Characteristics of antibiotic resistant strains of Vibrio cholerae carrying SXT type integrative conjugative elements

Full Text

В течение довольно длительного времени возбудитель холеры оставался чувствительным к широкому ряду антимикробных соединений. Но уже начиная с 1990-х годов наблюдается массовое выделение штаммов Vibrio cholerae различных серо-групп с фенотипом множественной устойчивости к антибиотикам. В настоящее время большинство выделяемых на эндемичных территориях штаммов возбудителя устойчивы к 3-8 антимикробным соединениям, включая фторхинолоны [1, 2]. Одним из путей формирования множественной устойчивости к антибиотикам у V. cholerae является аккумуляция индивидуальных генов антибиоти-корезистентности в составе специализированных генетических структур - интегронов хромосомной и плазмидной локализации и трансмиссивных SXT-элементах [3-6]. SXT-элементы, или ICEs (Integrative Conjugative Elements), - крупные (60-100 тыс. п. н.) транс-позоноподобные структуры, интегрированные в определенные хромосомные локусы возбудителя холеры, способные к конъюгативному переносу, но не к автономной репликации. Наряду с генами транспозаз и генами Tra+-фенотипа в составе различных типов ICEs обнаружены гены резистентности к триметоприму (dfr), стрептомицину (strA, strB), сульфаметоксазолу (sul2) и хлорамфениколу (floR). Первоначально SXT-элементы были обнаружены в штаммах V. cholerae O139, выделенных во время эпидемии в Индостане в 1990-х годах [5], впоследствии - в изолятах V. cholerae O1 eltor из Индии, Юго-Восточной Азии, Северной и Восточной Африки, Центральной и Южной Америки. Были установлены различия в структуре SXT и характере локализации в нем генов резистентности в штаммах O139- и d-серогрупп [7]. Отметим, что штаммы V. cholerae O1 eltor, вызвавшие эпидемическую вспышку на Гаити, также содержат в составе генома SXT-элементы [8]. Для корреспонденции: Подшивалова Мария Васильевна, науч. сотр. лаб. функциональной геномики ФКУЗ "Волгоградской научно-исследовательский противочумный институт" Роспотреб-надзора Как уже было отмечено, в штаммах V. cholerae 0139- и О1-серогрупп наблюдаются различия в структуре SXT и характере локализации в нем генов резистентности [7]. Элемент SXTMO10 штаммов V. cholerae О139 серогруппы несет гены устойчивости к хлорамфениколу (floR), сульфаметоксазолу (sulII), стрептомицину (strA, strB) и триметоприму (dfr 18) [5]. В штаммах V. cholerae O1 eltor выявлен элемент SXTET типа, у которого отсутствует ген dfr 18 и присутствует ген резистентности к триметоприму dfrA1, расположенный вне основного кластера генов антибиотикоустойчивости [5, 9]. Также были описаны варианты SXTMO10 c утраченными последовательностями sulII и dfr 18, а также варианты SXTMO10 и SXTET с полностью делетированным кластером генов антибиотикорезистентности [8], что свидетельствует о высокой частоте рекомбинационных событий в пределах данной генетической структуры. Приведенные сведения иллюстрируют важную роль SXT-элементов V. cholerae в приобретении и распространении детерминант лекарственной устойчивости. Очевидно, что разработка схем молекулярной детекции и анализа генов резистентности в составе SXT актуальна как в плане изучения генетических основ лекарственной устойчивости V. cholerae, так и в целях совершенствования алгоритмов генотипирования и эпидемиологического маркирования изолятов V. cholerae. Целью данной работы являлась фенотипическая и молекулярно-генетическая характеристика штаммов V. cholerae различных серогрупп, выделенных на территории Волгоградской области и несущих фенотипические маркеры устойчивости SXT-элементов. Материалы и методы Изучение культурально-морфологических свойств проводили на плотных и жидких питательных средах - щелочном мясопептонном агаре и бульоне рН 8,0 ± 0,2, оценивая морфологию изолированных колоний, характер роста в жидкой среде и особенности морфологии клеток через 24 ч культивирования при 35 ЭПИДЕМИОЛОГИЯ И ИНФЕКЦИОННЫЕ БОЛЕЗНИ, № 3, 2014 37°С. Ключевые дифференциально-диагностические признаки культур исследовали согласно регламентированной схеме МУК 4.2.2218-07 [10]. Постановку дополнительных тестов по определению биохимической активности проводили на автоматическом микробиологическом анализаторе MicroTax (SY-lab, Австрия) с использованием идентификационных наборов Micronault IDS (SY-lab, Австрия). Устойчивость штаммов к антибиотикам определяли дискодиффузионным методом на агаре Мюллера-Хинтона согласно МУК 4.2.1890-04 [10], используя наборы дисков производства НИИЭМ. Детекцию и идентификацию патогенных штаммов возбудителя холеры проводили с использованием набора реагентов «АмплиСенс® Vibrio cholerae-FL»-FRT (ЦНИИ эпидемиологии) согласно инструкции производителя. Для выделения ДНК готовили суспензии клеток 24-часовой агаровой культуры тестируемых штаммов в стерильном 0,15 М NaCl плотностью 1 • 105 м.к/мл. Для обеззараживания суспензий клеток использовали мертиолят натрия в разведении 1:10 000 (0,01%) с последующим прогреванием суспензий при 56 ± 1°С в течение 30 мин. Выделение ДНК проводили с использованием комплекта реагентов «ДНК-сорб-В» (ЦНИИ эпидемиологии) согласно инструкции производителя. Постановку реакций проводили на амплифика-торе RotorGene 6000 (Corbett, Австралия) в формате «мультипрайм» с использованием «горячего старта»: вариант «Скрин» - амплификация мишеней ctxA (FAM/Green), tcpA (ROX/Orange) и ВКО (JOE/ Yellow/HEX), вариант «Тип» - амплификация мишеней hly (JOE/Yellow/HEX) - холерные вибрионы всех серогрупп, wbeT (FAM/Green) - принадлежность к серогруппе О1, wbf (ROX/Orange) - принадлежность к серогруппе 0139. Общий объем реакции - 25 мкл, объем ДНК-пробы - 10 мкл. Для идентификации и ПЦР-типирования SXT-элемента использовали набор праймеров, предло Антибиотикограммы исследуемых штаммов V cholerae Антибиотик МПК препаратов, мкг/мл V cholerae B161 V. cholerae B191 V cholerae В196 V cholerae В152 Ампициллин 16 < 8 32 4 Амоксициллин 16 4 16 4 Амоксициллин/клавуланат 16 4 4 2-4 Имипенем < 4 < 4 < 4 < 4 Цефтазидим 2 2-4 2-4 2 Левомицетин < 4 16 < 4 < 4 Гентамицин < 4 < 4 8 < 4 Амикацин 4 8 8 4 Ципрофлоксацин < 1 < 1 < 1 < 1 Офлоксацин < 2 < 2 < 2 < 2 Триметоприм/сульфаметоксазол 8 > 64 > 64 8 Доксициклин < 4 < 4 < 4 < 4 женный Ramachandran и соавт. [11] и включающий олигонуклеотиды, специфичные гену интегразы intSXT, гену устойчивости к сульфаметоксазолу sulII, гену устойчивости к стрептомицину strB и детерминантам устойчивости к триметоприму - генам дигидрофолатредуктаз dfr 18 и dfrA1, характерным для SXTMO10 (штаммы 0139-серогруппы) и SxTet (штаммы 01-серогруппы), соответственно. Амплификацию мишеней проводили в моно-локусном и мультилокусном форматах на амплифи-каторе C1000 (Bio-Rad) при параметрах: плавление 94°C 2 мин, 35 циклов 94°C - 1 мин, 60,5°C - 1 мин, 72°C - 1 мин, финальная элонгация 72°C - 10 мин. В мультилокусном варианте ПЦР оптимальная концентрация праймеров составила 10 мкМ для sulII, dfr18, strB; 20 мкМ для dfrA1 и 12 мкМ для int SXT" Результаты и обсуждение В ходе исследования были проанализированы 66 штаммов V. cholerae O1 Eltor и О139, выделенные на территории Волгоградской области из объектов внешней среды (вода поверхностных водоемов) в период 1970-2000 гг. Для детального исследования нами были отобраны 2 штамма 01 (В 161, В196) и 1 штамм 0139 (В191) серогрупп, имеющие повышенный уровень устойчивости к антибиотикам различных классов, включая фенотипические маркеры резистентности, характерные для SXT-элементов (аминогликозиды I поколения, триметоприм/суль-фаметоксазол). Результаты определения антибиоти-кограмм тестируемых штаммов приведены в табл. 1. В качестве элемента сравнения в таблице 1 и далее показан атоксигенный штамм V. cholerae O1 Eltor В152, выделенный из проб воды р. Волги в 1978 г. и не отнесенный по результатам анализа к группе изолятов с фенотипом множественной антибиотико-ре зистентно сти. В щелочном мясопептонном бульоне культуры штаммов Vibrio cholerae B161, V. cholerae В196, V. cholerae В191 вызывали равномерное помутнение среды с образованием на поверхности рыхлой беловатой пленки и легкого осадка на дне пробирки. На поверхности щелочного агара рост тестируемых культур холерных вибрионов проявляется в формировании крупных (2-3 мм) гладких прозрачных колоний с ровным краем, легко эмульгируемых в 0,15 М NaCl. В мазках по Граму клетки тестируемых культур штаммов представляют собой грамотрица- Т аблица 1 36 Таблица 2 Характеристика исследуемых штаммов по ключевым диагностическим признакам Штамм Оксидаза Индо фенол оксидаза Дезокси-холат Na Глюкоза окисле ние Глюкоза фермен тация Лизин декарбоксилаза Аргинин дигидролаза Орнитин декарбоксилаза Манноза Сахароза Арабиноза V. cholerae B161 + + + + + + + + + + - V cholerae В191 + + + + + + - + + + - V cholerae В196 + + + + + + + + - + - V cholerae B152 + + + + + + + + + + тельные, не содержащие спор, полиморфные слегка изогнутые палочки. Тест на подвижность методом «висячей капли» был положительным для всех изученных штаммов. Пробы с диагностическими фагами и реакция агглютинации с холерными диагностическими сыворотками подтвердили принадлежность штаммов V. cholerae B161 и V cholerae В196 к О1-серогруппе биовару эльтор, а штамма V. cholerae В191 - к О139-серогруппе возбудителя. Результаты тестирования ключевых биохимических признаков 18-часовых агаровых культур штаммов приведены в табл. 2. Результаты оценки биохимической активности тестируемых штаммов в отношении 23 субстратов на идентификационных планшетах Micronault IDS с использованием 24-часовых культур микроорганизмов, выращенных на щелочном агаре, приведены в табл. 3. Проведенный анализ, таким образом, продемонстрировал, что исследуемые штаммы холерного вибриона обладают типичными родовыми и видовыми признаками биохимической активности. Идентификационные профили тестируемых изолятов, сформированные по результатам исследования активности в отношении расширенного набора биохимических субстратов (табл. 3) также соответствуют стандартным идентификационным биохимическим профилям штаммов V. cholerae. Результаты проведенного генотипирования тестируемых штаммов суммированы в табл. 4. Из полученных результатов видно, что штамм О139 серо-группы V. cholerae B191 является эпидемически значимым, обладающим важнейшими детерминантами вирулентности - генами токсинообразования (ctxA) и токсинкорегулируемых пилей адгезии (tcpA). Время выделения данного штамма (1993) соответствует периоду распространения эпидемически значимых вариантов V cholerae O139 c территорий эндемичных по холере регионов мира. ПЦР-детекция видоспецифических (hly) и серогруппоспецифических (wbeT и wbf) мишеней подтвердила принадлежность V. cholerae B191 к О139-серогруппе, а V. cholerae В152, B161 и В196 - к О1-серогруппе холерных вибрионов. Типирование исследуемых штаммов в мультило-кусной ПЦР с праймерами, специфичными последовательностям SXT-элементов (см. рисунок) про демонстрировало, что V. cholerae В-191 содержит типичный SXTMO10 с кластером генов антибиотико-устойчивости sulII-strB-dfr 18, идентичный SXT-элементу коллекционного штамма V. cholerae O139 Bengal, взятого для сравнения. В штамме V. cholerae В-196 детектирован вариант элемента SXT^-rarn, несущий последовательности sulII и dfrA1 и не имеющий гена устойчивости к аминогликозидам I поколения (strB). SXT-элемент штамма V cholerae В-161 Таблица 3 Профили биохимической активности штаммов V cholerae Тест Номер штамма, результат теста B161 В191 В196 В152 Образование индола + + + + Гидролиз эскулина - - - - Уреаза - - - - Лизиндекарбоксилаза + + + + Орнитиндекарбоксилаза + + + + Аргининдигидролаза + - - + Ферментация глюкозы + + + + Ферментация сахарозы + + + + Ассимиляция глюкозы + + + + Ассимиляция маннозы + + - + Ассимиляция мальтозы + - + + Ассимиляция n-ацетилглюкозамина + - + + Ассимиляция маннитола + - + + Ассимиляция глюконата + - + + Ассимиляция у-гидроксибутирата - - - - Ассимиляция лактата + - + + Ассимиляция адипата - - - - Ассимиляция суберата - - - - Ассимиляция малата + + + + Ассимиляция фенилацетата - - - - Ассимиляция гистидина + + - + Ортонитрофенил-р-галактозидаза + + - + Фосфолипаза С + + + + Фосфодиэстераза + + + + Пролинамидаза + - + + а-Мальтозидаза - - - - Хитиназа + + + + Кислая фосфатаза - - - - Оксидаза + + + + 37 ЭПИДЕМИОЛОГИЯ И ИНФЕКЦИОННЫЕ БОЛЕЗНИ, № 3, 2014 Т аблица 4 Результаты генотипирования штаммов V cholerae V cholerae B161 V cholerae B191 V cholerae В196 V cholerae В152 Cерогруппа 01 0139 01 01 Генотип + ly h ctxA+ + ly h hl y + wbeT+ tcpA+ wbeT+ wbeT+ wbf+ был полностью лишен кластера генов устойчивости к антибиотикам. Сопоставление выявленных генетических профилей SXT-элементов с профилями чувствительности к антибиотикам различных классов (см. табл. 1) демонстрирует наличие ожидаемых фенотипов резистентности у SX^-штаммов. Заключение Первые упоминания о различных типах SXT относятся к началу 90-х годов прошлого века, когда в клинических изолятах V. cholerae 0139 из Индии был обнаружен элемент SXT^^-rarn, а в штаммах V. cholerae 01 эльтор из Бангладеш, Индии и Мозамбика выявлен SXTE1-элемент, который является близкородственным, но не идентичным SXTM010 [8]. В настоящее время большинство, если не все, азиатские штаммы V. cholerae содержат данные элементы [6, 7], примером могут служить и токсигенные штаммы V. cholerae 01 эльтор Огава, вызвавшие эпидемию 2010-2011 гг. на территории Гаити и содержащие в составе генома элемент SXTET типа [12]. Все известные ICEs содержат вариабельную ДНК, придающую элементу специфические свойства. Вариабельные регионы ICEs составляют от 30 до 60 тыс. п. н. [13], и кластеры генов антибиотико-резистентности входят в состав этих вариабельных регионов [14]. Частота рекомбинационных событий в пределах вариабельных регионов ICEs довольно высока; именно за счет данного обстоятельства возникают варианты SXT-элементов, распространенные в изолятах возбудителя из того или иного географического региона и несущие различные наборы генов устойчивости к антибиотикам. Наличие SXT-элемента определенного типа в геноме штамма возбудителя может, таким образом, указывать на вероятный источник его происхождения и ожидаемый спектр антибиотикорезистентности. Ранее мультилокусный ПЦР-анализ кластера генов антибиотикорезистентности ICE, основанный на детекции фрагментов гена интегразы intSXT, гена устойчивости к сульфаметоксазолу sul2, гена устойчивости к стрептомицину strB и детерминант устойчивости к триметоприму dfr 18 и dfrA1, характерных для вариантов элементов SXTM010 (штаммы 0139) и SXTET (штаммы 01 eltor) соответственно, был использован для генетической паспортизации штаммов холерного вибриона, циркулирующих в эндемичных по холере регионах Азии [12]. В настоящей работе сходный методологический подход был ис- -<-intsxT 1035 bp ■<-sulII 620 bp -<- strB 515 bp dfrlH 390 bp -<-dfr Л1 280 bp Результаты генотипирования SXT-элемента в антибиотикорезистентных штаммах V. cholerae. Расположение на треках, слева направо: V. cholerae Bengal SXTM010, V. cholerae В191 SXTM010, V cholerae В196 SXTET, V cholerae B161 SXTS. пользован нами для ретроспективной углубленной генетической характеристики региональных изоля-тов V. cholerae с фенотипом множественной устойчивости к антибиотикам. В результате проведенных исследований, таким образом, нами были впервые идентифицированны штаммы V. cholerae 01- и 0139-серогрупп, выделенные на территории Российской Федерации и несущие ICEs с различным набором генов антибиотикорезистентности. 0бнаружение последовательностей интегративных элементов семейства SXT/R391 и выявленные различия их структуры и вариабельности состава кластера генов антибиотикорезистентности в исследованных нами штаммах V. cholerae, несущих фенотипические маркеры устойчивости к амино-гликозидам и триметоприму/сульфаметоксазолу, подтверждают важную роль данных генетических элементов в формировании множественной устойчивости возбудителя холеры к антимикробным соединениям. Семейство SXT/R391 является самым представительным по числу относящихся к нему ICEs; эти генетические элементы описаны в штаммах Vibrio cholerae различных серогрупп, у 5 видов рода Vibrio, а также других родов Vibrionaceae. Сравнительный анализ геномов SXT/R391 ICEs демонстрирует, что данные элементы в большинстве являются мозаичными, сформировавшимися, по-видимому, в результате рекомбинации между различными «исходными» ICEs. Формирование рекомбинантных ICEs может дать новые мобильные элементы, несущие новые комбинации генов, в том числе детерминант устойчивости к антибиотикам, Bengal В191 В196 В161 38 расширяющие адаптивный потенциал бактериальных видов. Охарактеризованные нами штаммы V. cholerae О1- и О139-серогрупп были депонированы в Го -сударственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур ФБУН ГНЦ ПМБ Роспотребнадзора (Оболенск) как референтные для различных типов ICEs и предназначенные для дальнейшего изучения молекулярно-генетических механизмов устойчивости к антибиотикам возбудителя холеры и генетической паспортизации антибиотикорезистентных штаммов V. cholerae на основе генетических маркеров, связанных с интегронами, конъюгативными плазмидами и трансмиссивными интегративными элементами.

About the authors

M. V Podshivalova

Volgograd Anti-Plague Research Institute

Yu. A Kuzyutina

Volgograd Anti-Plague Research Institute

I. B Zakharova

Volgograd Anti-Plague Research Institute

Ya. A Lopasteyskaya

Volgograd Anti-Plague Research Institute

D. V Viktorov

Volgograd Anti-Plague Research Institute

References

Supplementary files