Clinical and microbiological comparisons in whooping cough in children under modern conditions

Full Text

Коклюш не теряет свою значимость в детской инфекционной патологии. Многолетние наблюдения за больными коклюшем показали, что особенности течения этой инфекции определяются рядом факторов, среди которых большое значение имеют биологические свойства коклюшного микроба [1-3]. При исследовании штаммов B. pertussis с 1990-х годов в Европе и Америке было выявлено, что в последовавший за введением вакцинации период произошли изменения в генетической структуре возбудителя, а именно в структуре генов, кодирующих основные факторы патогенности. В ряде стран появление штаммов B. pertussis с измененной генетической структурой совпало с подъемом заболеваемости [9-14]. Молекулярно-генетический мониторинг возбудителя коклюша, проводимый в последние годы в различных странах, а также в нашей стране, показал, что штаммы B.pertussis подвержены генетической вариабельности [4-8]. Возникли предположения, что одной из причин поддержания эпидемического процесса при коклюше может являться изменчивость возбудителя, лежащая в основе его адаптации к меняющимся условиям циркуляции. Вместе с тем, до настоящего времени отсутствуют исследования, посвященные анализу клинических особенностей течения коклюшной инфекции в зависимости от генотипических свойств B. pertussis. В связи с этим целью нашей работы явилось изучение влияния генотипических свойств штаммов B.pertussis на клинические проявления коклюша в современных условиях. Материалы и методы Изучение зависимости тяжести клинического течения коклюшной инфекции от серотипов выделенных штаммов B. pertussis проведено в группе непривитых детей в возрасте до 6 мес в сравнительном аспекте: у 170 больных, находившихся на стационарном лечении в 1990-е годы, и у 123 больных - в 2000-е годы. Анализ взаимосвязи генотипических свойств коклюшного микроба и клинических проявлений коклюша основывается на наблюдениях за 83 больными коклюшем, госпитализированными в 2009-2012 гг. в ИКБ N° 1 Москвы. Возрастная структура пациентов была представлена следующим образом: детей в возрасте до 1 года было 64 (77,1 ± 4,6%), 1-3 лет - 14 (16,9 ± 4,1%), 4-6 лет - 2 (2,4 ± 1,7%), 7-14 лет - 3 (3,6 ± 2,0%). Следует отметить, что среди детей в возрасте до 1 года преобладали больные 1-го полугодия жизни, составившие 75,6 ± 4,7% (48 детей). По тяжести течения коклюшной инфекции больные были распределены следующим образом: 31 (37,3 ± 5,3%) ребенок переносил тяжелую форму, 47 (56,6 ± 5,4%) - среднетяжелую и 5 (6,0 ± 2,6%) - легкую. При анализе прививочного анамнеза установлено, что значительная часть детей (74 ребенка - 88,7 ± 4,3%) была не привита против коклюша, 3 (3,6 ± 2,0%) ребенка были привиты неполностью и лишь 6 (7,2 ± 2,8%) детей привиты согласно Национальному календарю прививок. Изучение фенотипических и генотипических свойств штаммов B. pertussis проводилось в лаборатории диагностики дифтерийной и коклюшной инфекций ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора (руководитель лаборатории - доктор мед. наук О.Ю. Борисова). Генотипические свойства штаммов B.pertussis, выделенных от больных коклюшем, были изучены с помощью двух схем мультилокусного секвенирования ДНК (Multilocus antigen sequence typing) - MAST1 и MAST2. Обе схемы генотипирования основаны на секвенировании фрагментов генов, кодирующих основные факторы патогенности возбудителя коклюша, с последующей идентификацией, согласно международным базам данных генотипов EMBL/ GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez) и Pub- MLST (http://www.mlst.net/), аллельному профилю и секвенс-типу, определяющему генотип каждого штамма. MAST1-генотип идентифицировали путем изучения аллельных комбинаций фрагментов трех геновprn-ptxP-tcfA: генаprn, кодирующего основной адгезин возбудителя коклюша - белок пертактин; промоторной ptxP-области коклюшного токсина, влияющей на интенсивность и количество продукции основного фактора патогенности возбудителя - коклюшного токсина; гена tcfA, кодирующего уникальный фактор патогенности возбудителя - фактор колонизации трахеи. MAST2-генотип идентифицировали путем изучения аллельных комбинаций также фрагментов трех генов ptxP-fim3-prn: промоторной ptxP-области коклюшного токсина; гена fim3, кодирующего фимбриальный Fim3-белок, и гена prn, кодирующего белок пертактин. Включение данных генетических детерминант обусловлено тем, что каждая из последователей представлена двумя и более аллельными вариантами, т. е. обладает достаточной степенью полиморфизма. Применение двух модификаций MAST обусловлено тем, что используемые ранее схемы генотипирования не обладали достаточной степенью информативности и не позволяли оценить генетическую вариабельность циркулирующей популяции штаммов B. pertussis. Кроме того, многочисленные исследования, проведенные в различных странах мира [10-14], показали растущую в последние годы функциональную значимость таких детерминант патогенности, как про- моторная ptxP-область коклюшного токсина, изменения в которой влияют на экспрессию оперона ptx и продукцию коклюшного токсина, а также детерминант адгезии и колонизации - пертактине, в гене prn которого выявлены наиболее значимые мутационные изменения не только в количестве мутаций, но и в их функциональной значимости, и фимбри- ального А™3-белка, отвечающего за прикрепление возбудителя и запуск инфекционного процесса. Результаты и обсуждение Анализ влияния биологических свойств возбудителя на течение коклюша в нашей клинике проводится начиная с 1990-х годов. Исследования были посвящены изучению влияния серотипового пейзажа циркулирующих штаммов коклюшного микроба на клинические проявления коклюша. Клинические наблюдения показали, что как в 1990-е, так и в 2000-е годы у больных преимущественно выделяли штаммы B. pertussis серотипа 1.0.3 - у 118 (69,4 ± 3,5%) и у 95 (77,2 ± 3,8%) больных соответственно. Результаты клинико-микробиологических сопостав- Клинические формы коклюша и серотипы штаммов B. pertussis Серотип штаммов Форма коклюша Годы исследования n тяжелая среднетяжелая легкая B. pertussis абс. % (M ± m) абс. % (M ± m) абс. % (M ± m) 1990-е 1.0.3 118 22 18,6 ± 3,6 82 69,5 ± 4,2 14 11,9 ± 2,9 1.2.3 1.2.0 52 22 42,3 ± 6,8 24 46,1 ± 6,9 6 11,5 ± 4,4 Итого... 170 44 25,9 ± 3,3 106 62,4 ± 4,7 20 11,7 ± 2,4 2000-е 1.0.3 95 41 43,2 ± 5,0* 48 50,5 ± 5,1 6 6,3 ± 2,5 1.2.3 1.2.0 28 10 35,7 ± 9,0 16 57,1 ± 9,3 2 7,1 ± 4,8 Итого... 123 51 41,5 ± 4,4 64 52,0 ± 4,5 8 6,5 ± 2,2 Примечание. * - статисически значимые различия (p < 0,001). Таблица 2 Характеристика генотипов штаммов B. pertussis, выделенных у больных коклюшем в 2009-2012 гг. Модификации секвенирования Генотип 2009 г. 2010 г. 2011 г. 2012 г. абс. % абс. % абс. % абс. % MAST 1 232 12 63,2 ± 11,1 10 90,9±8,7 9 39,1 ± 10,2 11 36,7 ± 8,8* 332 5 26,3 ± 10,1 - - - - 932 2 10,5 ± 7,1 1 9,1 ± 8,7** 14 60,8 ± 10,2** 19 63,3 ± 8,8*** MAST 2 312 - - 7 63,6 ± 14,5 5 21,7 ± 8,6 5 16,7 ± 6,8 319 4 21,1 ± 9,4 - - 4 17,4 ± 7,9 10 33,3 ± 8,6 322 9 47,4 ± 11,5 - - - - 5 16,7 ± 6,8 323 2 10,5 ± 7,0 - - - - - - 329 4 21,1 ± 9,4 4 36,4 ± 14,5 14 60,9 ± 10,2 10 33,3 ± 8,6 Примечание. Звездочки - статистически значимые различия: * - р < 0,05, - р < 0,01, - р < 0,001. лений, полученные в 1990-е годы, совпали с мнением других исследователей и свидетельствовали о том, что заболевания, вызванные так называемыми допрививочными штаммами B. pertussis серотипов 1.2.3 и 1.2.0, протекают тяжелее, чем заболевания с выделением штаммов серотипов 1.0.3 и 1.0.0. Так, в группе детей, переносивших коклюш, вызванный штаммами B. pertussis серотипа 1.2.3, у 42,3±6,8% больных заболевание протекало в тяжелой форме, у 46,1 ± 6,9% - в среднетяжелой и у 11,5 ± 4,4% - в легкой. В то же время больные, у которых заболевание было вызвано штаммами B. pertussis серотипа 1.0.3, переносили инфекцию в тяжелой форме в 18,6 ± 3,6% случаев, в среднетяжелой - в 69,5 ± 4,2% и легкой - в 11,9 ± 2,9% случаев (табл. 1). В 2000-е годы было продолжено изучение взаимосвязи серотиповой принадлежности выделенных культур возбудителя на тяжесть клинического течения коклюша. Установлено, что среди пациентов, у которых идентифицированы штаммы B. pertussis серотипа 1.0.3, значительно увеличился удельный вес детей с тяжелыми формами болезни по сравнению с 1990-ми годами, достигая 43,2 ± 5,0% против 18,6 ± 3,6% (p < 0,001). Среднетяжелые формы болезни в этой группе детей переносили 50,5 ± 5,1% и легкие - 6,3 ± 2,5% больных. Сравнительный анализ соотношения клинических форм у детей, коклюш у которых был вызван B. pertussis серотипами 1.2.3 и 1.2.0, достоверной статистической разницы по сравнению с 1990-ми годами не выявил. В связи с тем что в последние годы появилось много данных, расширивших представление о возбудителе коклюшной инфекции и причинах, объясняющих усиление вирулентных свойств B. pertussis, нами были продолжены исследования. А также учитывая, что в последние годы большое внимание уделяется изменениям генотипических свойств B. pertussis, было проведено изучение влияния генотипических свойств возбудителя на особенности клинического течения коклюша. При генотипировании штаммов B. pertussis, выделенных у больных, находившихся в стационаре в период 2009-2012 гг., выявлено, что если в 20092010 гг. у значительного числа больных выделяли штаммы B. pertussis генотипа 232 MAST1 (у 63,2 ± 11,1 - 90,9±8,7% больных), то в 2011-2012 гг. превалирующим генотипом в отличие от предыдущих лет становится генотип 932 MAST1 (у 60,8 ± 10,2 Тяжелая форма MAST2 Среднетяжелая форма Рис. 1. Зависимость клинических форм коклюша от генотипов штаммов B. pertussis. * - статистически значимые различия при р < 0,05. - 63,3 ± 8,8% больных) (табл. 2). Сравнительный анализ генотипов MAST2 показал, что в 2009-2010 гг. преобладающим был генотип 322 MAST2 (у 45,0 ± 11,1 - 47,4 ± 11,5% детей). В 2011 г. у значительного числа больных (60,9 ± 10,2%) был идентифицирован генотип 329 MAST2, а в 2012 г. с одинаковой частотой были выделены генотипы 329 и 319 MAST2 (у 33,3 ± 8,6% больных), реже - другие генотипы. С целью исключения влияния прежде всего возрастного фактора и вакцинального анамнеза предварительный анализ проведен у детей в возрасте до 3 мес. В результате исследований установлено, что коклюш, вызванный штаммами B. pertussis генотипа 932 MAST1, протекал значительно чаще в тяжелой форме - у 87,5 ± 11,7% против 12,5 ± 11,7% средне- 100 & jst 100 75 75 63,6 И 62,5 36,4 /VJ J* Ж <» «гг & & 232 332 932 Рис. 2. Частота основных клинических проявлений у детей с тяжелой формой коклюша в зависимости от генотипических свойств штаммов B. pertussis (MAST1). * - статистически значимые различия при р < 0,05. тяжелых форм (p < 0,001) (рис. 1). Достаточно высоким был удельный вес тяжелых форм и при коклюше, когда были идентифицированы штаммы B. pertussis генотипа 232 MAST1, составившие 58,3 ± 14,2% против 41,7 ± 14,2% среднетяжелых форм. В группе детей, у которых идентифицированы штаммы B. pertussis генотипа 319 MAST2, оказалось, что у всех детей при коклюше, вызванном этим генотипом, заболевание протекало в тяжелой форме. Последний единичный случай летального исхода у 2-месячного ребенка в 2012 г. был связан именно с этим генотипом, заболевание протекало с тяжелой энцефалопатией, выраженным геморрагическим синдромом, гиперлейкоцитозом до 90 • 109 г/л. Обращало на себя внимание, что штаммы B.pertussis генотипа 329 MAST2 вызывали также чаще тяжелые формы коклюша - у 75 ± 21,7% больных. В то же время среди детей, у которых идентифицированы штаммы B. pertussis генотипа 312 MAST2, преобладали среднетяжелые формы заболевания, составившие 60,0 ± 21,9%. Большой интерес представлял характер различных клинических проявлений коклюша в зависимости от генотипических свойств коклюшного микроба. С этой целью нами проведен сравнительный анализ симптомокомплекса коклюша также с использованием двух модификаций мультилокус- ного секвенирования ДНК - MAST1 и MAST2. В результате клинического анализа симптоматики продромального периода достоверных различий не выявлено. Для тяжелых форм коклюша было характерно укорочение этого периода до 3-4 дней, при среднетяжелых формах этот период удлинялся до 5-7 дней. Тщательный анализ симптоматики периода спазматического кашля проведен в двух группах детей: с тяжелой и среднетяжелой формой коклюша. Из данных, представленных на рис. 2, видно, при коклюше, вызванном штаммами B.pertussis генотипа 932 МАSТ1. были наиболее выражены симптомы, определяющие тяжесть клинического течения коклюшной инфекции. У 75,0 ± 15,3% детей частота приступов превышала 25 раз в сутки. У всех детей приступы сопровождались цианозом лица, апноэ отмечалось у 75,0 ± 15,3% детей. Энцефалические расстройства возникали у 37,5 ± 17,1% детей. Тяжелые приступы кашля приводили к утомлению, нарушению самочувствия, снижению аппетита у всех детей. В некоторых случаях наблюдалась анорексия, послужившая поводом для назначения зондового питания. Изменения в анализах крови характеризовались повышением числа 100 100 100 100-| 9080706050403020100- 71,4 66,7 83,3 72,9 66,7 Й 28,6 50,1 33,3 33,3 27,1 00 ООО ООО & '/A' jr rT s jf e> ✓ ON J" rP op" дгг <f / 312 Ц 322 □ 319 329 Рис. 3. Частота основных клинических проявлений у детей с тяжелой формой коклюша в зависимости от генотипических свойств штаммов B. pertussis (MAST2). * - статистически значимые различия при р < 0,05. лейкоцитов до 21-30 • 109/л у значительного числа детей (62,5 ± 17,0%), а у 37,5 ± 17,1% больных отмечен лейкоцитоз выше 30 • 109/л. Вместе с тем заболевание коклюшем в группе детей, у которых идентифицированы штаммы B. pertussis генотипа 232 МАSТ1, реже сопровождалось апноэ и значительно реже, чем в группе детей с генотипом 932 МАSТ1. осложнялись энцефалическими нарушениями (9,1 ± 8,7% больных). В группе больных с тяжелой формой коклюша, у которых заболевание было вызвано штаммами B. pertussis генотипов 319 и 329 МАSТ2, обращало на себя внимание наиболее тяжелое клиническое течение коклюша (рис. 3). Апноэ, зачастую повторные, наблюдавшиеся у всех детей, приводили к развитию энцефалических расстройств при коклюше, вызванном штаммами B. pertussis генотипа 329 МАSТ2, у половины пациентов (50,0 ± 20,4%). В этой группе детей чаще и более был выражен отечный синдром (75,2 ± 21,6 и 83,3 ± 15,0%), в то время как удельный вес таких детей среди больных коклюшем, вызванным генотипом 312 МАSТ2, составил 33,5 ±27,2% (p > 0,05). При изучении влияния генотипических свойств коклюшного микроба на клинические проявления у больных со среднетяжелой формой также были выявлены некоторые различия. Прежде всего обращало на себя внимание, что среднетяжелые формы значительно чаще вызывались штаммами B. pertussis генотипа 232 МАSТ1 (у 63,3 ± 8,8% больных) и генотипами 312 и 322 МАSТ2 практически с одинаковой частотой (33,3 ± 8,6 и 30,0 ± 8,4% больных соответственно). При оценке симптоматики установлено, что проявления коклюша были наиболее выражены при инфекции, вызванной так же, как и у больных с тяжелой формой, штаммами B. pertussis генотипов 932 МАSТ1. 319 ]МА^Т2 и 329 ]МА^Т2. В этой группе больных частота приступов находилась в пределах 20-25 раз в сутки у большинства детей. У некоторых детей приступы кашля сопровождались цианозом губ, носогубного треугольника, который в отличие от тяжелых форм носил кратковременный характер. Более постоянным был отечный синдром, который развивался у 52,3 ± 11,4 и 80,0 ± 17,9% детей. Гематологические показатели коррелировали с клиническими данными. Наибольший удельный вес с повышением количества лейкоцитов до 21-30 • 109/л отмечен у больных, выделивших штаммы B. pertussis генотипа 329 МАSТ2, составивших 80,0 ± 12,6%. Обращает на себя внимание, что удельный вес таких детей был достаточно высоким и среди больных коклюшем, вызванным штаммами B. pertussis генотипа 322 МАSТ2 (77,8 ± 13,8% больных). Вместе с тем наши исследования показали, что генотипические свойства коклюшного микроба не оказывали влияния на характер бронхолегочных изменений. Ателектазы наблюдались только при тяжелых формах коклюша в виде единичных случаев при коклюше, вызванном штаммами B. pertussis генотипов 232 MAST1, 932 MAST1 и 322 ]МАЖ2. Таким образом, биологические свойства коклюшного микроба по-прежнему являются одним из важных факторов, определяющих особенности течения коклюша у детей. Проведенные нами клиникомикробиологические сопоставления показали, что в современных условиях существенное влияние на клинические проявления коклюша оказывают генотипические свойства коклюшного микроба. Наиболее тяжелое течение коклюшной инфекции вызывают штаммы B. pertussis генотипов 932 MAST1 и 319, 329 MAST2.

About the authors

O. P Popova

Moscow Scientific Research Institute of Epidemiology and Microbiology named after G.N. Gabrichevsky of the Federal Service for the Oversight of Consumer Protection and Welfare

Email: doctorpopova@yandexl.ru
10, Ul. Admirala Makarova, Moscow, Russian Federation, 125212

O. Yu Borisova

Moscow Scientific Research Institute of Epidemiology and Microbiology named after G.N. Gabrichevsky of the Federal Service for the Oversight of Consumer Protection and Welfare

Email: olgborisova@mail.ru
10, Ul. Admirala Makarova, Moscow, Russian Federation, 125212

M. S Petrova

Moscow Scientific Research Institute of Epidemiology and Microbiology named after G.N. Gabrichevsky of the Federal Service for the Oversight of Consumer Protection and Welfare

10, Ul. Admirala Makarova, Moscow, Russian Federation, 125212

N. M Gracheva

Moscow Scientific Research Institute of Epidemiology and Microbiology named after G.N. Gabrichevsky of the Federal Service for the Oversight of Consumer Protection and Welfare

10, Ul. Admirala Makarova, Moscow, Russian Federation, 125212

E. N Abramova

A. S Pimenova

Moscow Scientific Research Institute of Epidemiology and Microbiology named after G.N. Gabrichevsky of the Federal Service for the Oversight of Consumer Protection and Welfare

10, Ul. Admirala Makarova, Moscow, Russian Federation, 125212

N. T Gadua

Moscow Scientific Research Institute of Epidemiology and Microbiology named after G.N. Gabrichevsky of the Federal Service for the Oversight of Consumer Protection and Welfare

10, Ul. Admirala Makarova, Moscow, Russian Federation, 125212

References

Supplementary files