Alterations in the phenotype of cells of innate immunity in patients with polytrauma in the dynamics of the use of vaccine to prevent Pseudomonas aeruginosa

Full Text

Введение В настоящее время травматизм является одной из основных причин смертности трудоспособного населения в возрасте до 40 лет. Особенно это касается больных с тяжелыми множественными и сочетанными повреждениями - политравмой (ПТ). Больные с ПТ требуют длительного лечения, что объясняется множественностью травм скелета, сменой методов лечения, а также нередкими осложнениями в процессе лечения [1]. Часто развиваются гнойно-некротические осложнения, которые характеризуются особой тяжестью и распространенностью. В связи с большой крово- потерей и травматическим шоком возникает вторичный иммунодефицит [2, 3]. Все эти факторы, усугубляющие течение раневых осложнений при политравмах, заставляют использовать не только традиционные тактические схемы лечения и профилактические мероприятия, но и осуществлять разработку новых подходов к лечению этой категории больных. Учитывая, что бактериальная инфекция считается ведущей причиной осложнений ПТ, своевременная антибактериальная терапия и оперативные санационные мероприятия позволяют значительно улучшить прогноз исхода заболевания. Однако не всегда такое лечение оказывается эффективным, особенно при развитии нозокомиальных инфекций, к которым относится и инфекция вызванная Pseudomonas aeruginosa. С целью профилактики и лечения данной инфекции нашла применение поливалентная вакцина «Псевдовак», состоящая из 7 иммунотипов, инактивированных штаммов P. aeruginosa. Она обеспечивает формирование активного иммунитета к синегнойным инфекциям, чем и обусловливают клинический эффект от ее применения. Доказана ее эффективность при ожогах, инфекциях дыхательных и мочевыводящих путей, уменьшении риска бактериемии и сепсиса при длительной госпитализации, интубации, искусственной вентиляции легких, осложнениях при катетеризации, рецидивирующих инфекциях, различных видах ран, в том числе послеоперационных [4, 5]. Однако помимо формирования адаптивного иммунитета вакцину «Псевдовак» необходимо рассматривать и как иммуностимулятор микробного происхождения, за счет воздействия на образ- распознающие рецепторы (pattern-recognition receptors - PRR) макрофагов, NK-клеток, грану- лоцитов, эпителиальных и дендритных клеток, патоген-ассоциированными молекулярными образами (pathogen-associated molecular pattern - PAMP) структурных и внеклеточных антигенов, инактивированных штаммов P aeruginosa вакцины «Псевдовак». Определено, что РАМР синегнойной палочки активно воздействуют на Toll-подобные рецепторы 2, 4, 5 и 9 классов [6, 7], за счет чего мы вправе ожидать активацию этих клеток, усиления синтеза цитокинов, более активное поглощение патогена с последующим представлением антигенных детерминант и запуском адаптивного иммунитета. Целью исследования явилось изучение влияния вакцины «Псевдовак» на фенотип клеток врожденного иммунитета больных с ПТ. Методика В исследование включены 60 больных (43 мужчины и 17 женщин в возрасте 23-58 лет) с ПТ. Из исследования исключали больных с наличием тяжелых сопутствующих заболеваний. Все пациенты получали стандартное лечение. Методом простой рандомизации обследуемые были разделены на две группы. Группа 1 - 30 больных с ПТ (22 мужчины и 8 женщин), получающие лечения по традиционной схеме. Группа 2 - 30 больных с ПТ (21 мужчина и 9 женщин), получающие лечения по традиционной схеме и дополнительно с профилактической целью получающие вакцину «Псев- довак». Вакцина «Псевдовак» вводилась согласно Инструкции по применению лекарственного препарата (ЛП 001290-281111) в 1-4-6-8-10-й день по 0,2-0,4-0,6-0,8-1,0 мл в/м. Иммунологические исследования были проведены трижды: при поступлении в стационар, на 10-й и на 20-й день госпитализации. В качестве контроля обследовано 35 здоровых людей (25 мужчин и 10 женщин) аналогичного возрастного диапазона. Исследование фенотипического состава клеток врожденного иммунитета проводили методом про- ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ точной цитометрии с использованием моноклональных антител (Beckman Coulter, USA), меченных FITC (fluorescein isothiocyanate), PE или RD1 (phycoerythrin), ECD (phycoerythrin-TexasRed-X), PC5 (phycoerythrin-cyanin 5) и PC7 (phycoerythrin- cyanin 7) Пробоподготовку осуществляли по стандартной методике [8]. Лизис эритроцитов проводили по безотмывочной технологии с использованием реагента VersLyse (Beckman Coulter, США). Использовалось пятицветное иммунофенотипиро- вание. Панели тестирования лейкоцитов определены следующим образом: CD3/CD19/CD16+56/ CD45/CD38, CD3/CD16/CD56/CD8/CD11b, CD3/ CD16+56/CD28/CD57/CD45, CD14/CD64/CD16/ CD45/HLA-DR. Анализ окрашенных клеток проводили на проточном цитофлуориметре FC-500 (Beckman Coulter, USA), в каждой пробе анализировали не менее 50 000 клеток. Абсолютные значения были получены в двухплатформенной технологии с использованием результатов гематологического анализа. Все исследования выполнены с информированного согласия испытуемых и в соответствии с Хельсинкской декларацией Всемирной ассоциации «Этические принципы проведения научных медицинских исследований с участием человека» с поправками 2000 г. и «Правилами клинической практики в Российской Федерации», утвержденными Приказом Минздрава РФ от 19.06.2003 г. № 266. Описание выборки производили с помощью подсчета медианы (Ме) и интерквартильного размаха в виде 25 и 75 процентилей (С25 и С75). Достоверность различий между показателями независимых выборок оценивали по непараметрическому критерию Манна-Уитни. Достоверность различий в динамике лечения определяли по критерию Вил- коксона (Wilcoxon matched pairs test). Статистический анализ осуществляли в пакете прикладных программ Statistica 8.0 (StatSoftInc., 2007). Результаты При исследовании иммунологических показателей, характеризующих клетки врожденного звена иммунной системы, обнаружено, что изначально в развернутом анализе крови у больных с ПТ при сравнении с показателями контрольной группой определяется увеличение числа лейкоцитов за счет нейтрофилов при уменьшении общего числа лимфоцитов (табл. 1). У больных, получавших вакцину, на 10-й день увеличивается число нейтрофилов и лимфоцитов. При проведении цитометрического анализа нейтрофилов у больных с ПТ обнаружено снижение содержания CD16+-нейтрофилов и увеличение количества клеток, экспрессирующих CD64 (табл. 2). В динамике число этих клеток стремится к уровню контрольного диапазона и без различий в группах, получавших и не получавших вакцину против синегнойной палочки. Рассматривая исходные значения в содержании моноцитов, нами не установлены изменения в их количестве (табл. 3). Это связано с тем, что на первом этапе реакция моноцитов при ПТ не выражена (идет превалирование нейтрофильной активации). На 10-й день лечения наблюдается увеличение количества CD14hiCD16+-моноцитов. Число клеток с данным фенотипом у больных, получающих вакцину, выше, чем у не получающих препарат. Так- Таблица 1 Показатели лейкоцитов крови у больных с ПТ при лечении вакциной «Псевдовак» (Ме, С25-С75) Показатель Группа Контроль Исходные 10-й день 20-й день Лейкоциты, • 109/л 1 5,80 10 57*** 11 07*** 8,79* 7,88-11,68 8,39-12,18 6,11-9,90 2 4,32-7,54 11,20*** 13,98*** 9,24* 8,52-12,31 11,30-15,09 6,55-10,35 Нейтрофилы, • 109/л 1 3,55 8 49*** 7 74*** 6,12*# 5,81-9,60 5,06-8,85 3,44-7,23 2 3,15-4,52 8,96*** 9 79***° 6,45* 6,28-10,07 7,11-10,90 3,77-7,56 Лимфоциты, • 109/л 1 2,05 1,36* 1,99* 1,58 0,85-1,77 1,48-2,40 1,07-1,99 2 1,65-2,49 1,44* 2 51###*°° 1,67 0,93-1,85 1,99-2,92 1,16-2,08 Моноциты, • 109/л 1 0,34 0,30 0,33 0,35 0,10-0,38 0,13-0,41 0,15-0,43 2 0,12-0,41 0,34 0,30 0,37 0,14-0,42 0,09-0,39 0,16-0,45 Примечание. Здесь и в табл. 2-4: группа 1 - без применения в лечении «Псевдовака»; группа 2 - с применением в лечении «Псевдовака»; статистически значимые различия с показателями контрольной группы: * -р< 0,05, ** -р < 0,01, *** -р < 0,001; -//- с исходными показателями: # -р< 0,05, ## -р < 0,01, ### -р < 0,001; -//- при сравнении групп: ° -р< 0,05, °° -р < 0,01, °°° -р < 0,001. Нейтрофилы крови у больных с ПТ при лечении вакциной «Псевдовак» (Ме, С25-С75) ORIGINAL INVESTIGATIONS Таблица 2 Показатель Группа Контроль Исходные 10-й день 20-й день CD11b+, % 1 99,92 97,80 98,25 99,54 93,76-99,95 95,92-99,87 96,54-99,91 2 99,81-100,0 98,74 99,11 99,80 94,61-99,94 94,58-99,84 96,84-99,93 CD16+, % 1 92,48 79,55** 81,43** 88,25 71,48-85,11 79,47-85,24 85,86-95,45 2 88,43-96,76 76,13*** 85,90* 90,19 69,83-85,49 82,19-90,54 88,27-95,74 CD64+, % 1 7,43 22,81*** 14,1-31,5 15,90*** 11,32-17,90 12,07*# 8,19-13,11 2 4,19-14,52 23,63*** 12,9-33,25 16,39*** 11,75-18,12 11,98*## 7,09-14-46 Таблица 3 Моноциты крови у больных с ПТ при лечении вакциной «Псевдовак» (Ме, С25-С75) Показатель Группа Контроль Исходные 10-й день 20-й день Моноциты CD14“CD16\ % 1 84,21 85,70 84,46 84,43 78,54-89,25 77,30-88,01 75,27-87,98 2 73,19-96,10 86,35 80,95 81,90 79,18-89,90 73,79-84,50 74,75-85,45 Моноциты CD14“CD16+, % 1 4,60 4,53 8,30*## 4,80 2,57-6,50 6,34-10,28 2,84-6,78 2 3,65-10,50 4,87 13 25***###°°° 6,35 2,91-6,84 11,29-15,22 4,39-8,32 Моноциты CD14dimCD16+, % 1 2,75 2,58 2,85 2,74 0,62-4,55 0,88-4,82 0,78-4,71 2 1,65-4,05 2,80 3,81 2,38 0,84-4,77 1,85-5,78 0,42-4,35 Моноциты HLA-DR+, % 1 85,80 81,32 73,65**## 88,60 74,16-85,87 66,49-77,20 81,44-92,15 2 82,48-89,09 82,18 86,35° 85,93 75,02-85,73 79,18-89,90 78,77-89,48 же на 10-й день лечения выявляется повышение лимфоцитов при ПТ выше показателей контрольуровня ИЬА-ВК+-моноцитов на фоне применения ной группы (табл. 4). К 10-му дню лечения у больвакцины. ных, получавших вакцину против синегнойной В целом, как отмечалось выше количество лим- палочки, число СВ3-СВ16/56+-клеток уменьшаетфоцитов у больных с ПТ снижается (см. табл. 1). ся по сравнению с исходным уровнем и к 20-му Однако число CD3-CD16/56+и CD3+CD16/56 +- становится ниже контрольного диапазона. В то же Таблица 4 Лимфоциты крови, характеризующие врожденный иммунитет у больных с ПТ при лечении вакциной «Псевдовак» (Ме, С25-С75) Показатель Группа Контроль Исходные 10-й день 20-й день CD3+CD16/56+, % 1 3,55 4,91* 5,79* 4,56 2,94-6,89 3,82-7,76 2,59-6,53 2 1,66-5,60 4,80* 8 75***###°° 6 15**#°° 2,83-6,78 6,78-10,72 4,19-8,14 CD3-CD19-CD16/56+, % 1 18,10 28,95*** 30,70*** 19,80## 21,79-32,50 23,35-34,25 12,64-23,35 2 13,49-22,01 27 11*** 20,47°°° 14 36*###°° 19,95-30,66 13,31-24,02 7,20-17,91 CD16“shtCD56dim, % 1 1,08 1,89 1,45 0,93## 0,69-2,08 0,75-1,64 0,73-1,12 2 0,43-2,74 2,01 4 26**##°°° 2,69*°°° 0,40-3,98 2,29-6,23 0,72-4,67 CD16lowCD56brisht, % 1 0,52 0,83* 0,61 0,51## 0,63-1,02 0,41-0,80 0,31-0,81 2 0,34-0,72 0,85* 2 85***###°°° 1,09*°°° 0,65-1,04 2,65-3,04 0,89-1,28 ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ время, у больных данной категории содержание CD3+CD16/56+-лимфоцитов также повышается на 10-е сутки лечения и остается повышенным на 20-й день наблюдения. У лиц данной группы наблюдается увеличение количества CD16brightCD56- dim- и CD16lowCD56bright-лимфоцитов. Обсуждение Учитывая, что бактериальные инфекции являются ведущей причиной осложнения ПТ, своевременная адекватная комплексная терапия позволяет значительно улучшить прогноз заболевания. Имму- ноактивная терапия одно из направлений позволяющие улучшить эффективность лечения больных с ПТ. В качестве иммуностимуляторов бактериального происхождения можно рассматривать и вакцину против синегнойной палочки - «Псевдовак». Врожденный иммунитет обеспечивается клетками мие- лоидного ряда: макрофагами и гранулоцитарными лейкоцитами, а также клетками лимфоидного ряда (например NK- и NKT-лимфоцитами). Это высоко реактивное звено в иммунной системе. Они первыми мобилизуются в очаг воспаления. От их фагоцитарной и цитотоксической активности во многом зависит эффективность противомикробной защиты организма [9, 10]. У больных с ПТ выявлены изменения параметров врожденного иммунитета, сопровождающиеся, прежде всего, увеличением числа нейтро- филов. Нейтрофильные гранулоциты занимают одну из наиболее активных позиций в системе иммунитета. Эти клетки составляют первую линию неспецифической противомикробной защиты. Они, обладая высокой реактивностью, способны быстро функционально перестраиваться в ответ на воздействие агентов различной природы [9]. Учитывая, что их функциональная активность отражается в экспрессии различных рецепторов, проведены исследования по изучению экспрессии CD11b, CD16 и CD64 на нейтрофилах. Обнаружено, что у больных с ПТ в 1-е сутки обследования в периферической крови снижается содержание нейтрофилов, экспрессирующих CD16-рецептор, к 20-му дню лечения - восстанавливается до уровня контрольного диапазона. Данная молекула представляет собой гликопротеин, являющийся низкоаффинным рецептором для IgG (FcyRIIIb), с помощью которого также осуществляется механизм антителозависимой клеточной цитотоксичности [11]. Доказано, что уровень экспрессии CD16 также свидетельствует о зрелости нейтро- филов. Кроме того, у больных с ПТ в 1-е сутки обследования повышено количество нейтрофилов с экспрессией CD64, к 20-му дню лечения уровень CD64+-нейтрофилов нормализуется. CD64 (FcyRI) - является высокоаффиным рецептором к Fc-фрагментам иммуноглобулинов G. Это единственный тип Fcy-рецепторов, который связывает свободные антитела. Фагоцитириующие клетки при экспрессии данного рецептора могут удерживать на своей поверхности большое число молекул антител одной специфичности, что обеспечивает специфическое распознавание патогена клетками [12]. При использовании вакцины «Псевдовак» не установлено значимых изменений количества ней- трофилов в крови и их фенотипа. Фенотипирование моноцитов позволило определить особенности их субпопуляционного состава при ПТ. Установлено, что если количество общих моноцитов крови у больных с ПТ не изменяется на всем протяжении обследования, то на 10-й день лечения у больных повышается уровень «неклассических» моноцитов (CD14hiCD16+). Причем, у больных с ПТ, получавших вакцину «Псевдовак», количество «неклассических» моноцитов больше, чем у пациентов, не получавших вакцину. Активность этих клеток связана, в первую очередь с продукцией провоспалительных цитокинов, являющихся непременным атрибутом системного воспалительного ответа [13]. К 20-му дню лечения содержание «неклассических» моноцитов в крови нормализуется. Кроме того, у пациентов, не получавших вакцину «Псевдовак», на 10-й день лечения наблюдается снижение количества HLA-DR+-моноцитов. Учитывая, что HLA-DR-рецептор является продуктом главного комплекса гистосовместимости II класса, который осуществляет презентацию антигенов клеткам адаптивного иммунитета [14], подобное снижение активированных моноцитов может привезти к недостаточной эффективности иммунных процессов в указанный период. Среди популяций лимфоцитов, активно участвующих в системе врожденного иммунитета, нами исследованы содержание NKT- (CD3+CD16/56+) и NK-клеток (CD3-CD16/56+). NKT-клетки играют важную роль в регуляции иммунного ответа, связывая механизмы врожденного и адаптивного иммунитета. Подобно нейтрофилам, NKT-клетки одними из первых реагируют на проникновение в организм чужеродных агентов [15]. У больных с ПТ количество NKT-клеток повышено уже с 1-го дня обследования и остается высоким весь период лечения. При использовании вакцины «Псевдовак» количество NKT-клеток значительно повышается уже на 10-й день лечения и остается повышенным на 20-й день относительно уровня, выявленного у пациентов со стандартным лечением. NK-клетки являются активными эффекторами на ранних стадиях реакций врожденного и регуляции адаптивного иммунитета [15]. У больных с ПТ на 1 -й день выявляется высокий уровень NK-клеток в периферической крови. У пациентов на фоне стандартного лечения к 20-му дню наблюдения количество клеток данной популяции нормализуется. При ORIGINAL INVESTIGATIONS использовании вакцины «Псевдовак» в конце периода лечения обнаружено более низкое содержание NK-клеток относительно и контрольных значений, и уровня, выявленного у больных, не получавших вакцинный препарат. Фенотипирование данной популяции лимфоцитов позволило охарактеризовать их субпопуляционный состав у больных с ПТ. Обнаружено, что уже на 1-й день обследования в периферической крови больных с ПТ повышается количество цитокинпродуцирующих NK-клеток (CD16lowCD56bright). У больных на фоне стандартного лечения содержание данной субпопуляции нормализуется к 20-му дню, тогда как при использовании вакцины «Псевдовак» повышенный уровень регуляторной фракции NK-клеток сохраняется весь период наблюдения. Только на фоне использования вакцины «Псевдовак» при ПТ на 10-й день лечения повышается уровень цитотоксических NK-клеток (CD16brightCD56low). Причем их повышенное количество сохраняется и на 20-й день лечения. Таким образом, можно предположить, что механизм действия вакцины «Псевдовак» реализуется через воздействие на PRR клеток врожденного иммунитета, следствием чего является активация иммунной системы, сопровождающаяся увеличением числа NKT-клеток, цитокинпродуцирующих и цитотоксических NK-лимфоцитов и провоспа- лительных моноцитов. Целесообразность применения вакцины «Псевдовак» обусловлено тем, что реализуется двойной эффект: во-первых, формируется адаптивный иммунитет против одной из распространенных инфекций; во-вторых, за счет активации врожденного иммунитета преодолевается иммунодепрессия, возникающая при политравме. Выводы 1. При использовании вакцины «Псевдовак» у больных с политравмой в периферической крови повышается количество моноцитов с фенотипом CD14hiCD16+ («неклассический»), принимающих участие в реализации системновоспалительного ответа, и сохраняется уровень HLA-DR- моноцитов, осуществляющих презентацию антигена и, соответственно, стимуляцию реакций адаптивного иммунитета. 2. Количество NKT-клеток (участвуют в имму- норегуляторных процессах) у больных с политравмой повышается при лечении вакциной «Псев- довак», тогда как содержание общих NK-клеток - снижается, но при сохранении высокого уровня цитокин-продуцирующей фракции. 3. У больных с политравмой в 1-е сутки лечения наблюдается повышение содержания нейтрофи- лов в крови. К 20-му дню лечения их количество снижается как на фоне стандартного лечения, так и при использовании вакцины «Псевдовак». Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки. Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

About the authors

A. G Borisov

Institute of Medical Problems of the North; Krasnoyarsk State Medical University named after Prof. V.F. Voino-Yasenetsky

3G, Partizana Zheleznyaka str., Krasnoyarsk, 660022, Russian Federation

A. A Savchenko

Institute of Medical Problems of the North; Krasnoyarsk State Medical University named after Prof. V.F. Voino-Yasenetsky

Email: immun@impn.ru
3G, Partizana Zheleznyaka str., Krasnoyarsk, 660022, Russian Federation

I. V Kudryavtsev

Institute of Experimental Medicine; Far Eastern Federal University

12, Akademika Pavlova str., St. Petersburg, 197376, Russian Federation

E. P Tikhonova

Krasnoyarsk State Medical University named after Prof. V.F. Voino-Yasenetsky

Partizana Zheleznjaka street, Krasnoyarsk, 660022, Russian Federation

T. Yu Kuz'mina

Krasnoyarsk State Medical University named after Prof. V.F. Voino-Yasenetsky

Partizana Zheleznjaka street, Krasnoyarsk, 660022, Russian Federation

V. D Belenyuk

Institute of Medical Problems of the North

3G, Partizana Zheleznyaka str., Krasnoyarsk, 660022, Russian Federation

References

Supplementary files