Detection and analysis of integrative conjugative elements in Vibrio spp. strains, isolated in the Volgograd region

Full Text

Представители рода Vibrio широко распространены в морских средах и пресноводных водоемах. Возможность вибрионов занимать различные ниши обитания - свидетельство их высокого адаптационного потенциала [1]. Важный фактор в этом процессе у вибрионов - горизонтальный перенос генов, представляющий собой механизм передачи ДНК из одной бактериальной клетки в другую без необходимости деления клеток [2-4]. Привне- сенная ДНК интегрирует в геном реципиента как путем гомологичной рекомбинации, так и посредством мобильных генетических элементов [5], что обеспечивает ее стабильное наследование. Ранее считали, что детерминанты резистентности к антибиотикам имеют у вибрионов исключительно внехромосомную локализацию. Однако в 1992 г. во время крупной вспышки холеры в Индии в клиническом изоляте V. cholerae MO10 новой O139 серогруппы обнаружен хромосомный конъюгатив- ный генетический элемент, названный SXTMO10, на котором были локализованы гены резистентности к сульфометаксазолу (Su), триметоприму (Tm), хлорамфениколу (Cm) и стрептомицину (Sm) [6]. оригинальные исследования В настоящее время для идентифицированных до 2006 г. интегративных конъюгативных элементов (ICE) используют устоявшиеся названия, а для вновь описываемых элементов данного типа принята универсальная номенклатура: префикс ICE, аббревиатура вида происхождения элемента, три буквы названия страны выделения и количество генов резистентности [7]. Консервативные последовательности ICEs представлены генами, участвующими в интеграции/ вырезании, конъюгативном переносе и регуляторных процессах. Кроме того, все известные ICEs содержат вариабельную ДНК, придающую эле- ментспецифические свойства. Среди функций, кодируемых в вариабельной ДНК ICEs, - устойчивость к антибиотикам и тяжелым металлам, регулирование образования биопленки и подвижности [7]. Кроме того, гены вариабельной ДНК, по-видимому, участвуют в модификации ДНК, рекомбинации и репарации, кодируя разнообразные системы рестрикции-модификации, геликазы и эндонуклеазы. Такие гены могут обеспечивать защиту от инвазий чужеродных ДНК, в том числе фаговой инфекции, и/или содействовать целостности генома ICE в процессе его конъюгативной передачи [8]. Последовательности праймеров, использованных в работе Праймер Последовательность 5-3' Мишень (ссылка) SXT-F TTATCGTTTCGATGGC Ген интегразы int SXT элемента (accession AF099172) SXT-B GCTCTTCTTGTCCGTTC sulII-F GTGCGGATGAAGTCAGCTCC Ген устойчивости к сульфаметоксазолу sulII (accession AY034138) sulII-R GGGGGCAGATGTGATCGAC strB-F CGCGATAGCTAGATCGCGTT Ген устойчивости к стрептомицину strB (accession AY034138) strB-R GACTACCAGGCGACCGAAAT dfr18-F CTGCCGTTTTCGATAATGTGG Ген дигидрофолатредуктазы dfr18 (accession AY034138) dfr18-R GGGTAAGACACTCGTCATGGG dfrA1-F AGTTTACATCTGACAATGAGAACGTAT Ген дигидрофолатредуктазы dfrAl (accession GQ463140) dfrA1-R ACCCTTTTGCCAGATTTGGTA ICEs семейства SXT/R391 широко распространены в штаммах рода Vibrio, выделенных как от больных, так и из воды открытых водоемов и обычно ассоциированы с мультирезистентностью к целому ряду антибактериальных препаратов [9]. Ранее нами было показано наличие различных типов SXT в составе геномов штаммов V. cholerae О1 и О139 серогрупп, выделенных в 1990-е годы на территории Волгоградской области [10]. Известно, что многие виды рода Vibrio могут служить источником для холерных вибрионов новых, ранее не встречаемых у них комбинаций генов устойчивости к антимикробным соединениям [4]. В связи с этим было логично оценить распространенность данных генетических элементов среди автохтонной вибриофлоры региональных открытых водоемов. Материалы и методы В работе исследованы 136 штаммов V ^olerae non-O1/non-O139 серогрупп (из них три клинических изолята) и 43 штамма Vibrio spp., не относящихся к виду V ^olerae, выделенных на территории Волгоградской области в период 2003-2014 гг. Культуры выращивали на щелочном агаре (pH 7,8) при 37°С в течение 18-20 ч. Выделение ДНК проводили методом протеиназного лизиса [11]. Праймеры, использованные в работе, представлены в таблице. Амплификацию мишеней проводили: в мультилокусном формате на амплификаторе C1000 (Bio-Rad) при параметрах: 95 oC - 3 мин, 35 циклов (94 oC - 1 мин, 60,4 oC - 1 мин, 72oC - 1 мин), финальная элонгация при 72 oC - 10 мин; в монолокусном формате: 95 oC - 3 мин, 35 циклов (94 oC - 30 с, Т oC - 30 с, 72 oC - 30 с), 72 oC - 5 мин, где T - температура отжига праймеров (sulII F/R и strB F/R - 61,8 oC; dfr18 F/R - 60,4 oC; dfrA1 F/R - 57,8 oC). Продукты ПЦР анализировали с помощью электрофореза в 1,5% агарозном геле и визуализировали окрашиванием бромистым этидием. Результаты Скрининг исследуемых штаммов на наличие в составе их геномов последовательностей ICEs с использованием праймеров SXT-F/SXT-B, специфичных гену интегразы int SXT, показал наличие искомого гена у 60 штаммов V. ^olerae non-O1/non- O139 и у 25 штаммов Vibrio spp. Для дальнейшего анализа было отобрано 11 штаммов V ^olerae non- O1/non-O139, резистентных к двум и более антибиотикам, и 5 штаммов Vibrio spp., выделенных из разных точек отбора воды (для штаммов этой группы антибиотикограммы предварительно не исследовали) и показавших в ПЦР-скрининге специфические ампликоны наибольшей интенсивности. ORIGINAL INVESTIGATIONS Молекулярное типирование обнаруженных интегративных элементов проводили путем анализа структуры локусов вариабельной ДНК, несущих детерминанты резистентности к антибактериальным препаратам. Наличие генов резистентности в составе обнаруженных ICEs анализировали в форматах моно- и мультилокусной ПЦР с праймерами, специфичными к генам устойчивости к стрептомицину (strB), сульфаметоксазолу (sulII) и двум генам дигидрофолатредуктаз (dfr18 и dfrA1). У всех исследованных штаммов V ^olerae non-O1/non- O139 обнаружены фрагменты гена dfr18 ожидаемого размера 389 п.н. (см. рисунок, г). Кроме того, у штаммов 233 и 298-13 выявлены специфические ампликоны (515 п.н.) с праймерами strB (см. рисунок, в), а у штаммов 18/841 и 34-1 - фрагменты гена sulII (626 п.н.) (см. рисунок, а). Среди всех исследованных штаммов Vibrio spp. единственный штамм 287-9 содержал ген резистентности к триметоприму dfrA1 (ампликон размером 278 п.н.) (см. рисунок, б). Обсуждение Амплификация фрагментов генов резистентности в составе ICEs. Мультилокусная ПЦР с праймерами sulII F/R (626 п.н.), strB F/R (515 п.н.), dfr18 F/R (389 п.н.) и dfrA1 F/R (278 п.н.). а: 1 - V. ^olerae non-O1/O139 34-1; 2 - V. ^olerae non-O1/O139 18/841; М - ДНК-маркер (100-1000 п.н.). б: 1 - Vibrio spp. 270; 2 - Vibrio spp. 287-1; 3 - Vibrio spp. 287-9; 4 - Vibrio spp. 290-5; 5 - V cholerae О139 В191 (в качестве контроля); М - ДНК-маркер (100-1000 п.н.). Монолокусная ПЦР с праймерами strB F/R (В) и dfr18 F/R (Г): 1 - V cholerae non-O1/O139 127; 2 - V. cholerae non-O1/O139 135; 3 - V cholerae non-O1/ O139 162; 4 - V cholerae non-O1/O139 174; 5 - V. cholerae non-O1/O139 233; 6 - V. cholerae non-O1/O139 270-1; 7 - V cholerae non-O1/O139 298-13; 8 - V. cholerae non-O1/O139 305-3; М - ДНК-маркер (100-1000 п.н.). Вариабельные последовательности ICEs размером в диапазоне 30-60 т. п.н. находятся в основном в 5 горячих точках (HS, hot spot), обозначаемых HS1-HS5. Кроме того, некоторые ICEs также содержат вариабельную ДНК, встроенную за пределами горячих точек, в четырех вариабельных регионах (VR - variable region), обозначаемых VR I-VR IV [8]. Гены резистентности к антибиотикам сгруппированы вместе около 5'-конца элемента. Кластер генов резистентности к триметоприму (dfr18), хло- рамфениколу (floR), стрептомицину (strAB) и сульфометаксазолу (sulII) интегрирован в локус rumB ICE элемента и представляет собой транспозоно- подобную структуру, в которой гены резистентности фланкированы генами транспосаз - вариабельный регион VR III. Приведенный состав кластера генов резистентности характерен для ICEs типа SxtMO10 [12]. У элементов типа SXTET в кластере нет гена dfr18, а присутствует другой вариант гена дигидрофолатредуктазы - dfrA1, локализованный в HS3 вне основного кластера генов антибиотикоу- стойчивости, а также имеется ген резистентности к канамицину (kan) в горячей точке HS5 [12, 13]. Анализ вариабельного региона VR III обнаруженных ICEs V. ^olerae non-O1/non-O139 показал наличие интегрированного в локус rumB частичоригинальные исследования но делетированного кластера резистентности. Мы идентифицировали три варианта состава кластера: у 7 штаммов (127, 135, 162, 174, 270-1, 305-9 и 982) он был представлен только геном резистентности к триметоприму dfr18, у двух штаммов (233 и 29813) присутствовали детерминанты устойчивости к стрептомицину (strB) и триметоприму (dfr18), в двух штаммах (18/841 и 34-1) - dfr18 и sulII. Известно, что dfr18 специфичен для штаммов V. cholerae O139, в то время как dfrA1 специфичен для V cholerae O1 еl-Tor [13], т. е. описываемые ICEs штаммов V. ^olerae non-O1/non-O139 относят к типу SXTMO10. Ни в одном из ICEs исследованных штаммов Vibrio spp. кластера генов резистентности в составе VR III обнаружено не было. Известно, что его наличие не является маркерным признаком ICEs семейства SXT/R391. Так, ранее описаны элементы этого семейства - ICEVchMex1 из штамма V. cholerae неопределенной серогруп- пы, ICEVchHKO1 V. cholerae O139, ICEVflTha2 V. fluvalis V49 и ICEVvuTha1 V. vulnificus V268, в которых кластер резистентности отсутствовал [14, 12, 15]. Однако в ICE штамма Vibrio spp. 287-9 мы обнаружили вставку в HS3, содержащую ген резистентности к триметоприму dfrA1, характерный для SXTET штаммов V. cholerae O1. Интересно отметить, что из 24 штаммов V. cholerae non-O1/non-O139, выделенных в период 2003-2007 гг., только два (18/841 и 34-1) имели в составе генома интегративные конъюгативные элементы SXTMO1°-™m с частично делетирован- ными кластерами антибиотикорезистентности. В то же время среди штаммов V. ^olerae non-O1/ non-O139, выделенных через 10 лет, более 50% содержали ICEs также SXT^^-rara, но с иными вариантами состава кластера генов резистентности. Таким образом, полученные результаты дают основание сделать вывод о присутствии и достаточно быстром распространении среди видов вибриофлоры региональных открытых водоемов интегративных конъюгативных элементов семейства SXT/R391. Выявленная мозаичность структуры ICEs свидетельствует о высокой степени генетической изменчивости данных структурных элементов генома вибрионов, а также их потенциальной роли в формировании новых, адаптивно значимых генотипов микроорганизмов. Известно, что штаммы V. cholerae non-O1/ non-O139 могут служить источником для вибрионов эпидемически значимых серогрупп новых, ранее не встречаемых у них комбинаций генов устойчивости к антимикробным соединениям [4]. Ранее считали, что распространение генов резистентности - это их основная роль, однако в настоящее время очевидно, что ICEs могут быть посредником для передачи самого разнообразного набора функций, позволяющих бактериям быстро адаптироваться к новым условиям окружающей среды и колонизировать новые ниши. Учитывая, что ICEs могут быть вовлечены в механизмы горизонтальной передачи генетического материала, расширяющего эпидемический потенциал вибрионов (гены персистенции, патогенности и др.), дальнейшее изучение структуры и изменчивости данных генетических элементов - одна из актуальных задач молекулярно-генетического мониторинга за холерой и патогенными для человека вибрионами. Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки. Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

About the authors

Irina B. Zakharova

Volgograd Plague Control Research Institute of the Federal Service for Surveillance in the Sphere of Consumers Rights Protection and Human Welfare

Email: zib279@gmail.com
MD, PhD, Head of the Laboratory of Genomics and Proteomics of the Volgograd Plague Control Research Institute of the Federal Service for Surveillance in the Sphere of Consumers Rights Protection and Human Welfare 7, Golubiskaya str., Volgograd, 400012, Russian Federation

Yu. A Kuzyutina

Volgograd Plague Control Research Institute of the Federal Service for Surveillance in the Sphere of Consumers Rights Protection and Human Welfare

7, Golubiskaya str., Volgograd, 400012, Russian Federation

M. V Podshivalova

Volgograd Plague Control Research Institute of the Federal Service for Surveillance in the Sphere of Consumers Rights Protection and Human Welfare

7, Golubiskaya str., Volgograd, 400012, Russian Federation

A. A Zamarin

Volgograd Plague Control Research Institute of the Federal Service for Surveillance in the Sphere of Consumers Rights Protection and Human Welfare

7, Golubiskaya str., Volgograd, 400012, Russian Federation

A. V Toporkov

Volgograd Plague Control Research Institute of the Federal Service for Surveillance in the Sphere of Consumers Rights Protection and Human Welfare

7, Golubiskaya str., Volgograd, 400012, Russian Federation

D. V Viktorov

Volgograd Plague Control Research Institute of the Federal Service for Surveillance in the Sphere of Consumers Rights Protection and Human Welfare

7, Golubiskaya str., Volgograd, 400012, Russian Federation

References

Supplementary files