Molecular genetic characterization of Vibrio cholerae non-01/non-0139 strains isolated from ship ballast and port surface water in rostov region

Full Text

В системе эпидемиологического надзора по холере одно из ведущих мест занимают исследования открытых водоемов. В процессе проведения мониторинга поверхностных водоемов и хозяйственно-бытовых стоков на наличие возбудителей холеры в водных объектах Ростовской области обнаруживаются Vibrio cholerae non-O1/non- O139 серогрупп, а также имеют место случаи выделения штаммов от больных острыми кишечными инфекциями (ОКИ), вибриононосителей и лиц, контактировавших с ними. Обнаружение штаммов обусловливает необходимость выяснения основных причин и условий, способствующих появлению и распространению вибрионов в поверхностных водоемах. Многочисленными исследованиями установлена связь между обнаружением вибрионов и сбросом в водоемы недостаточно очищенных хозяйственно-бытовых, производственных и ливневых сточных вод, а также загрязнениями, поступающими с прибрежных территорий населенных пунктов, не имеющих канализации. Определенное значение в распространении вибрионов принадлежит морскому транспорту, который заносит с балластными водами различные виды морских обитателей, в том числе вирусы и бактерии, патогенные для человека. Так, занос возбудителя холеры в страны Южной Америки в 1991 г. эксперты ВОЗ полностью связывают с морскими судами. Холерные вибрионы non-O1/non-O139 сегодня являются предметом пристального внимания исследователей и практических эпидемиологов, учитывая то обстоятельство, что их штаммы являются по сути природными резервуарами генов, расширяющих патогенный и эпидемический потенциал и способных передаваться V. cholerae О1 и О139 серогрупп. Так, штаммы V cholerae non-O1/non-O139 могут служить источником для вибрионов эпидемически значимых серогрупп новых, ранее не встречавшихся у них комбинаций генов устойчивости к антимикробным соединениям [1]. В Ростовской области в течение 2010-2014 гг. ФКУЗ “Ростовский-на-Дону противочумный институт” Роспотребнадзора и Управление Роспотребнадзора по Ростовской области ведут исследования балластных вод судов, прибывающих в порты Ростовской области из-за рубежа, на наличие холерных вибрионов. За период 2010-2014 гг. исследовано 285 проб балластной воды, возбудители холеры обнаружены не были, однако в 76 (26,66 %) пробах были выделены штаммы V cholerae non-O1/non- O139. В данной работе проведен сравнительный анализ генотипов штаммов V. cholerae non-O1/non-O139, выделенных из судовых балластных вод и прибрежной зоны Таганрогского залива в 2013 г., по маркерам множественной антибиотикорезистентности, связанным с мобильными генетическими элементами холерного вибриона, с целью доказательства заносного характера обнаруживаемых в балластных водах судов штаммов V cholerae non-O1/non- O139. Материалы и методы В исследование были взяты 10 штаммов V cholerae non-O1/non-O139: 7 штаммов, изолированных из балластных вод морских судов, прибывших в порты Ростовской области, и 3 штамма, изолированных в рекреационной зоне Таганрога (табл. 1). Отбор проб проводился сотрудниками лаборатории санитарной охраны территории ФКУЗ «Ростовский-на-Дону противочумный институт» Роспотребнадзора предложенными ими способами в зависимости от конструкции судна: через специальные люки, смотровые крышки балластных емкостей, замерные отверстия балластных цистерн с помощью насоса [2]. Выделение и идентификация штаммов проведены сотрудниками лаборатории микробиологии холеры Ростовского-на-Дону противочумного института в соответствии с МУК 4.2.2218-07 [3]. Дифференциацию водных штаммов холерных вибрионов от V cholerae О1 и О139 проводили с использованием моноклональных антител в реакции слайд-агглютинации. Исследование на генетические маркеры множественной антибиотикорезистентности проведены в Волгоградском противочумном институте. Для выделения геномных ДНК 200 мкл бактериальной суспензии в 0,15 М NaCl, pH 7,2 плотностью 2 • 109 м.к./мл смешивали с равным объемом лизирующего буфера (20 мМ трис-HCl, 100 мМ KCl, 5 мМ MgCl2, 0,2 мг на 1 мл желатина, 0,9% Nonidet P-40, 0,9% твин-20, 150 мкг/мл протеиназы К), инкубировали при 65oC 120 мин и прогревали при 96oC 30 мин для инактивации фермента. Далее пробы центрифугировали (10 000 об/мин, 1 мин), 10 мкл супернатанта использовали при постановке ПЦР. Таблица 3 Характеристика штаммов V cholerae non-01/non-0139 по генетическим маркерам множественной антибиотикорезистентности Генетический маркер Генотип Штамм V cholerae non-О1/non-Q139 qacEdelta1sul qacEdelta1-sul рекомбинированный intSXT 27 - - + A 28 + + + B 32 - - - C 33 + - + D 36 - - + A 38 - - + A 52 - + + E 59 + - - F 117 - - + A 182 + - - F Таблица 1 Исследуемые штаммы V cholerae non-O1/non-O139 Штамм Дата забора Место забора (судно, порт) Источник выделения 27 09.08.13 Волго-Балт 220, Таганрог 28 16.08.13 Волго-Балт 220, Таганрог 32 23.08.13 Сандра 2, Таганрог Балластные во- 33 24.08.13 ВФ Танкер 4,Таганрог ды судов 38 01.09.13 ВФ Танкер 4, Таганрог 36 01.09.13 Астон Трэвелер, Ростов 52 22.09.13 ВФ Танкер 8, Таганрог 59 20.05.13 Пляж "Тополь", Таганрог Азовское море 117 10.06.13 Акватория порта Таганрог Азовское море 182 01.07.13 Пляж "Маяковка", Таганрог Азовское море П р и м е ч а н и е. Штаммы № 27 и 28 выделены с одного и того же судна «Волго-Балт 220», штаммы № 33 и 38 - с одного и того же судна «ВФ Танкер 4». Наличие в геномах исследуемых штаммов нуклеотидных последовательностей интегронов класса 1 (In1) и интегративных конъюгативных элементов семейства Таблица 2 Олигонуклеотидные праймеры, использованные в работе Прай- Последовательность 5’-3’ Мишень* мер qacEd1 ATCGCAATAGTTGGCGAAGT Ген устойчивости к четвертичным аммониевым соединениям qacEdelta1 3’-юнсервативного сегмента интегронов In1 (accession no. Х15370, 211-230) sul GCAAGGCGGAAACCCGCC Ген устойчивости к суль- фонамидам sul1 3’-консервативного сегмента интегронов In1 (accession no. X12869, 1360-1341) SXT-F TTATCGTTTCGATGGC SXT-B GCTCTTCTTGTCCGTTC Ген интегразы int SXT- элемента (accession no. AF099172, 129-144 и 915-931) П р и м е ч а н и е. * - указаны позиции праймеров на последовательностях In1 и SXT, представленных в Genbank NCBI (www.ncbi.nlm.nih. g°v). SXT/R391 исследовали в ПЦР с использованием набора генспецифических праймеров, перечисленных в табл. 2. Амплификацию участка 3’-консервативного сегмента интегронов In1 (праймеры qacEd1-sul) и фрагмента гена интегразы intXT (праймеры SXT-F - SXT-B) проводили по программе: прогрев 95oC 5 мин, 40 циклов (94oC - 30 с, 57oC - 30 с, 72oC - 60 с), финальная элонгация 72oC 10 мин, температура отжига праймеров составляла 58 и 55oC соответственно. Продукты ПЦР анализировали в 1,5% агарозных гелях. Результаты и обсуждение Множественная устойчивость к антибиотикам у V cholerae может формироваться в результате горизонтального генетического переноса, опосредованного трансмиссивными плазмидами, интегронами, а также трансмиссивными интегративными элементами (ICE). Интегроны, локализованные на хромосомах либо внехромосомных элементах способны включать в свой состав индивидуальные генные кассеты по механизму сайтспецифической рекомбинации. Структурно инте- гроны состоят из центрального вариабельного региона, несущего вставки генных кассет, и фланкирующих его 5’- и 3’-консервативные сегменты. Общими элементами интегронов являются ген intI, кодирующий интегразу семейства тирозиновых рекомбиназ, сайт рекомбинации attI и промотор Pc, обеспечивающий транскрипцию внедренных генных кассет. В составе каждой из генных кассет присутствует сайт узнавания интеграз attC (59 bp-элемент). Область кассетной вставки In1 может включать от одной до десяти кодирующих последовательностей генов устойчивости к антимикробным соединениям различных классов (бета-лактамы, аминогликозиды, хлорамфеникол, сульфонамиды, макролиды, фосфо- мицин, линкомицин, рифампицин, отдельные антисептики) [4]. 1 234 56789 10 М 1 2345678 9 10 11 Детекция последовательностей интегронов класса 1 (треки 1-10, левая часть рисунка) и ICE элемента семейства SXT/R391 (треки 1-11, правая часть рисунка) в штаммах V. cholerae non-o1/non-o139. Обозначения: 1 - 27, 2 - 28, 3 - 32, 4 - 33, 5 - 36, 6 - 38, 7 - 52, 8 - 59, 9 - 117, 10 - 182, 11 - V cholerae B-191, М - ДНК-леддер 100 bp (100-500 bp). ICE (SXT-элементы) - крупные (60-100 kbp) транспозоноподобные структуры, интегрированные в определенные хромосомные локусы возбудителя холеры, способные к вырезанию и конъюгативному переносу, однако не способные к автономной репликации. Наряду с генами транс- позаз и генами Tra+-фенотипа, в составе различных типов ICE обнаружены гены резистентности к триметоприму (dfr), стрептомицину (strA, strB), сульфаметоксазолу (sul2) и хлорамфениколу (floR) [5]. Таблица 4 Анализ транспортных связей судов, из балласта которых выделены штаммы V cholerae non-01/non-0139 Номер штамма Дата отбора пробы Место отбора (наименование судна, флаг государства) Порт убытия Порт прибытия Объем балласта на борту, т Место смены балласта (координаты) 27 09.08.13 “Волго-Балт 220”, Белиз Немрут, Турция Таганрог, РФ 1200 Эгейское море (3805 2,2'N-26048,9'E; 40000,4/N- 29°09,3'E) Мраморное море (41013,2'N-29007,9'E), Черное море (44055,9/N-36012,6/E), Азовское море (45056,1/N-36058,3/E) 28 16.08.13 “ Волго-Балт 220”, Белиз Керчь, Украина Таганрог, РФ 2380 Черное море (44026,8/N-35040,9/ Е), Азовское море (45043,6/N-36055,2/E) 32 23.08.13 “Сандра 2”, Сент-Китс и Невис Самсун, Турция Таганрог, РФ 800 Азовское море (45027,3'N-36045,5'E; 45°59,7'N- 37003,8/Е) 33 24.08.13 “ВФ Танкер 4”, Россия Керчь, Украина Таганрог, РФ 3500 Черное море (45005,9/N-36031,2/E; 45°07,5'N- 36029,8/Е), Черное море (45012,1/N-36029,9/E; 45°25,6'N- 36043,6/Е), Азовское море (45025,8/N-36055,2/E; 46019,0/N- 37014,0/Е) 36 01.09.13 “Астон Трэвелер”, Россия Бандырма, Турция Ростов, РФ 600 Мраморное море (40058,2/N-28054,8/E; 41018,0/N- 29016,0/Е), Черное море (44050,4/N-36029,5/E; 45038,7/N- 36052,6/Е), Нулевой км реки Дон 38 01.09.13 “ВФ Танкер 4”, Россия Керчь, Украина Таганрог, РФ 3000 Черное море (45006,0/N-36031,4 Е; 45028,3/N- 36046,8/Е), Азовское море (45036,0/М-36051,0/Е; 46006,2/N- 37007,0/Е) 52 22.09.13 ВФ Танкер 8, Россия Керчь, Украина Таганрог, РФ 3000 Азовское море (46001,0/М-37004,8/Е) Результаты проведенного ПЦР-анализа приведены на рисунке. Полноразмерные специфические фрагменты последовательностей 3’-консервативного сегмента интегронов класса 1 (гены qacEdelta1-sul, размер ам- пликона 800 bp) детектированы в 4 исследуемых штаммах (№ 28, 33, 59, 182), причем в штамме V cholerae 28 выявлен дополнительный ампликон размером порядка 700 bp, что может свидетельствовать о дупликации таргетной последовательности вследствие рекомбинационных событий. Результат амплификации с праймерами qacEdelta1-sul ДНК штамма V cholerae 52, где детектируется фрагмент 300 bp (трек 7, левая часть), может быть следствием делеции во внутренней области 3’- консервативного сегмента. Специфический фрагмент интегразы intSXT размером 870 bp обнаружен в 7 из 10 исследованных штаммов вибрионов non-О1/non-О139, что свидетельствует о наличии в их геномах ICE-элемента семейства SXT/R391 (см. рисунок, правая часть электрофореграммы). В качестве положительного контроля был использован штамм V. cholerae В-191 О139-серогруппы, несущий ICE элемент семейства SXT/R391, принадлежащий к варианту SXTMO10 [6]. Данные о выявленных генотипах исследованных штаммов по анализируемым маркерам суммированы в табл. 3. Как следует из полученных результатов, группы штаммов № 27, 36, 38, 117 и № 59, 182 принадлежат к двум более часто встречаемым генотипам и идентичны в пределах групп по исследованным генетическим маркерам, тогда как остальные изоляты характеризуются уникальными генотипами. Таким образом, судя по результатам проведенного анализа, единый (но независимый друг от друга) источник происхождения могут иметь группы штаммов № 27, 36, 38, 117 (балластные воды и акватория порта) и № 59, 182 (пляжи). Штаммы № 28, 32, 33, 52, выделенные из образцов балластных вод судов, характеризуются уникальными генотипами по анализируемым маркерам, что указывает на их различные источники происхождения и отличия от штаммов, выделенных на пляжах и в акватории порта. Анализ транспортных связей судов (табл. 4) c выделенными штаммами, характеризующимися уникальными генотипами, показал, что холерные вибрионы могут быть поэтапно занесены в акватории портов Средиземного и Черного морей из других акваторий. Порты Средиземного и Черного морей могут быть “реципиентами” балласта судов, прибывших из стран, неблагополучных по холере, и “донорами” для судов, следующих в Азовское море. Подтверждением этому служит наличие различных генетических маркеров у штаммов № 27 и 28, выделенных с одного и того же судна “Волго-Балт 220” в разные сроки, и штаммов № 33 и 38, изолированных с одного и того же судна “ВФ Танкер 4” в августе и сентябре 2013 г. Несмотря на проводимые балластные операции, наличие схожих по генотипу штаммов в водяном балласте судов и в акватории Азовского моря может свидетельствовать, что рекомендуемый Конвенцией способ смены балласта D-1 при переходе из одной акватории в другую на судах смешанного «река - море» плавания малоэффективен. По мнению Н.В. Сустретовой, даже при троекратной смене балласта в танках образуются застойные зоны и полной смены воды не происходит [7]. Таким образом, результаты проведенного генетического анализа штаммов V cholerae non-O1/non-O139, изолированных в прибрежной зоне Таганрогского залива и выделенных из судовых балластных вод, подтверждают заносной характер последних, что свидетельствует о выявлении нового объекта эпидемиологического надзора при холере в Российской Федерации, мероприятия для которого предложены нами ранее [8].

About the authors

I. B Zakharova

Volgograd Anti-Plague Research Institute of Federal Service on Customers' Rights Protection and Human Well-being Surveillance

7, Golubinskaya Str., Volgograd, Russian Federation, 400131

S. Yu Vodyanitskaya

Rostov-on-Don Institute for Plague Control of Federal Agency for Consumer Rights Protection and Human Welfare Supervision

117/40, M. Gorkogo Str., Rostov-on-Don, Russian Federation, 344002

M. V Podshivalova

Volgograd Anti-Plague Research Institute of Federal Service on Customers' Rights Protection and Human Well-being Surveillance

7, Golubinskaya Str., Volgograd, Russian Federation, 400131

V. D Kruglikov

Rostov-on-Don Institute for Plague Control of Federal Agency for Consumer Rights Protection and Human Welfare Supervision

117/40, M. Gorkogo Str., Rostov-on-Don, Russian Federation, 344002

I. V Arkhangelskaya

Rostov-on-Don Institute for Plague Control of Federal Agency for Consumer Rights Protection and Human Welfare Supervision

117/40, M. Gorkogo Str., Rostov-on-Don, Russian Federation, 344002

D. V Viktorov

Volgograd Anti-Plague Research Institute of Federal Service on Customers' Rights Protection and Human Well-being Surveillance

7, Golubinskaya Str., Volgograd, Russian Federation, 400131

References

Supplementary files