Gamaleya Federal Research Center for Epidemiology and Microbiology, The D.I. Ivanovsky Institute of Virology

18, Gamalei str., Moscow, 123098, Russian Federation

References