ELISA diagnostic test systems, serodiagnosis of arboviral infections

Full Text

Арбовирусы - это экологическая группа вирусов позвоночных животных, передающихся естественным хозяевам и человеку через укусы кровососущих членистоногих. Общее число арбовирусов в мире составляет более 600. По крайней мере 150 из них известны как возбудители заболеваний человека. В странах СНГ (включая Россию) установлена циркуляция более 50 арбовирусов. Для 21 вируса установлена патогенность для человека (8 из них вызывают лихорадочные гриппоподобные заболевания; 4 сопровождаются сыпью, артритами и ар- тралгиями; 13 протекают с симптомами поражения ЦНС). Среди эндемичных зоонозных инфекций наибольшее значение в РФ имеют клещевой энцефалит (КЭ), геморрагическая лихорадка с почечным синдромом, лихорадка Западного Нила (ЛЗН), крымская геморрагическая лихорадка (КГЛ) и, очевидно, заболевания группы калифорнийского энцефалита. Проблема диагностики малоизученных арбовирус- ных заболеваний связана главным образом с отсутствием качественных диагностических препаратов, доступных для применения в практических лабораториях. В лаборатории биологии и индикации арбови- русов ФГБУ ФНИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи Института вирусологии им. Д.И. Ивановского Минздрава России разработаны, охарактеризованы, стандартизированы и нашли практическое применение следующие экспериментальные иммуноферментные (ИФА) тест-системы: а) для выявления специфических IgM- и IgG-антител в сыворотках крови людей к вирусам Синдбис и Чикунгунья (сем. Togaviridae), Западного Нила (ЗН), японского энцефалита (ЯЭ), желтой лихорадки (ЖЛ), денге, Усуту, клещевого энцефалита (сем. Flaviviridae), Крымской-Конго геморрагической лихорадки (ККГЛ), Тягиня, Инко, Батаи, неаполитанской и сицилийской москитной лихорадки, Укуниеми, Бханджа (сем. Bunyaviridae) и Дхори (сем. Orthomyxoviridae); б) для серологической идентификации штаммов и обнаружения антигенов перечисленных эндемичных и актуальных для РФ тропических арбовирусов (денге, Чикунгунья, ЛЗН, ЯЭ, ЖЛ, москитных лихорадок) в экспериментальных, клинических и полевых материалах; в) для выявления IgG-антител к вирусам восточного, западного и венесуэльского энцефалита лошадей (сем. Togaviridae) в сыворотках крови лошадей; г) для выявления IgG-антител к вирусам ККГЛ и Батаи в сыворотках крови овец. Существенный прогресс в технологии приготовления ИФА-дагностикумов во многом связан с внедрением нового мембранного способа получения пероксидазных конъюгатов, который используется в лаборатории уже более десяти лет. Конъюгаты с пероксидазой являются важным компонентом большинства коммерческих имму- ноферментных тест-систем. Наиболее распространенный на сегодняшний день метод конъюгации (мечения пероксидазой) с помощью перйодатного окисления, который был предложен Р.К. Nakane и A. Kawaoi (1974 г.). Использованный в нашей работе новый способ приготовления пероксидазных конъюгатов основывается на использовании нанотехнологических методов, в частности, применении мембран с известной наноструктурой и размерами пор. Предложенная технология предусматривает замену диализа и хроматографии на ультрафильтрацию в ячейках. На 1-й стадии (активации пероксидазы с помощью NaIO4) диализ или хроматография на колонке с носителем G-25, заменяется на фильтрацию через различные типы мембран (например, полисульфоновые или ацетилцеллюлозные и др.), а также ядерные фильтры с порами различной формы (цилиндрические, конусообразные и др.) с близким размером пор. На 2-й стадии (образования конъюгата с альдегид- пероксидазой) диализ и хроматография на колонке с носителем G-200 также заменяется на фильтрацию через мембраны. Мембранный способ имеет преимущество перед методом гельфильтрации, заключающееся в простоте технологии и экономичности, что дает возможность получать высокоактивный и специфичный продукт как в препаративных, так и промышленных количествах. Разработанные ИФА-тест-системы для детекции специфических IgM-, IgG-антител и антигенов вирусов ККГЛ и ЗН прошли успешные испытания в ГИСК им. Л.А. Тарасевича и рекомендованы к регистрации в РФ Комитетом медицинских иммунобиологических препаратов (протокол № 6 от 26.06.03 г.). На ИФА-тест-системы для специфической диагностики ЛЗН в 2012 г. получено регистрационное удостоверение (ФСР 2012/13840), в соответствии с чем они разрешены к применению на территории РФ и внедрены в коммерческое производство ЗАО “Биосервис”. В течение 1999-2009 гг. в ходе программы по диагностике заболеваний, вызываемых вирусами Синд- бис, Чикунгунья, ЗН, КЭ, денге, ЯЭ, ЖЛ, Тягиня, Инко, зайца-беляка, Батаи, ККГЛ, Укуниеми, Дхори и Бханджа практическим и научным лабораториям РФ были предоставлены 4174 тест-системы: 2074 набора для выявления специфических IgM-антител в сыворотках крови больных людей, 911 для выявления IgG-антител и 1117 для детекции антигенов ар- бовирусов. Альтернативные отечественные коммерческие препараты для диагностики этих инфекций (за исключением КЭ, ЛЗН и КГЛ) в настоящее время отсутствуют, зарубежные тест-системы для диагностики ЛЗН и лихорадки денге не нашли применения в практических лабораториях РФ. Наличие в лаборатории широкого спектра диагностических ИФА-тест-систем позволило в 1999 г. впервые установить значение вируса ЛЗН в этиологии эпидемии ЛЗН в южном регионе России (Астраханская, Волгоградская области и Краснодарский край), в 2010 г. расшифровать этиологию вспышки ЛЗН в Воронежской области, в 2012 г. выявить первые случаи ЛЗН в Тульской области. В 2000-2001 гг. впервые были выявлены случаи КГЛ в Волгоградской области (27), Калмыкии (12) и Дагестане (9), что явилось доказательством значительного расширения ареала этой тяжелой инфекции. С 1999 по 2014 гг., по данным Роспотребнадзора, в РФ было диагностировано 2284 случая ЛЗН и 1725 случаев КГЛ с применением в основном экспериментальных ИФА-тест-систем лаборатории биологии и индикации арбовирусов и коммерческих диагностикумов ЗАО “Биосервис”. В результате использования наших наборов ИФА-IgM в 1997-2010 гг. в южных регионах России было выявлено 52 случая малоизученных арбови- русных инфекций, этиологически связанных с вирусами: Синдбис (7), Батаи (6), Тягиня и Инко (22), москитных лихорадок Неаполь (1) и Сицилия (4) (последние были впервые верифицированы в РФ), Бханджа (4) (впервые в РФ) и Укуниеми (8) (впервые в мире). При обследовании методом ИФА-IgG сывороток крови доноров - жителей Южного региона страны были обнаружены G-антитела к вирусам Синдбис, Батаи, Тягиня, Инко, Укуниеми с частотой от 0,8 до 8,0%. С целью изучения иммуноструктуры населения европейской части территории России методами ИФА-IgG и реакции нейтрализации на специфические антитела к вирусу ЛЗН в течение 2011-2015 гг. было обследовано 5883 сыворотки крови жителей 17 регионов европейской части России от Краснодарского и Ставропольского краев до Вологодской области. В 2012-2014 гг. специфические IgG- и нейтрализующие антитела к вирусу ЛЗН были обнаружены в сыворотках крови жителей Астраханской области (19,6 % из 657), Ставропольского края (5,4% из 56), Краснодарского края (4,5% из 243), а также Воронежской (1,6% из 128), Тульской (1,5% из 400), Липецкой (0,9% из 327), Саратовской (0,8% из 1448), Тамбовской (0,7% из 1023) областей. Единичные положительные находки антител в сыворотках крови жителей Московского региона могут быть связаны с инфицированием серопозитивных лиц во время пребывания в эндемичных регионах. Результаты обследования жителей Татарстана, Тверской, Калужской, Курской, Ульяновской, Рязанской и Вологодской областей оказались отрицательными. Данные серологического обследования населения эндемичных территорий (Астраханской области, Ставропольского и Краснодарских краев, Тульской, Воронежской и Саратовской областей) в целом коррелируют с показателями заболеваемости и известной продолжительностью эпидемиологической активности ЛЗН на этих территориях. В период 2009-2014 гг. с использованием ИФА- IgM и ИФА-IgG было верифицировано 190 завозных случаев лихорадок: денге (169), Чикунгунья (10), ЗН (6), москитных (3), ЯЭ (1) среди лиц, госпитализированных в Инфекционную клиническую больницу № 1 Москвы после возвращения из поездок в тропические страны. Представленные данные свидетельствуют об актуальности проведения дальнейших исследований по изучению роли в патологии человека эндемичных и актуальных для РФ тропических арбо- вирусов и необходимости создания эффективной системы специфической диагностики этих инфекций.

About the authors

V. F Larichev

The N.F. Gamaleya Federal Research Center for Epidemiology and microbiology

Email: vlaritchev@mail.ru
18, Gamaleya str., Moscow, Russian Federation, 123098

A. A Kozlova

The N.F. Gamaleya Federal Research Center for Epidemiology and microbiology

Email: arboelisa@mail.ru
18, Gamaleya str., Moscow, Russian Federation, 123098

M. A Saifullin

Infectious Clinical Hospital No1

Email: dr_saifullin@mail.ru
63, Volokolamskoe shosse, Moscow, Russian Federation, 123367

N. V Khutoretskaia

The N.F. Gamaleya Federal Research Center for Epidemiology and microbiology

Email: arboelisa@mail.ru
18, Gamaleya str., Moscow, Russian Federation, 123098

V. M Shkinev

The N.F. Gamaleya Federal Research Center for Epidemiology and microbiology

Email: vshkinev@mail.ru
18, Gamaleya str., Moscow, Russian Federation, 123098

A. M Butenko

The N.F. Gamaleya Federal Research Center for Epidemiology and microbiology

Email: arboelisa@mail.ru
18, Gamaleya str., Moscow, Russian Federation, 123098

References

Supplementary files