Molecular epidemiology of vibrio cholerae - development of the algorithm for data analysis of whole genome sequencing

Full Text

Генотипирование микроорганизмов-возбудителей ООИ с помощью изучения распределения единичных нуклеотидных замен (SNP), выявленных на основе данных полногеномного секвениро- вания, является одним из активно развивающихся приемов молекулярной эпидемиологии холерного вибриона [1]. Предпосылками к этому, с одной стороны, служат создание аннотированных геномов практически всех патогенных микроорганизмов и, с другой - широкое внедрение и удешевление методов высокопроизводительного секвенирования «нового поколения» (Next-Generation Sequencing, NGS) [2-5]. Проблема молекулярного типирования Vibrio cholerae - возбудителя тяжелого диарейного заболевания, способного к эпидемическому распространению, находится в центре внимания многих исследователей. За последнее десятилетие проведено большое количество исследований, посвященных молекулярной эпидемиологии холерного вибриона [1, 6, 7]. Получение воспроизводимых результатов, позволяющих судить о распространении и изменчивости штаммов, сдерживает отсутствие единой схемы SNP-типирования холерного вибриона. Разными авторами используется различный спектр изучаемых SNP и различные алгоритмы анализа. Одним из наглядных примеров отсутствия воспроизводимости могут служить работы разных групп исследователей по изучению штаммов, вызвавших эпидемические осложнения по холере на о. Гаити в 2010 г. Использование для анализа 4376 SNP позволило сделать вывод о заносе холеры из Камеруна и Индии [8]. В то же время Katz и соавт. [9], используя 566 SNP, сделали вывод о непальском происхождении штаммов. Отсутствие единого подхода и расхождение результатов, получаемых разными авторами, подчеркивает актуальность исследований в данном направлении и ограничивает использование метода секвениро- вания в практике работы эпидемиолога. Важной характеристикой любой системы ти- пирования является возможность сопоставления данных разных авторов. В этом плане SNP-анализ имеет существенный приоритет перед многими другими методами молекулярной эпидемиологии: помимо общепринятого мирового стандарта представления данных в формате FASTA, существуют большие банки данных, облегчающие доступ исследователей к требуемым нуклеотидным последовательностям. Однако в ряде случаев при анализе данных полногеномного секвенирования возникают проблемы, связанные с возможными ошибками при секвенировании генома. Эта проблема является наиболее актуальной при сопоставлении данных, полученных на секвенаторах различных производителей. Так, Duke J.L. и соавт. [10] при сравнении раз- ORIGINAL INVESTIGATIONS ных технологических платформ для полногеномного секвенирования на модели генов системы HLA показали, что использование секвенатора MiSeq позволяет получать данные более высокого качества с меньшим числом ошибок по сравнению с Ion Torrent. Подобное исследование было проведено на модели вируса гриппа А - сравнительный анализ выявил, что у платформы MiSeq точность определения нуклеотидной последовательности в полтора раза выше, чем у Ion Torrent. Но главная проблема заключается в том, что разность платформ секвенирования влияет не только на количество ошибок, но и на их разновидность. К примеру, ошибки секвенирования на MiSeq чаще всего проявляются в виде замен, в то время как для Ion Torrent больше были характерны делеции-вставки [11]. Точность секвенирования также зависела и от состава анализируемой ДНК. При сравнительном анализе данных полногеномного секвенирования Plasmodium falciparum было установлено, что GC- богатые участки одинаково хорошо поддаются прочтению на разных платформах, в то время как АТ-богатые участки секвенируются на 30% хуже при использовании Ion Torrent [12]. Вышеперечисленные проблемы и обусловливают трудности при сопоставлении данных, полученных на разных технологических платформах. В ряде случаев различия в технике секвенирова- ния просто не позволяют проводить сравнительный анализ данных, полученных разными авторами [13]. «Глубина секвенирования» - одна из важных характеристик, отражающая качество полученных нуклеотидных последовательностей. Она является цифровым показателем уровня «покрытия» конти- га ридами (coverage). В ряде работ, проводимых в нашей стране, средний уровень покрытия последовательностей штаммов Vibrio cholerae не превышает 100 [14], в то время как в зарубежных работах этот показатель достигает 200-250 [8], что делает актуальным работы по разработке программного обеспечения, способного работать с данными сек- венирования с низким уровнем покрытия. В связи с этим цель работы состояла в разработке алгоритма анализа, позволяющего проводить сравнение данных полногеномного секвени- рования, полученных на различных аппаратных платформах, и проведение с его помощью анализа штаммов холерных вибрионов, выделенных на территории Российской Федерации. Материалы и методы В работе использованы данные полногеномного секвенирования, полученные на платформе MiSeq Illumina в лаборатории микробиологии холеры ФКУЗ «Ростовский-на-Дону противочум- ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ный институт» Роспотребнадзора (штаммы Vibrio cholerae Эльтор O1 №№ 16228, 17261, 17290, 17296, 18329, 18367, 18368, 18369, 18588, 81); на платформе Illumina MiSeq во ФБУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора (штаммы Vibrio cholerae Эльтор O1 №№ 301, 19187, 19188a, 19191a, 6878, 18826, 18899); и данные, полученные из системы ГенБанк: штаммы Vibrio cholerae Эльтор O1 №№ 31, 39, 43, 56 (ФКУЗ «Ставропольский противочумный институт» Роспотребнадзора, платформа Ion Torrent), штаммы Vibrio cholerae Эльтор O1 №№ 3265, L-3226, M1275D, M1275, M1293, M1429, P18899-D, P18899 (ФКУЗ Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Роспотребнадзора, платформа IonTorrent) и данные зарубежных исследователей. Все исходные данные были представлены в виде набора контигов (фрагментов) различной длины. Программное обеспечение разрабатывали на языках программирования Java и Microsoft Visual Basic for Application. Кластерный анализ и построение дендрограммы проводили с использованием авторского программного обеспечения по методу UPGMA. Дендрограмма, построенная на основе распределения 1929 SNP штаммов холерного вибриона. Для каждого штамма указан номер, место и год выделения. Справа буквами латинского алфавита обозначены кластеры. Для отображения построенной дендрограммы использовали программу MEGA 5 [15]. Результаты и обсуждение Для проведения анализа нами было разработано программное обеспечение, выявляющее SNP среди набора кон- тигов исследуемых штаммов, что позволило создать базу данных единичных нуклеотидных замен холерного вибриона. Первый этап работы состоял в составлении реестра (списка) единичных нуклеотидных замен (SNP). Для этого нами было проведено попарное сравнение известных открытых рамок считывания у исследуемых штаммов с использованием алгоритма локального выравнивания Смита-Ватермана с учетом аффинных штрафов за делеции и вставки с помощью разработанного нами программного обеспечения. Следующий этап работы заключался в исключении из списка замен, находящихся в «горячих» г 1918 Чг 191 I- L-3 - 6878-Москва-2012 г НС-69А1-Гаити-2010 П-НС-38А1-Гаити-2010 г НС-62А1-Гаити-2010 , НС46А1-Гаити-2010 J1 НС-43А1-Гаити-2010 Р- НС-23А1 -Гаити-2010 НС-28 А1 -Гаити-2010 I НС-06А1-Гаити-2010 1786-Г аити-2010 [ 39-Мариуполь-2011 1 31-Мариуполь-2011 19188а-Москва-2010 19187-Москва-2010 ,-3226-Москва-2010 |- 18899-Мурманск-2006 “ г- Р18899-Мурманск-2006 jt 3546-06-США-Индия-2006 LP18899-D " г М1429-Белорецк-2004 Ч 3500-0 5-США-Инд ия-2005 12009У-1131-США-Индия-2009_ 19191а-Москва-2010 З265-Москва-2014 _ 18826-Тверь-2005 З01-Таганрог-2011 - 81-Ростов-2014 - Р Nep-21113-Henan-2003 ~L Мер-21106-Непал-2003 " р 18369-Ростов-2001 Ч, 18368-РОСТОВ-2001 1 18367-РОСЮВ-2001 I----- 18329-Казань-2001 '----- 17296-Дагестан-1994 - ■ МЛ485-Бангладеш-1994 ■ 17261-Дагестан-1994 ■ 16228-Дагестан-1994 - А346-2-Бангладеш-1994 - А346-1-Бангладеш-1994 17290-Дагестан-1994 г МЗ-1236-Бангладеш-1994 "L ВЗЗ-Мозамбик-2004 г М-1293-Дагестан-1994 3- 56-Мариуполь-1994 , M1275D J1 М1275-Даге стан-1993 Ч 185 8 8-РОСТОВ-2003 ■ 43-Мариуполь-1994 участках мутаций. Нуклеотидную замену оставляли в реестре в том случае, если в 9 нуклеотидных фрагментах, фланкирующих SNP, не было других замен, делеций или вставок. Данный подход обоснован редкой встречаемостью замен в геноме холерного вибриона. Поэтому наличие нескольких SNP на таком коротком участке, скорее всего, является ошибкой секвенирования. По итогам этого этапа работы в реестре были оставлены 3683 единичные нуклеотидные замены. При проведении любого анализа одним из наиболее существенных факторов является корректность подборки исходных данных. Однако один из основных показателей качества данных секве- нирования - покрытие контига ридами (coverage) - многие исследователи попросту не указывают. Это побудило нас разработать независимый критерий оценки качества исходных данных - количество обнаруженных SNP. При этом штаммы вибрионов, у которых было обнаружено менее 3000 SNP, были исключены из анализа. С целью удаления из базы данных потенциальных ошибок секвенирования для штаммов, оставшихся в базе данных, был проведен анализ полиморфизма каждой единичной нуклеотидной замены, включенной в реестр. При этом SNP оставляли для последующего анализа, если каждая аллель встречалась как минимум у двух штаммов. После всех вышеперечисленных этапов отбора для анализа было оставлено 1929 SNP, на основании которых была построена дендрограмма (рисунок). При визуальном анализе были выделены 6 кластеров, обозначенных буквами латинского алфавита с A по F. Одним из обязательных условий проведения любых научных и лабораторных исследований является наличие «внутренних» контрольных образцов, позволяющих подтвердить правильность проведения анализа. На наш взгляд, биоиформа- ционный анализ данных полногеномного секве- нирования с целью типирования штаммов Vibrio cholerae также требует наличия «внутренних контролей». В качестве одного из таких контро- лей нами были использованы геномы одних и тех же штаммов вибрионов, сиквенсы которых были независимо получены на разных платформах. В данном примере геном штамма Vibrio cholerae № 18899 был секвенирован как на платформе MiSeq Illumina, так и на платформе Ion Torrent и описан как Р18899. В качестве еще одного стандарта внутреннего контроля нами были подобраны «контрольные пары» штаммов Vibrio cholerae по принципу «исходный штамм - изогенный мутантный вариант». Так штамм Vibrio cholerae Р18899-Б представляет собой изогенный мутант из штамма Р18899, спонтанно утративший ген холерного токсина [16]. Как следует из дендрограммы, все эти три штамма попали в кластер «B». Аналогичная ситуация наблюдается с другой «контрольной парой» штаммов М-1275 и М-1275-D (исходный и мутантный вариант, утративший VSP-I), которые также расположены на дендрограмме в соседних ветках. На наш взгляд, это подтверждает правильность использования предлагаемых нами алгоритмов анализа. Следует отметить, что при исключении любого из предлагаемых нами этапов анализа вышеперечисленные «контрольные» штаммы оказываются на значительном удалении друг от друга (данные не представлены). При анализе дендрограммы четко видно, что штаммы, вызвавшие вспышку холеры на о. Гаити в 2010 г., составили кластер «А». В этот же кла- ORIGINAL INVESTIGATIONS стер входит штамм холерного вибриона 6878 (Москва, 2012) и штаммы № 19188, 19187а, L-3226, выделенные в Москве в 2010 г. Кластер «А» также включает штаммы холерного вибриона 31 и 39, выделенные во время эпидемических осложнений по холере в Мариуполе (Украина) в 2011 г. Кластер «В» формируют штаммы 18899 (г. Мурманск, 2006) и М-1429 (Белорецк, 2004), что позволяет сделать вывод об их генетической близости. Анализ дендрограммы позволяет сделать вывод о заносе этих штаммов из Индии, в пользу чего свидетельствует попадание в этот же кластер штаммов, выделенных в США (занос из Индии). Штаммы Vibrio cholerae № 19191а и 3265 не вошли ни в один из кластеров, что может объясняться отсутствием в дендрограмме родственных им штаммов. Возможно, расширение перечня исследуемых штаммов в дальнейшем, позволит ответить на вопрос о происхождении этих штаммов. Вместе с тем у данных штаммов ген ctxB7 «гаитянского» типа [17], что, в известной степени, роднит их со штаммами, вызвавшими вспышку холеры на о. Гаити. В отдельный кластер «С» попали штаммы холерного вибриона 18826 (Тверь, 2005), 301 (вода Таганрогского Залива, Ростовская область, 2011) и 81 (р. Темерник, Ростов-на-Дону, 2014). При этом ранее, на основе данных VNTR-типирования, уже была показана генетическая близость 301 и 81 штаммов [18]. Отдельного внимания заслуживает кластер «D», в состав которого входят штаммы Vibrio cholerae 17296 (Республика Дагестан, 1994), 18329 (Казань, 2001) и штаммы, выделенные из воды реки Темерник в Ростове-на-Дону в 2001 г. Важно отметить, что генетическая близость штаммов, вызвавших вспышку холеры в Казани в 2001 г., со штаммом, выделенным из воды в Ростове-на-Дону уже была установлена по данным VNTR-типирования [19]. Настоящее исследование подтвердило сделанный ранее вывод. Исходя из состава кластера «D», можно предположить непальское происхождении указанных штаммов. Кластер «Е» представлен исключительно штаммами, вызвавшими эпидемические осложнения по холере в Республике Дагестан и Бангладеш в 1994 г., что позволяет говорить о существовании связи между двумя этими вспышками. Кластер «F» также представлен штаммами из Дагестана и Бангладеш 1993 и 1994 гг., однако в него же вошли штаммы, вызвавшие эпидемические осложнения в это же время в Мариуполе (Украина). Присутствие в этом же кластере целого ряда так называемых «матлабских» штаммов [20], позволяет сделать вывод о связи вспышки холеры в Дагестане и Мариуполе в 1994 г. со штаммами из Бангладеш. Не менее важным является попадание в этот же оригинАльныЕ исслЕдовАния кластер штамма Vibrio cholerae № 18588, выделенного из воды в Ростове-на-Дону в 2003 г. Стоит отметить, что попадание в один кластер штаммов от одной вспышки (Дагестан 1994), сек- венированных на разных платформах (MiSeq - ФКУЗ «Ростовский-на-Дону противочумный институт» Роспотребнадзора, и Ion Torrent - ФКУЗ Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Роспотребнадзора), является косвенным подтверждением достоверности проведенного анализа. Заключение Таким образом, в ходе настоящего исследования разработан алгоритм сравнительного анализа данных полногеномного секвенирования токси- генных штаммов Vibrio cholerae, полученных на различных технологических платформах. Алгоритм включает создание выборки геномов и проведение анализа по 1929 SNP, локализованных в открытых рамках считывания. Первым этапом является подбор последовательностей для анализа. Обязательными условиями для включения последовательности в анализируемую выборку являются наличие в данном геноме не менее 3000 SNP и наличие данной аллели как минимум у двух штаммов. Выполнение указанных условий позволило, на наш взгляд, получить объективную картину генетических взаимосвязей токсигенных вибрионов, выделенных на территории РФ. Полученный результат анализа полногеномного секвенирования указывает на наличие нескольких волн заноса токсигенных штаммов на территорию РФ. Так штаммы, вызвавшие эпидемический процесс 1994 г. в Дагестане и Украине, четко дискриминируются от штаммов выделенных после 2000 г. Обращает на себя внимание, что штаммы, обусловившие эпидемические осложнения в Дагестане в 1994 г. распределились между тремя разными кластерами «D», «E» и «F», что позволяет высказать предположение о наличии как минимум трех независимых заносов возбудителя холеры в Республику Дагестан. Неоднократные заносы возбудителя могут в какой-то мере объяснить необычно длительный и разлитой характер эпидемического процесса 1994 г. [21]. Наличие в этих кластерах штаммов из Бангладеш и Мозамбика может указывать на возможное происхождение источника инфекции. В последующие годы отмечена смена возбудителя [3, 20], что закономерно привело к изменению происхождения заносных штаммов. Так вспышка 2001 г. в Казани, вероятно, вызвана «непальскими» штаммами. Недавние эпидемические события на Гаити вызваны штаммами «гаитянской группы», которые в этот же отрезок времени неоднократно изолировались в нашей стране. Более того, штаммы из «гаитянской группы» были практически одновременно занесены в Россию и Украину, где вызвали вспышку холеры, однако в нашей стране ввиду оперативного проведения противоэпидемических мероприятий они не получили дальнейшего распространения. На наш взгляд разработанный алгоритм может быть использован для разработки единого унифицированного подхода при изучении молекулярной эпидемиологии холеры в РФ. Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

About the authors

Aleksey S. Vodop'yanov

Rostov-on-Don Antiplaque Research Institute, Russian Inspectorate for the Protection of Consumer Rights and Human Welfare

Email: alexvod@gmail.com
MD., Ph.D., senior researcher of the Virology group 117/40, M. Gorky str., Rostov-on-Don, 344002, Russian Federation

R. V Pisanov

Rostov-on-Don Antiplaque Research Institute, Russian Inspectorate for the Protection of Consumer Rights and Human Welfare

117/40, M. Gorky str., Rostov-on-Don, 344002, Russian Federation

S. O Vodop'yanov

Rostov-on-Don Antiplaque Research Institute, Russian Inspectorate for the Protection of Consumer Rights and Human Welfare

117/40, M. Gorky str., Rostov-on-Don, 344002, Russian Federation

B. N Mishankin

Rostov-on-Don Antiplaque Research Institute, Russian Inspectorate for the Protection of Consumer Rights and Human Welfare

117/40, M. Gorky str., Rostov-on-Don, 344002, Russian Federation

I. P Oleynikov

Rostov-on-Don Antiplaque Research Institute, Russian Inspectorate for the Protection of Consumer Rights and Human Welfare

117/40, M. Gorky str., Rostov-on-Don, 344002, Russian Federation

V. D Kruglikov

Rostov-on-Don Antiplaque Research Institute, Russian Inspectorate for the Protection of Consumer Rights and Human Welfare

117/40, M. Gorky str., Rostov-on-Don, 344002, Russian Federation

S. V Titova

Rostov-on-Don Antiplaque Research Institute, Russian Inspectorate for the Protection of Consumer Rights and Human Welfare

117/40, M. Gorky str., Rostov-on-Don, 344002, Russian Federation

References

Supplementary files