il 28B polymorphisms and the prognosis for the efficacy of antiviral therapy in viral hepatitis C patients in Uzbekistan

Full Text

Распространение вирусного гепатита С (ВГС) остается проблемой глобального характера, с ростом числа анти-ВГС-позитивных лиц от 122 млн до более чем 185 млн за период 1990-2005 гг. Регионы Центральной и Восточной Азии, Северной Африки, а также Среднего Востока имеют наиболее высокий уровень инфицированности ВГС (> 3,5%) [1]. Многочисленные исследования и публикации по проведению противовирусной терапии в западных странах показали, что комбинированное лечение с применением пегилированного интерферона-альфа (Peg-IFN) и рибавирина (RBV) остается весьма эффективным среди инфицированных ВГС в Центральной Азии [2, 3]. Однако это лечение не только является дорогостоящим, но и имеет довольно много побочных эффектов, приводящих к снижению приверженности к противовирусной терапии вплоть до ее отмены. Более того, почти половина ВГС-инфицированных пациентов, получающих противовирусное лечение, не достигают устойчивого противовирусного ответа. Наряду с многочисленными host-факторами (такими как возраст, пол, этническая принадлежность, стадия фиброза и т. д.), вирусологическими факторами (генотип вируса и вирусная нагрузка), оказывающими влияние на эффективность при противовирусной интерфе- ронотерапии, было также выявлено значительное влияние недавно обнаруженных генетических однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) в участке гена интерлейкин-28В (IL28B). Такие SNP имеют значительную прогностическую ценность при проведении противовирусного лечения, что было доказано исследованиями, проведенными в некоторых странах [4-6]. Полиморфизмы, обнаруженные в области гена IL28B, формируют группу, кластеризуются в отдельный гаплотип в пределах небольшого участка гена, содержащего низкорекомбинатный фрагмент. Среди всех SNP, обнаруженных в этом кластере, наиболее точными и прогностичными в ответе на противовирусное лечение пациентов интерферонами (IFN) оказались маркеры гаплотипа SNP rs8099917 и rs12979860 [7-10]. Относительно недавно при изучении когорты афро-американцев, был выявлен новый участок гена интерферон-ламбда4 (IFNL4), локализованный в непосредственной близости к гену IL28B, который также связан с элиминированием вируса при ВГС [11]. Как оказалось, SNP в области гена IFNL4 имели еще более высокий уровень прогностической ценности исхода противовирусной терапии среди популяции афро-американцев, а далее и среди европейцев и японцев [12-20]. Узбекистан, являясь одной из наиболее густонаселенных стран Центральной Азии, с наибольшим числом популяций, проживающих на территории, относится к странам с высоким уровнем распространения ВГС (общая популяция > 6,4%; в группе риска > 20%) [21]. Наиболее распространенным в стране является генотип 1b, затем 3а [22, 23]. В связи с заселением страны народностями, имеющими разное этническое происхождение, целью наших исследований были определение распространенности полиморфизмов IL28B и IFNL4 и их связь с эффективностью противовирусной терапии в зависимости от генотипов SNP и этнической принадлежности в этой стране. Материал и методы В данные исследования были вовлечены амбулаторные больные, хронически инфицированные ВГС и получавшие комбинированное противовирусное лечение Peg-IFN + RBV, по стандартной схеме в НИИ вирусологии Минздрава Республики Узбекистан. С каждым пациентом было заключено письменное соглашение. Данное исследование отвечает требованиям Декларации Хельсинки (пересмотренное в г. Сеул, Корея, в 2008 г.). Пациенты, а также их лечащие врачи заполняли вопросники, которые использовались для сбора социоэкономических, демографических, клинических и лабораторных данных. Диагноз хронического ВГС ставился на основании обнаружения анти-ВГС и РНК/ВГС. Вирусная нагрузка определялась методом ПЦР в реальном времени с помощью тест-системы Амплисенс HCV- Monitor-FL (ООО «ИнтерЛабСервис», Москва), которая имеет пределы обнаружения генетического материала 300 - 108 МЕ/мл (или 1Т03-3Т08 копий/мл РНК/ВГС). Общее число пациентов, получивших полный курс противовирусной терапии, составило 135 человек. В исследованиях использовался материал только от тех лиц, которые получали противовирусное лечение, как минимум 80 % от назначенного курса лечения и с наиболее полными клиническими и лабораторными данными. Пациенты с почечной и печеночной недостаточностью, а также с циррозом печени в стадии декомпенсации (число по Чайлд-Пью более 6) и гепатоцеллюлярной карциномой были исключены из данных исследований. Этническая принадлежность определялась по анкетам-вопросникам, заполненным пациентами. Больные, принадлежащие к народностям узбеки, киргизы, казахи и таджики, были объеденены в Средне-Азиатскую (СА) группу; пациенты русской, татарской и украинской этнических народностей - в Восточно-Европейскую (ВЕ) группу. Другие народности были исключены из данных исследований из-за малого числа обследованных. Противовирусная терапия при ВГС Хронически инфицированные ВГС пациенты получали лечение Peg-IFN-a и RBV по стандартной схеме. Вирусная нагрузка определялась методом ПЦР в реальном времени, непосредственно до начала терапии. Затем, в ходе противовирусной терапии, отслеживались изменения вирусной нагрузки на 4-й и 12-й неделях лечения. Для определения прогностической значимости SNP-генотипов в исходе противовирусного лечения пациенты были разделены на 2 группы: 1- я - не отвечающие на лечение - NVR (no viral response) - пациенты, у которых соотношение РНК/ ВГС обнаруживалось на 4-й, 12-й неделях лечения или через 24 нед после окончания лечения. 2- я - отвечающие на лечение - VR (viral response) - пациенты, у которых значение соотношения РНК/ ВГС опускалось ниже уровня детекции в ходе лечения и не обнаруживалось как во время, так и после окончания лечения. Если у пациента за 12 нед лечения не наблюдалось снижение вирусной нагрузки хотя бы на 2 log или больше, то противовирусная терапия прекращалась. IL28B SNP-генотипирование В качестве материала для исследований использовалась цельная кровь, из которой получали взвесь мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC) путем центрифугирования. Геномную ДНК выделяли из PBMC с помощью тест-системы QI- Amp DNA Mini Kit (производства «Quiagen», Вель- но, Голландия). Все образцы были генотипированы на SNP rs8099917, rs12979860, rs8103142 и rs11881222, используя ранее описанные методы, основанные на применении специальных проб [24]. В исследованиях мы использовали два метода с применением проб - это методы Invader Plus и TaqMan probe, чувствительность и специфичность которых были проверены методом прямого секвенирования. Прямое секвенирование проводилось с применением праймеров области SNP rs12979860: t63_L(5’-GGAAGGAGCAGTTGCG-3’); t63_R(5’- GGCTGTGGGTCCTGT-3’); t64_L(5’-GACAGGAACGGGTGTATG-3’); t64_R(5’-AGCTCTGATGTTGGGAAAG-3’). Полученные данные подвергались статистической обработке, используя программы SPSS 17.0 (SPSS для Windows). Различия по категориям были выражены в числах и процентах, распределение выражалось средними значениями стандартных отклонений. При необходимости использовался тест Фишера (Fisher’s Exact Test), и статистически достоверными считались показатели p < 0,05. Расчет (OR) производился с помощью анализа логистической регрессии. Результаты и обсуждение Сравнение методов генотипирования Результаты генотипирования тремя различными методами Таблица 1 Всего обследованных (n = 135) (число случаев) по генотипам SNP генотип секвенирование Invader TaqMan расхождения, №/% rs12979860 СС 57 57 57 СТ 64 64 64 1 ТТ 14 14 14 rs8099917 ТТ 90 89 89 TG 40 40 40 0,992% GG 5 6 6 Генотипирование IL28B проводилось с применением методов Invader Plus и TaqMan probe, с последующим подтверждением методом прямого секвенирования. По результатам, полученным при тестировании этими двумя способами, наблюдалось совпадение в 100% случаев и 99,2% - между результатами вышеуказанных двух методов и прямого сек- венирования, т.е. различия составили только 0,9% (табл. 1). Тем не менее в наших дальнейших исследованиях мы использовали метод TaqMan probe как наиболее распространенный и более простой в использовании. Ассоциация между генотипами SNP и исходом противовирусной терапии Характеристика по каждому из пациентов подробно дана в табл. 2. 135 пациентов (87,5% - СА и 12,5% - ВЕ групп), получали комбинированную противовирусную терапию в течение 24 или 48 нед по стандартной схеме Peg-IFN-a и RBV. Значительной разницы между группами по возрасту, полу, вирусной нагрузке и генотипам ВГС не наблюдалось. Также не было выявлено статистически достоверной разницы в проценте распространения пациентов NVR в группах СА и ВЕ (21,2 и 35,2% соответственно; р < 0,32) . Однако следует отметить, что была выявлена достоверная разница в распространенности SNP участков генов IL28B и IFNL4 в группах VR и NVR в каждой этнической группе. Для оценки клинических показателей по каждому SNP мы провели статистическое сравнение по каждому SNP и сопоставили показатели между пациентами VR и NVR по каждой этнической группе (табл. 3). По всем протестированным SNP так называемый благоприятный генотип (дикий тип) наблюдался во всех случаях положительного ответа на противовирусное лечение в группе CА, но в группе ВЕ этого не наблюдалось. Однако отметим интересный факт, что была обнаружена высокая корреляция полиморфизма в области недавно обнаруженного участка гена IFNL4, ss469415590 [11] с полиморфизмом SNP rs12979860 в области IFNL3 во всех исследованных группах, и каждый из них имел одинаково высокую прогностическую значимость (см. табл. 3). В результате проведенных исследований было установлено, что наиболее информативным маркером для прогноза положительного ответа на противовирусное лечение при ВГС является rs 8099917 Таблица 2 Показатели генотипирования в группах пациентов, хронически инфицрованных ВГС, получивших полный курс противовирусной терапии Показатель ЦА ВЕ Всего! VR NVR p VR NVR p VR NVR p n 93 25 11 6 104 31 Возраст (± стандартное отклонение) 39,7 ±1,5 39,7±3,2 0,437 45,2±3,6 39,3±5 0,358 40,6±1,3 37,9±2,9 0,346 Baseline HCV viral load (среднее • 106 ± стандартное отклонение) 3,1±8,9 4,2±2,3 0,609 1,6±6 1,2±5 0,663 2,9±6,7 3,4±1,7 0,727 IL28B (rs8099917) MA: n (%) 71 (76,4) 8 (32) < 0,001 8 (72,7) 3(50) 0,6 79 (76) 11 (35,5) < 0,001 HE&M: n (%) 22 (23,6) 17 (68) 3 (27,3) 3 (50) 25 (24) 20 (64,5) IL28B (rs12979860) MA: n (%) 47 (50,5) 4(16) 0,003 5 (45,5) 1 (16,6) 52 (50) 5 (16,1) < 0,001 HE&I: n (%) 46 (49,5) 21 (84) 6 (54,5) 5 (83,4) 0,333 52 (50) 26 (83,9) IFNL4 (ss469415590) MA: n (%) 47 (50,5) 4(16) 0,003 5 (45,5) 1 (16,6) 52 (50) 5 (16,1) < 0,001 HE&I: n (%) 46 (49,5) 21 (84) 6 (54,5) 5 (83,4) 0,333 52 (50) 26 (839) Примечание. VR - ответившие на лечение; NVR - Не ответившие на лечение. SNP участка гена IFNL3 (OR 5,75; 95% CI 2,4 - 13,6; p < 0,001), а затем SNP rs12979860/ss469415590 (OR, 5.2; 95% CI 1,9 - 14,6; p = 0,002). Прогностическая значимость маркеров SNP является показательной для всех генотипов ВГС и для всех обследованных групп пациентов. Достоверной разницы в прогностической значимости SNP-генотипов в зависимости от генотипов ВГС (1 - по сравнению с не 1-ми генотипами) обнаружено не было, хотя стоит отметить, что число пациентов с не 1-м генотипом ВГС было невелико, поэтому статистический анализ результатов имеет довольно низкую достоверность показателей. Генетические различия по этническим группам СА ВЕ Всего Рис. 1. Показатели специфической связи (LD) в локусе IL28B среди обследованных этнических групп. Все аллели по четырем протестированным SNP были в пределах Hardy Wienberg equilibrium. Три из них показали высокую специфическую связь (LD - Linkage Disequilibrium) между аллелями локуса IL28B в обеих этнических группах (рис. 1). Также статистической разницы между аллелями в группах СА и ВЕ обнаружено не было, однако минорный аллель SNP rs12979860 (ТТ) чаще встречался в группе ВЕ (р < 0,002) (рис. 2). В группе СА SNP rs8099917 имел более высокий уровень прогностической значимости, чем SNP rs12979860/ss469415590 (см. табл. 3), в то время как в группе ВЕ наблюдалась обратная тенденция. Тем не менее, статистически достоверной разницы обнаружено не было. По оси абсцисс: 4 различных SNP (rs8099917, rs12979860, rs8103142 и rs11881222); по оси ординат: показатели LD (linkage disequilibrium) - специфическая связь по показателям двух и более аллелей определенного локуса (в данном случае IL28B); первый столбец - показатели LD в группе СА); второй столбец - группа ВЕ; третий столбец - объединенная группа СА и ВЕ. Диаграмма построена с использованием компьютерной программы HaploView, которая имеется в наличии по проекту HapMap. Целью наших исследований было определение распространенности и клинического значения генотипов SNP, локализующихся в области генов IFNL3/IL28B- и IFNL4-аллелей среди ВГС-инфицированных в Узбекистане. Кроме того, мы провели оценку значимости тестированных SNP в прогнозе ответа на противовирусную терапию среди обследованных. Было установлено, что SNP rs8099917 и rs12979860 являются информативными маркерами при лечении ВГС - инфицированных пациентов противовирусными препаратами интерферонового ряда в различных этнических группах в Узбекистане. Исследования показали, что наиболее информативным является аллель rs8099917 генотип TT (67,8%), затем аллель rs12979860 генотип CC (49%). Доказательства связи между недавно описанным IFNL4/ss469415590 [11] и SNP IL28B/IFNL3 rs12979860 среди ВГС- инфицированных в Узбекистане публикуется впервые. Согласно данным по проекту HapMap (Human Haplotype Mapping Project), процент носителей минорной аллели G rs8099917 среди европеоидов (кавказоидов) составлял в среднем 15-19%. Следует отметить, что наши исследования показали количество носителей генотипа GG rs8099917 среди обследованных ВГС-инфицированных пациентов 3,6%, что значительно ниже, чем в других странах [7-10]. Это, собственно, может служить доказательством вариабельности встречаемых генотипов (2-31%) между различными этническими группами [25]. В группе пациентов СА более точным прогностическим маркеров оказался SNP rs80999l7 генотип TT, чемIFNL4/ss469415590 и IFNL3/rs12979860 (см. табл. 3), в то время как в группе ВЕ наблюдалась обратная тенденция. Эти данные подтверждают ранее опубликованные результаты исследований в группах западноевропейцев [7, 10]. Тем не менее для подтверждения выявленной тенденции в настоящих исследованиях необходимо провести дополнительные исследования в группе ВЕ. Согласно некоторым результатам исследований, полиморфизм, комбинированный из нескольких благоприятных р=0,08 р=0,002 1 Г 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 т СА ВЕ rs8099917 a Minor allele т СА BE I rs12979860 Ц A Major allele Рис. 2. Распределение аллелей SNP в тестированных группах по этническим группам (n = 135). По оси абсцисс: СА и ВЕ - группы обследованных по этнической принадлежности (среднеазиаты и восточноевропейцы). По оси ординат - распределение аллелей, %. А - Мажорные аллели (наиболее часто встречающиеся в популяциях, немутированные аллели); а - минорные аллели (редко встречающиеся в популяции мутированные аллели с однонуклеотидными заменами). (мажорных) аллелей SNP, может иметь более высокую прогностическую ценность в предсказании устойчивого вирусного ответа на терапию среди ВГС/1Ь-инфицированных [26]. Однако в наших исследованиях такого повышения прогностической ценности обнаружено не было. Были выявлены различия в генетической сцепленности аллелей SNP rs12979860 и двух других SNP, находящихся в гене IL28B и кодирующих белки IFNL3 и IFNL4 в двух исследованных популяциях. Более высокая сцепленность генов наблюдалась в группе ВЕ. Хотя это может быть обусловлено малым числом обследованных, что говорит о необходимости проведения дальнейших исследований в расширенной когорте. Отметим факт, что в данной популяции сцепленность генов по SNP rs8099917 была значительно ниже ранее опубликованных результатов, описанных в популяции японцев [9]. Тем не менее оба маркера SNP, rs8099917 и rs12979860, независимо друг от друга могут быть использованы для прогноза ответа на противовирусное лечение ВГС. Т аблица 3 SNP, показавшие наиболее значимую ценность в прогнозе ответа на противовирусное лечение Этническое проss469415590 TT rs8099917 TT rs12979860 CC исхождение OR (95% CI) OR (95% CI) OR (95% CI ) Средне-азиаты 5,364 (1,7-16,8)* 6,858 (2,6-18,0)* 5,364 (1,7-16,8)* Восточноевропейцы 4,167 (0,4-48,4) 2,667 (0,3-21,3) 4,167 (0,4-48,4) Всего... Примечание. * 5,2 (1,9-14,6)* p < 0,05. 5,745 (2,4-13,6)* 5,2 (1,9-14,6)* Прогностическая способность SNP, в частности вариации IFNL4 ss469415590, колебалась в пределах показателей, выявленных среди Европейцев с гепатитом С генотипа 1b [14, 15]. Но учитывая факт того, что прогностическая значимость генетических маркеров имеет довольно широкий разброс даже внутри такой генетически высокогомологичной группы, как японцы (OR 4,7-19,5) [19, 20], преобретает особую важность и необходимость исследований полиморфизма гена IL28 в разных этнических группах и внутри каждой популяции. Заключение В результате проведенных исследований нами установлено, что генотипирование полиморфизма в локусе IL28B может служить прогностическим маркером для предсказания ответа на противовирусную терапию Peg-IFN+RBV среди популяций Центральной Азии. В связи с тем что в последнее время широкое распространение преобретает дорогостоящая терапия с применением ингибиторов протеаз, данный метод выявления прогностических маркеров может помочь в выборе тактики ведения пациентов. Таким образом, генотипиро- вание полиморфизмов rs8099917/rs12979860 является эффективным при выборе противовирусной терапии до её начала и может служить маркером при выборе индивидуальной терапии при вирусном гепатите С. Благодарность Выражаем глубокую признательность Национальному центру глобальной медицины и здоровья (Токио, Япония) за методическую помощь и реагенты, предоставленные для проведения данных исследований.

About the authors

D. E Sekler

Scientific Research Institute of Virology

Email: dildora@gmail.com
7, Yangi Shahar street, Yunusabad community, Yunusabad district, Tashkent, Uzbekistan, 100133

D. M Khudayberganova

Scientific Research Institute of Virology

Email: mail2dinara@gmail.com
7, Yangi Shahar street, Yunusabad community, Yunusabad district, Tashkent, Uzbekistan, 100133

R. R Latypov

Scientific Research Institute of Virology

Email: renatlatip@gmail.com
7, Yangi Shahar street, Yunusabad community, Yunusabad district, Tashkent, Uzbekistan, 100133

G. Z Usmanova

Scientific Research Institute of Virology

7, Yangi Shahar street, Yunusabad community, Yunusabad district, Tashkent, Uzbekistan, 100133

M. I Rakhmanov

Scientific Research Institute of Virology

7, Yangi Shahar street, Yunusabad community, Yunusabad district, Tashkent, Uzbekistan, 100133

E. I Musabaev

Scientific Research Institute of Virology

Email: drmusabaev@rambler.ru
7, Yangi Shahar street, Yunusabad community, Yunusabad district, Tashkent, Uzbekistan, 100133

References

Supplementary files