Therapeutic effect of aerosol form of aprotinin against Influenza

Full Text

Введение На текущий момент существуют только две группы противогриппозных химиопрепаратов с идентифицированным антивирусным механизмом, направленным на определенные этапы жизненного цикла вируса. Это препараты амантадинового ряда, ингибирующие вирусные ионные каналы М2, и структурные аналоги нейраминовой кислоты, специфически связывающие и ингибирующие вирусную нейраминидазу - NA [1, 2]. К 1-й группе относятся официнальные препараты - амантадин, ремантадин, а 2-ю группу составляют - занамивир (реленза™), осельтамивир (тамифлю™), перамивир. В последние несколько лет сформирована 3-я группа антигриппозных препаратов, действие ингибирует точечный протеолиз вирусного гемагглюти- нина НА0 (мол. масса75 кД) на субъединицы НА1 (55 кД) и НА2 (20 кД) на стадии активации вируса про- теазами хозяина [3-6]. К этой группе относится природный низкомолекулярный полипептид апротинин, способный блокировать протеазы, которые отвечают за активацию вируса гриппа в респираторном тракте человека [7, 8]. Это направление в химиотерапии гриппа подтверждено работами ряда международных лабораторий [9-11]. В 2010 г. в РФ зарегистрирован миниатюрный ингалятор дозированного типа, содержащий в качестве активного вещества апротинин (препарат аэрус™; ЛСР-000280/10). Ингалятор генерирует среднедисперсный аэрозоль апротинина для вдыхания и распределения в респираторном тракте - первичном очаге гриппозной инфекции. В настоящей работе проведено изучение терапевтической и противовирусной активности аэрозоля апротинина у пациентов в период зимне-осенней вспышки гриппа, вызванной преимущественно пандемическим вирусом гриппа H1N1pdm09. Материал и методы Использованы группы пациентов. Исследование выполнено в инфекционной клинической больнице №1 Москвы в период зима-осень 2013 г. в фазе подъема заболеваемости. В исследование было включено 30 больных с диагнозом при поступлении ОРВЗ или грипп. Рандомизацию пациентов осуществляли по мере поступления в стационар. Больные были разделены случайным слепым методом на 2 группы: группа А и И, получавшие препарат аэрус и ингавирин соответственно. Группа А включала 15 пациентов, у которых заболевание протекало в среднетяжелой форме, состояла из 11 мужчин и 4 женщин, средний возраст которых составил 22,4±1,4 года. Пациенты поступали через 2,1±0,19 дня болезни (с 1-го по 3-й день болезни). Продолжительность госпитализации составила 5,1±0,9 дня (от 3 до 10 дней). Группа И включала 15 пациентов, у которых заболевание протекало в среднетяжелой форме и состояла из 12 мужчин и 3 женщин, средний возраст в группе составлял 28,5±3,1 года. Пациенты поступали через 2,4±0,25 дня болезни (с 1-го по 4-й день болезни). Продолжительность госпитализации составила 6,2±2,4 дня (от 3 до 9 дней). Клинический диагноз острого респираторного заболевания устанавливали на основании следующих критериев: острое начало заболевания с повышения температуры; наличие катарального синдрома (кашель, насморк, першение в горле, осиплость голоса, боли в горле и груди); синдром интоксикации (слабость, головная боль, мышечные, суставные боли, боли в глазных яблоках); местные изменения: гиперемия слизистой ротоглотки (зернистость задней стенки глотки, увеличение миндалин). Критериями отбора больных в исследование были срок от начала заболевания не более 3 сут, наличие 1 симптома интоксикационного синдрома или нескольких (слабость, озноб, головная боль, ломота в теле, тошнота, рвота) в сочетании с 1 симптомом катарального синдрома или несколькими (кашель, боли в горле, насморк), а также повышение температуры тела > 37,5°С. Из исследования исключались беременные женщины, женщины, находящиеся в периоде лактации, пациенты, принимавшие амбулаторно тамифлю™, а также больные с тяжелыми хроническими заболева- 100-1 806040200- I Аэрус 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Ингавирин Рис. 1. Профили клинических проявлений в исследуемых группах пациентов при поступлении в стационар. Клинический статус оценивали при поступлении больных в стационар. Количество пациентов с определенным симптомом выражали в процентах по оси ординат относительно общего количества пациентов в исследуемой группе А или И соответственно (100%). Ось абсцисс: 1 - слабость; 2 - головная боль; 3 - озноб; 4 - ломота в теле; 5 - головокружение; 6 - рвота; 7 - тошнота; 8 - боль при движении глаз; 9 - резь в глазах при взгляде на свет; 10 - слезотечение; 11 - кашель; 12 - боль в горле; 13 - боль в грудной клетке; 14 - насморк; 15 - боль в области поясницы. ниями респираторного тракта и хронической алкогольной и наркотической интоксикацией. Этиологию заболевания подтверждали данными анализа по определению вирусных антигенов в мазках методом иммунной флюоресценции (ИФ) со специфическими антителами и данными генетического анализа методом ОТ-ПЦР по идентификации вирусных геномов в назофарингеальных смывах. Лабораторная диагностика: всем пациентам проводилось комплексное клинико-лабораторное обследование. Лабораторные методы исследования включали: клинические анализы крови и мочи, определение антигенов вируса (гриппа, парагриппа, аденовируса, PC-вируса) методом ИФ в назофарингеальных мазках, а также идентификацию вируса методом обратно-транскриптазной полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) с использованием прай- мерных олигонуклеотидов, специфичных для геномов вируса гриппа H1N1 и H3N2. Лечебный режим: группу контроля (плацебо) без специфического противовирусного лечения не формировали по этическим соображениям. Препарат аэрус применялся индивидуально каждым пациентом путем вдыхания 1 аэрозольной дозы препарата через каждый носовой ход (общая разовая доза 160 КИЕ апротинина), каждые 2 ч в течение всего дня в течение 5 дней. В группе сравнения пациенты получали препарат ингавирин по стандартной схеме - 90 мг ежедневно в течение 5 дней. Вирус обнаруживали методом ОТ-ПЦР в назальных смывах от больных. Всем больным проводились носоглоточные смывы 2 раза в день с интервалом 6 ч в течение 3 дней. Назофарингеальный смыв (НФС), полученный от больного в объеме 6-8 мл фосфатносолевого буфера (ФСБ), центрифугировали при 5000 об/мин при 4°С в течении 20 мин (центрифуга Ep- pendorf 5804R, ротор А4-44). Супернатант отбирали, клеточные осадки суспендировали в 250 мл ФСБ, содержащем 0,5% бычьего сывороточного альбумина и 100 сд/мл ингибитора нуклеаз и дезинтегрировали с помощью ультразвука на соникаторе Branson модель 450 (США) в течение 2 мин при 0°С. Далее 60 мкл гомогената смешивали с 260 мл лизирующего буфера для выделения РНК и последующей ОТ-ПЦР с праймерами, специфичными для вируса гриппа А и В, согласно протоколу фирмы (АмплиСенс Influenza virus А-тип-FL; Россия) на амплификаторе Bio-Rad IQ5 (США). Количество вируса оценивали в геном- эквивалентах вирусной РНК (гэвРНК) на 1 мл НФС, которое рассчитывали по величине пороговой Ct от относительно калибровочной пробы РНК в наборе. Для нормализации показателя гэвРНК использовали количество рибосомальной ^S-РНК в НФС, которое определяли методом ПЦР в реальном времени с праймерами, специфичными для ^S-РНК человека. Результаты и обсуждение В исследование включено 30 пациентов. При объективном осмотре обнаруживали признаки как катарального синдрома, такие как болезненность и першение в горле, кашель, дискомфорт в носу, насморк, осиплость голоса, боли в горле и груди, так и синдрома интоксикации, такие как головная боль, слабость, ломота. При осмотре ведущими симптомами были головная боль, слабость, ломота, першение в горле, боли в горле, покашливание, осиплость голоса, боли в груди, кашель. Состояние исследованных пациентов квалифицировали как среднетяжелое на основании следующих критериев: наличия лихорадки (37,5°С и выше), признаков синдрома интоксикации и дыхательной недостаточности не выше I степени. Профиль клинических показателей был сходным между группами пациентов, получавших аэрозольный апротинин и ингавирин (рис.1). При жалобах на кашель и ослабленном дыхании, наличии сухих или влажных хрипов проводилось рентгенологическое исследование легких для исключения пневмонии. У всех пациентов, взятых в исследование, методом ОТ-ПЦР в реальном времени был идентифицирован вирус пандемического гриппа H1N1pdm09 (H1N1). Обе группы пациентов имели также сходный профиль изменений в картине крови. По данным анализа при поступлении пациентов в стационар в группе А лейкопения отмечалась у 1 больного (3,6-103/млЗ), лейкоцитоз был у 3 пациентов (от 9,4 до 17,9-103/ млЗ), лимфоцитоз - у 3 (от 38 до 40%), тромбоцито- пения выявлена у 5 (от 121 до 179-103/млЗ); в группе больных И лейкопения отмечалась у 1 больного (3,2-103/млЗ), лейкоцитоз был у 3 пациентов (от 9,1 до 18,6-103/млЗ), лимфоцитоз - у 2 (от 38 до 40%), тромбоцитопения - у 2 (от 149 до 174-103/млЗ). Исследуемые пациенты получали либо аэрозоль- 5 6 j Аэрус 1 1 1 Дни ^ Ингавирин | Аэрус Рис. 2. Динамика нормализации температуры тела у больных гриппом H1N1 при лечении аэрозольным апротинином и препаратом ингавирин. Ежедневную температуру определяли в подмышечной области в течение всего курса лечения в стационаре. Количество пациентов, которые имели температуру тела 37° С и выше, выражали в процентах (ось ординат) относительно общего количества пациентов в исследуемой группе А или И, соответственно (100%). Ось абсцисс - дни от начала лечения. ный апротинин посредством ручного ингалятора аэ- рус (группа А), либо ингавирин (И). Для сравнения эффективности лечения препаратами аэрус и инга- вирин взяли динамику снижения температуры тела в течение лечебного курса (рис. 2). До начала лечения все пациенты в обеих группах имели лихорадку, которая характеризовалась температурой 39,0±0,5 и 39,3±0,6°С в группах А и И соответственно. Как видно на рис. 2, при лечении аэрозолем апротини- на у большей части (65%) пациентов нормализация температуры наблюдалась уже к концу 1-го дня лечения и дальнейшее снижение после двух дней лечения. В группе с ингавирином сходная динамика падения температуры тела наблюдалась с отставанием на 1 день в сравнении с пациентами, получавшими 10и 8& 5 X Ct 64 24 апротинин. У небольшой части (около 20%) в обеих группах держалась субфебрильная температура (37,6±0,7°С) до 4-5-го дня лечения. Сравнение продолжительности основных симптомов заболевания в группах пациентов, получавших ингавирин и апротинин, показано на рис. 3. Как видно на рис. 3, продолжительность основных симптомов (слабость, боль в горле и груди, насморк, головная боль, повышение температуры) оказалась на 1-2 дня короче в группе с препаратом аэрус. Не отмечено снижения продолжительности кашля у пациентов при лечении апротинином по сравнению с ингавирином. При наблюдении за пациентами обращали внимание на возможность возникновения побочных эффектов от приема лечебных препаратов. На протяжении всего срока пребывания в стационаре у пациентов, получавших аэрозольный апротинин и ингавирин, не обнаружено каких-либо побочных нежелательных проявлений, таких как кожные высыпания, раздражение слизистых, симптомы аллергии, диспепсические расстройства. Аэрозольный апротинин все больные переносили хорошо, жалоб на дискомфорт от приема препарата не было. Для оценки противовирусного действия аэрозольного лечения апротинином оценивали уровень вируса в носоглоточных смывах, взятых от больных на 2-й день после начала лечения. Из полученных смывов выделяли фракцию РНК и определяли в ней количество вирусных РНК-геном-эквивалентов (гэвРНК) методом ОТ-ПЦР в реальном времени, используя праймеры, специфичные для генома вируса Ингавирин Аэрус Рис. 4. Уровни вирусной нагрузки у больных гриппом H1N1 при лечении аэрозольным апротинином и препаратом инга- вирин. На 2-й день от начала лечения у больных дважды в день брали назофарингеальные смывы методом ОТ-ПЦР в реальном времени с вирусспе- цифическими праймерами, определяли количество геном-эквивалентов вирусной РНК (гэвРНК) в 1 мл смыва. Уровни вирусной нагрузки делили на три категории (10[2]-10[3], 10[4]-10x, < 10 гэвРНК/мл) и количество смывов в каждой категории выражали в процентах от общего количества смывов (100%) в группах А (исследовано 23 смыва) или И (14 смывов) соответственно. гриппа A H1N1. Результаты, представленные на рис. 4, показывают, что уровень вирусной нагрузки в носоглотке лишь у небольшой группы пациентов в обеих сравниваемых группах достигал уровня 104-106 гэвРНК/мл смыва, а у подавляющего числа пациентов он находился в диапазоне 103 гэвРНК/мл и ниже. Важно отметить, что уровень вирусной нагрузки в группе апротинина был заметно более низким, чем в группе пациентов с лечением ингавирином. Так, в группе апротинина доминировали пациенты с уровнем < 10 гэвРНК/мл, тогда как в группе ингавирина преобладали пациенты с уровнем вируса 103--101 гэвРНК/мл. Средние уровни вирусной нагрузки в носоглоточных смывах в группах апротинина и ин- гавирина составляли 0,56 ± 0,41 • 102 и 6,3 ± 0,31 • 102 (р < 0,05) гэвРНК в 1 мл смыва соответственно. Исследования настоящей работы показывают лечебную и противовирусную эффективность ингаляций аэрозоля апротинина, генерированного с помощью ручного дозированного ингалятора пропел- лентного типа, у пациентов при гриппе. Эти данные хорошо коррелируют с более ранними нашими наблюдениями о положительном терапевтическом эффекте ингаляций апротинина, выполненных на ингаляторах стационарного типа, у больных при гриппе и других ОРВИ [12-15]. Полученные клинические результаты коррелируют также с наблюдениями на животных, страдающих тяжелой парамиксвирусной бронхопневмонией, которая купировалась ингаляциями апротинина [16]. Результаты настоящей работы подтверждают концепцию о направленной противовирусной химиотерапии гриппа и других респираторных вирусных инфекций ингибиторами протеаз [3, 5]. При гриппе мишенью атаки апротинина (ингибитора протеаз) служат протеазы, которые расщепляют вирусный гемагглютинин HA0 на НА1 и НА2 на этапе активации инфекционности вирионов при многоцикловом размножении вируса. Более того, апротинин купирует воспаление, которое вызывает вирус в респираторном тракте [5, 6]. Механизм противовирусного действия ингави- рина представляется недостаточно ясным. Имеется ряд публикаций о лечебной эффективности ингави- рина при гриппе [17, 18]. В опытах in vitro показана его ингибирующая активность против вирусов различных семейств, включая вирусы гриппа, аденовирусы, вирусы парагриппа и др. [19, 20]. Однако механизм столь широкой противовирусной активности пока не идентифицирован и не исключено, что этот препарат может относиться к группе иммуномодуляторов. Терапевтический эффект в настоящей работе установлен у пациентов с гриппом при многократном суточном ингаляционном применении аэрозоля апротинина, генерируемого ручным аппаратом дозированного типа. Такой мини-ингалятор, сконструированный нами на основе озонсберегающего пропеллента А-134 и апротинина в качестве активного вещества, разрешен в 2010 г. для применения у людей для лечения гриппа и ОРВИ [4]. Вполне очевидно, что мини-ингалятор имеет ряд достоинств. Во-первых, он может применяться пациентами индивидуально, что важно для предотвращения кроссконтаминации в условиях стационара при лечении многих пациентов. Во-вторых, он делает возможным частое воздействие апротинином на респираторный тракт, что способствует более надежному действию апротинина в респираторном тракте, поскольку сурфактант, покрывающий респираторный эпителий, обменивается в течение 1-2 ч, удаляя, таким образом, введенный апротинин. Клинические испытания настоящей работы показывают его клиническую эффективность, полную безвредность и отсутствие побочной токсичности. Апротинин обладает ингибирующим действием на две важные протеазы, простазин и матриптазу, участвующие в активации натриевых (Na+) ионных каналов в респираторном эпителии [21]. Такое ингибирование каналов апротинином приводит к замедлению реабсорбции ионов натрия и жидкости эпителием респираторного тракта [22, 23] и способствует увеличению объема секрета и снижению его вязкости. Действие апротинина на ионные каналы в респираторном тракте усиливает дренирование бронхиальной системы у пациентов. В последнее время обоснованную тревогу вызывают вирусы птичьего гриппа H7N9, которые вызвали вспышку гриппа среди людей в Китае в 2013 г. с летальностью около 20-30% [24]. Вирус имел устойчивость к препаратам амантадинового ряда [25], но сохранял чувствительность к препаратам из группы ингибиторов нейраминидазы (НА), таких как осельтамивир (тамифлю™), занамивир (реленза™), перамивир [24, 26]. Белок НА этого штамма имел единичный остаток аргинина в сайте расщепления на НА1 и НА2 [24], что указывало на его активацию в респираторном тракте трансмембранными протезами трипсинового типа, такими как TMPRSS-2. TMPRSS-4, HAT, матриптаза [27-31]. Эти протезы имеют высокую чувствительность к апротинину [5, 29-31] и хорошо блокируются этим ингибитором в респираторном эпителии при инфекции вирусами гриппа [5, 7, 8]. Таким образом, для эффективного лечения гриппа, вызванного вирусом H7N9, можно рекомендовать аэрозольную форму апротинина, который будет ингибировать размножение вируса H7N9 и подавлять воспаление в респираторном тракте.

About the authors

O. P Zhirnov

D.I. Ivanovsky Institute of Virology

16, Gamalei Str., Moscow, Russian Federation, 123098

N. O Bokova

Moscow Infectious Clinics N1

63, Volokolamskoe Shosse, Moscow Russian Federation, 119419

E. I Isaeva

D.I. Ivanovsky Institute of Virology

16, Gamalei Str., Moscow, Russian Federation, 123098

I. V Vorobeva

D.I. Ivanovsky Institute of Virology

16, Gamalei Str., Moscow, Russian Federation, 123098

T. E Konakova

D.I. Ivanovsky Institute of Virology

16, Gamalei Str., Moscow, Russian Federation, 123098

N. A Malyshev

Moscow Infectious Clinics N1

63, Volokolamskoe Shosse, Moscow Russian Federation, 119419

References

Supplementary files