Детекция и анализ интегративных конъюгативных элементов в штаммах Vibrio spp., выделенных на территории Волгоградской области

Полный текст

Представители рода Vibrio широко распространены в морских средах и пресноводных водоемах. Возможность вибрионов занимать различные ниши обитания - свидетельство их высокого адаптационного потенциала [1]. Важный фактор в этом процессе у вибрионов - горизонтальный перенос генов, представляющий собой механизм передачи ДНК из одной бактериальной клетки в другую без необходимости деления клеток [2-4]. Привне- сенная ДНК интегрирует в геном реципиента как путем гомологичной рекомбинации, так и посредством мобильных генетических элементов [5], что обеспечивает ее стабильное наследование. Ранее считали, что детерминанты резистентности к антибиотикам имеют у вибрионов исключительно внехромосомную локализацию. Однако в 1992 г. во время крупной вспышки холеры в Индии в клиническом изоляте V. cholerae MO10 новой O139 серогруппы обнаружен хромосомный конъюгатив- ный генетический элемент, названный SXTMO10, на котором были локализованы гены резистентности к сульфометаксазолу (Su), триметоприму (Tm), хлорамфениколу (Cm) и стрептомицину (Sm) [6]. оригинальные исследования В настоящее время для идентифицированных до 2006 г. интегративных конъюгативных элементов (ICE) используют устоявшиеся названия, а для вновь описываемых элементов данного типа принята универсальная номенклатура: префикс ICE, аббревиатура вида происхождения элемента, три буквы названия страны выделения и количество генов резистентности [7]. Консервативные последовательности ICEs представлены генами, участвующими в интеграции/ вырезании, конъюгативном переносе и регуляторных процессах. Кроме того, все известные ICEs содержат вариабельную ДНК, придающую эле- ментспецифические свойства. Среди функций, кодируемых в вариабельной ДНК ICEs, - устойчивость к антибиотикам и тяжелым металлам, регулирование образования биопленки и подвижности [7]. Кроме того, гены вариабельной ДНК, по-видимому, участвуют в модификации ДНК, рекомбинации и репарации, кодируя разнообразные системы рестрикции-модификации, геликазы и эндонуклеазы. Такие гены могут обеспечивать защиту от инвазий чужеродных ДНК, в том числе фаговой инфекции, и/или содействовать целостности генома ICE в процессе его конъюгативной передачи [8]. Последовательности праймеров, использованных в работе Праймер Последовательность 5-3' Мишень (ссылка) SXT-F TTATCGTTTCGATGGC Ген интегразы int SXT элемента (accession AF099172) SXT-B GCTCTTCTTGTCCGTTC sulII-F GTGCGGATGAAGTCAGCTCC Ген устойчивости к сульфаметоксазолу sulII (accession AY034138) sulII-R GGGGGCAGATGTGATCGAC strB-F CGCGATAGCTAGATCGCGTT Ген устойчивости к стрептомицину strB (accession AY034138) strB-R GACTACCAGGCGACCGAAAT dfr18-F CTGCCGTTTTCGATAATGTGG Ген дигидрофолатредуктазы dfr18 (accession AY034138) dfr18-R GGGTAAGACACTCGTCATGGG dfrA1-F AGTTTACATCTGACAATGAGAACGTAT Ген дигидрофолатредуктазы dfrAl (accession GQ463140) dfrA1-R ACCCTTTTGCCAGATTTGGTA ICEs семейства SXT/R391 широко распространены в штаммах рода Vibrio, выделенных как от больных, так и из воды открытых водоемов и обычно ассоциированы с мультирезистентностью к целому ряду антибактериальных препаратов [9]. Ранее нами было показано наличие различных типов SXT в составе геномов штаммов V. cholerae О1 и О139 серогрупп, выделенных в 1990-е годы на территории Волгоградской области [10]. Известно, что многие виды рода Vibrio могут служить источником для холерных вибрионов новых, ранее не встречаемых у них комбинаций генов устойчивости к антимикробным соединениям [4]. В связи с этим было логично оценить распространенность данных генетических элементов среди автохтонной вибриофлоры региональных открытых водоемов. Материалы и методы В работе исследованы 136 штаммов V ^olerae non-O1/non-O139 серогрупп (из них три клинических изолята) и 43 штамма Vibrio spp., не относящихся к виду V ^olerae, выделенных на территории Волгоградской области в период 2003-2014 гг. Культуры выращивали на щелочном агаре (pH 7,8) при 37°С в течение 18-20 ч. Выделение ДНК проводили методом протеиназного лизиса [11]. Праймеры, использованные в работе, представлены в таблице. Амплификацию мишеней проводили: в мультилокусном формате на амплификаторе C1000 (Bio-Rad) при параметрах: 95 oC - 3 мин, 35 циклов (94 oC - 1 мин, 60,4 oC - 1 мин, 72oC - 1 мин), финальная элонгация при 72 oC - 10 мин; в монолокусном формате: 95 oC - 3 мин, 35 циклов (94 oC - 30 с, Т oC - 30 с, 72 oC - 30 с), 72 oC - 5 мин, где T - температура отжига праймеров (sulII F/R и strB F/R - 61,8 oC; dfr18 F/R - 60,4 oC; dfrA1 F/R - 57,8 oC). Продукты ПЦР анализировали с помощью электрофореза в 1,5% агарозном геле и визуализировали окрашиванием бромистым этидием. Результаты Скрининг исследуемых штаммов на наличие в составе их геномов последовательностей ICEs с использованием праймеров SXT-F/SXT-B, специфичных гену интегразы int SXT, показал наличие искомого гена у 60 штаммов V. ^olerae non-O1/non- O139 и у 25 штаммов Vibrio spp. Для дальнейшего анализа было отобрано 11 штаммов V ^olerae non- O1/non-O139, резистентных к двум и более антибиотикам, и 5 штаммов Vibrio spp., выделенных из разных точек отбора воды (для штаммов этой группы антибиотикограммы предварительно не исследовали) и показавших в ПЦР-скрининге специфические ампликоны наибольшей интенсивности. ORIGINAL INVESTIGATIONS Молекулярное типирование обнаруженных интегративных элементов проводили путем анализа структуры локусов вариабельной ДНК, несущих детерминанты резистентности к антибактериальным препаратам. Наличие генов резистентности в составе обнаруженных ICEs анализировали в форматах моно- и мультилокусной ПЦР с праймерами, специфичными к генам устойчивости к стрептомицину (strB), сульфаметоксазолу (sulII) и двум генам дигидрофолатредуктаз (dfr18 и dfrA1). У всех исследованных штаммов V ^olerae non-O1/non- O139 обнаружены фрагменты гена dfr18 ожидаемого размера 389 п.н. (см. рисунок, г). Кроме того, у штаммов 233 и 298-13 выявлены специфические ампликоны (515 п.н.) с праймерами strB (см. рисунок, в), а у штаммов 18/841 и 34-1 - фрагменты гена sulII (626 п.н.) (см. рисунок, а). Среди всех исследованных штаммов Vibrio spp. единственный штамм 287-9 содержал ген резистентности к триметоприму dfrA1 (ампликон размером 278 п.н.) (см. рисунок, б). Обсуждение Амплификация фрагментов генов резистентности в составе ICEs. Мультилокусная ПЦР с праймерами sulII F/R (626 п.н.), strB F/R (515 п.н.), dfr18 F/R (389 п.н.) и dfrA1 F/R (278 п.н.). а: 1 - V. ^olerae non-O1/O139 34-1; 2 - V. ^olerae non-O1/O139 18/841; М - ДНК-маркер (100-1000 п.н.). б: 1 - Vibrio spp. 270; 2 - Vibrio spp. 287-1; 3 - Vibrio spp. 287-9; 4 - Vibrio spp. 290-5; 5 - V cholerae О139 В191 (в качестве контроля); М - ДНК-маркер (100-1000 п.н.). Монолокусная ПЦР с праймерами strB F/R (В) и dfr18 F/R (Г): 1 - V cholerae non-O1/O139 127; 2 - V. cholerae non-O1/O139 135; 3 - V cholerae non-O1/ O139 162; 4 - V cholerae non-O1/O139 174; 5 - V. cholerae non-O1/O139 233; 6 - V. cholerae non-O1/O139 270-1; 7 - V cholerae non-O1/O139 298-13; 8 - V. cholerae non-O1/O139 305-3; М - ДНК-маркер (100-1000 п.н.). Вариабельные последовательности ICEs размером в диапазоне 30-60 т. п.н. находятся в основном в 5 горячих точках (HS, hot spot), обозначаемых HS1-HS5. Кроме того, некоторые ICEs также содержат вариабельную ДНК, встроенную за пределами горячих точек, в четырех вариабельных регионах (VR - variable region), обозначаемых VR I-VR IV [8]. Гены резистентности к антибиотикам сгруппированы вместе около 5'-конца элемента. Кластер генов резистентности к триметоприму (dfr18), хло- рамфениколу (floR), стрептомицину (strAB) и сульфометаксазолу (sulII) интегрирован в локус rumB ICE элемента и представляет собой транспозоно- подобную структуру, в которой гены резистентности фланкированы генами транспосаз - вариабельный регион VR III. Приведенный состав кластера генов резистентности характерен для ICEs типа SxtMO10 [12]. У элементов типа SXTET в кластере нет гена dfr18, а присутствует другой вариант гена дигидрофолатредуктазы - dfrA1, локализованный в HS3 вне основного кластера генов антибиотикоу- стойчивости, а также имеется ген резистентности к канамицину (kan) в горячей точке HS5 [12, 13]. Анализ вариабельного региона VR III обнаруженных ICEs V. ^olerae non-O1/non-O139 показал наличие интегрированного в локус rumB частичоригинальные исследования но делетированного кластера резистентности. Мы идентифицировали три варианта состава кластера: у 7 штаммов (127, 135, 162, 174, 270-1, 305-9 и 982) он был представлен только геном резистентности к триметоприму dfr18, у двух штаммов (233 и 29813) присутствовали детерминанты устойчивости к стрептомицину (strB) и триметоприму (dfr18), в двух штаммах (18/841 и 34-1) - dfr18 и sulII. Известно, что dfr18 специфичен для штаммов V. cholerae O139, в то время как dfrA1 специфичен для V cholerae O1 еl-Tor [13], т. е. описываемые ICEs штаммов V. ^olerae non-O1/non-O139 относят к типу SXTMO10. Ни в одном из ICEs исследованных штаммов Vibrio spp. кластера генов резистентности в составе VR III обнаружено не было. Известно, что его наличие не является маркерным признаком ICEs семейства SXT/R391. Так, ранее описаны элементы этого семейства - ICEVchMex1 из штамма V. cholerae неопределенной серогруп- пы, ICEVchHKO1 V. cholerae O139, ICEVflTha2 V. fluvalis V49 и ICEVvuTha1 V. vulnificus V268, в которых кластер резистентности отсутствовал [14, 12, 15]. Однако в ICE штамма Vibrio spp. 287-9 мы обнаружили вставку в HS3, содержащую ген резистентности к триметоприму dfrA1, характерный для SXTET штаммов V. cholerae O1. Интересно отметить, что из 24 штаммов V. cholerae non-O1/non-O139, выделенных в период 2003-2007 гг., только два (18/841 и 34-1) имели в составе генома интегративные конъюгативные элементы SXTMO1°-™m с частично делетирован- ными кластерами антибиотикорезистентности. В то же время среди штаммов V. ^olerae non-O1/ non-O139, выделенных через 10 лет, более 50% содержали ICEs также SXT^^-rara, но с иными вариантами состава кластера генов резистентности. Таким образом, полученные результаты дают основание сделать вывод о присутствии и достаточно быстром распространении среди видов вибриофлоры региональных открытых водоемов интегративных конъюгативных элементов семейства SXT/R391. Выявленная мозаичность структуры ICEs свидетельствует о высокой степени генетической изменчивости данных структурных элементов генома вибрионов, а также их потенциальной роли в формировании новых, адаптивно значимых генотипов микроорганизмов. Известно, что штаммы V. cholerae non-O1/ non-O139 могут служить источником для вибрионов эпидемически значимых серогрупп новых, ранее не встречаемых у них комбинаций генов устойчивости к антимикробным соединениям [4]. Ранее считали, что распространение генов резистентности - это их основная роль, однако в настоящее время очевидно, что ICEs могут быть посредником для передачи самого разнообразного набора функций, позволяющих бактериям быстро адаптироваться к новым условиям окружающей среды и колонизировать новые ниши. Учитывая, что ICEs могут быть вовлечены в механизмы горизонтальной передачи генетического материала, расширяющего эпидемический потенциал вибрионов (гены персистенции, патогенности и др.), дальнейшее изучение структуры и изменчивости данных генетических элементов - одна из актуальных задач молекулярно-генетического мониторинга за холерой и патогенными для человека вибрионами. Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки. Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Об авторах

Ирина Борисовна Захарова

ФКУЗ «Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора

Email: zib279@gmail.com
канд. биол. наук, зав. лаб. геномики и протеомики ФКУЗ «Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора 400131, г. Волгоград, Россия

Юлия Александровна Кузютина

ФКУЗ «Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора

науч. сотр. лаб. геномики и протеомики ФКУЗ Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора 400131, г. Волгоград, Россия

Мария Васильевна Подшивалова

ФКУЗ «Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора

науч. сотр. лаб. геномики и протеомики ФКУЗ Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора 400131, г. Волгоград, Россия

Антон Александрович Замарин

ФКУЗ «Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора

науч. сотр. лаб. геномики и протеомики ФКУЗ Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора 400131, г. Волгоград, Россия

Андрей Владимирович Топорков

ФКУЗ «Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора

доктор мед. наук, директор ФКУЗ Волгоградский научноисследовательский противочумный институт Роспотребнадзора 400131, г. Волгоград, Россия

Дмитрий Викторович Викторов

ФКУЗ «Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора

доктор биол. наук, доцент, зам. директора по научно-экспериментальной работе ФКУЗ Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора 400131, г. Волгоград, Россия

Список литературы

Дополнительные файлы