Features of the replication of hantaviruses - pathogens of hemorrhagic fever with renal syndrome in cell cultures of different origin

Full Text

Хантавирусы, образующие одноименный род в составе обширного семейства буньявирусов, единственные в этом семействе нетрансмиссивные вирусы. 10 из 23 зарегистрированных в международном каталоге хантавирусов патогенны для человека и вызывают хантавирусные лихорадки с летальностью от 1-2 до 50%. На Евро-Азиатском континенте это вирусы Пуумала, Добрава, Хантаан и Сеул, вызывающие геморрагическую лихорадку с почечным синдромом (ГЛПС), на американском континенте это в основном вирусы Син Нобр и Андес, вызывающие хантавирусный пульмональный синдром [1]. Естественными хозяевами хантавирусов являются грызуны и насекомоядные, в организме которых вирус длительное время коэволюционировал. Для них характерна видоспецифичность, т. е. наличие у каж- дого генотипа или геноварианта лишь одного основного хозяина (вида или подвида), связанного с ним эволюционно, у которого хантавирусы вызывают хроническую бессимптомную инфекцию [2]. Вирус передается главным образом аэрогенным путем; вируссодержащими являются экскреты мышевидных грызунов. Хантавирусы с трудом адаптируются к размножению в организме лабораторных животных, а также в клеточных культурах, что, вероятно, объясняет более чем тридцатилетний период безуспешных попыток изолировать возбудитель ГЛПС, вирусная природа которого уже была доказана [3]. Лабораторная модель хантавирусной инфекции известна только для вируса Андес, это сирийские хомячки, у которых инфекция протекает летально и симптоматически напоминает течение этой инфекции у человека [4]. Размножение хантавирусов Хан- таан и Сеул в лабораторных условиях поддерживают новорожденные белые мыши, вирусов Пуумала и Син Номбр - сирийские хомячки и монгольские песчанки. Возможность использования клеточных культур для культивирования хантавирусов стала активно изучаться после успешной адаптации вируса Хантаан, изолированного на лабораторных мышах, к культуре клеток карциномы легких человека, А549 [5]. Впоследствии для изучения различных свойств хантавирусов, в том числе патогенеза хантавирусных инфекций, а также при разработке инактивированных вакцин были использованы как первичные клеточные культуры: клетки эндотелия человека [6], эндотелиальные клетки пупочной вены человека [7], клетки перитонеального экссудата и макрофаги крысы, макрофаги человека [8], клетки почки человека [9], клетки почки монгольской песчанки, клетки почки золотистого хомячка [10], так и перевиваемые линии клеток, полученные из органов человека, в том числе опухолевого происхождения: легкого (WI-38, A-427, CCD-11Lu), почки (A-704), печени (Hep G2), глотки (Detroit 562), подчелюстных желез (A-253) [9], клетки почек обезьян цино- мольгус (CV1), почек сирийского хомяка (BHK21), лимфобластомы домовой мыши (P388D1) [11]. Несмотря на многочисленные исследования, подбор клеточной культуры пригодной в качестве субстрата для производства вакцин против ГЛПС остается одной из актуальных проблем. К настоящему времени инактивированные хантавирусные вакцины производятся в Китае, КНДР и Южной Корее на основе вирусов Хантаан и Сеул, но они не обладают защитным действием против вируса Пуумала - основного возбудителя ГЛПС у жителей европейской части России, на которую приходится более 98% всей заболеваемости, регистрируемой в России. В середине 1990-х годов совместно с южно-корейскими исследователями нами была разработана технология изготовления моновалентной (против вируса Пуума- ла) и комбинированной (против вирусов Пуумала и Хантаан) вакцин на основе субстрата мозговой ткани сирийских хомяков. Однако мозговые вакцины не могут удовлетворять в полной мере современным национальным и международным требованиям, предъявляемым к медицинским иммунобиологическим препаратам, вводимым людям. Трудности с разработкой культуральной вакцины против хантавируса Пуумала связаны с ограниченным выбором чувствительных к размножению этого вируса клеточных культур и низкого уровня репродукцией вируса. В настоящей работе представлены результаты адаптации штаммов вирусов - возбудителей ГЛПС к размножению в перевиваемых культурах клеток различного происхождения в попытке найти клеточную систему, обеспечивающую получение высокоактивного вирусного субстрата при производстве вакцины против ГЛПС, разработка которой активно ведется в Институте полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова РАМН. Материалы и методы Клетки: Vero - (ATCC No.C^-81) перевиваемая культура клеток почки зеленой мартышки; Vero E6 - (ATCC No. CRL-1586) клон культуры Vero, отличается от исходной определенной степенью контактной ингибиции роста; 4647 (73-й пассаж) - линия гетероплоидных клеток почки взрослой зеленой мартышки; 455 (56-й пассаж) - линия перевиваемых клеток селезенки взрослой зеленой мартышки; 4184 (81-й пассаж) - линия перевиваемых клеток почки эмбриона овцы; ПТ-1 (75-й пассаж) - перевиваемая культура клеток почки теленка. Культуры клеток 4647, 455, 4184 и ПТ-1 были получены и охарактеризованы в ИПВЭ им. М.П. Чумакова Л.Л. Мироновой и соавт. [12]. Вирусы: Пуумала, штамм И27/Уфа-85; Добра- ва/Белград (далее вирус Добрава), штамм Ар1584/ Сочи-01, штамм ЕАТ/Липецк-07. Иммунные сыворотки больных и реконвалесцен- тов ГЛПС из коллекции лаборатории геморрагических лихорадок. Вирусспецифический антиген в инфицированных клетках выявляли с помощью непрямого МФА [13]. Суспензию инфицированных клеток (450-550 тыс. кл/мл) вносили по 0,005 мл в лунки предметных стекол с тефлоновым покрытием. После высушивания клетки фиксировали охлажденным ацетоном. На антигенные препараты наносили соответствующие референс-сыворотки, содержащие антитела к ханта- вирусам в разведениях, начиная с 1:64 и заканчивая разведением, соответствующим титру сыворотки, а также нормальную сыворотку, не содержащую антител к хантавирусам, в разведениях с 1:16-1:64. Препараты помещали во влажную камеру и инкубировали при 37 ± 1° С в течение 30 мин после чего троекратно отмывали физиологическим раствором (0,85% NaCl), промывали дистиллированной водой, высушивали и вносили в лунки с антигеном анти- видовые антитела, меченные ФИТЦ. После инкубирования при 37 + 1°C в течение 30 мин стекла промывали, высушивали и исследовали с помощью люминесцентного микроскопа, используя водноиммерсионный объектив x 65. В культуральной жидкости (КЖ) и лизате клеток (КЛ) вирусспецифический антиген определяли им- муноферментным методом (ИФА), используя тест- систему Хантагност производства ФГУП “Предприятие по производству бактерийных и вирусных препаратов Института полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова”, согласно инструкции производителя, а также метод ИФА для детекции антигенов на основе моноклональных антител (мАТ) - тест-систему “ХАНТА-N” [14]. В лунки нечетных рядов панели (Сostar” #9018) вносили по 100 мкл IgG (мАТ ДОБ, клон F1, или мАТ ПУУ, клон D4) в концентрации 1-3 мкг/мл, в четные ряды - мышиные IgG, не имеющие специфичности по отношению к хантавирусам; после 18 ч контакта при 4°C вносили по 100 мкл 2% БСА и черз 1 ч контакта при комнатной температуре лунки промывали, вносили исследуемый образец в двукратных разведениях в ИФА- буфере (PBS + 0,1% BSA + 0,01% Твин-20) по 50 мкл на лунку. После18 ч контакта при 4°C панель промывали и вносили по 50 мкл на лунку IgG (ДОБ, клон A4), меченные пероксидазой хрена. После контакта (1 ч 37°C) панель промывали, вносили индикатор - тетраметиленбензидин (Sigma № Т8665) по 100 мкл и выдерживали при комнатной температуре в течение 15-20 мин. После остановки реакции 2М серной кислотой фотометрировали лунки на приборе Multiskan (длина волны 450 нм). Положительной считали пробу, для которой отношение оптической плотности в лунке со специфическим иммуноглобулином превышало показатель оптической плотности с нормальным иммуноглобулином в 2,1 раза (индекс P/N). Индикацию вируса осуществляли методом титрования фокус-образующих единиц (ФОЕ) [13]. Монослой клеток VERO-E6, выращенных в 24- луночных панелях (Costar, 3524), заражали десятикратными разведениями вируса. После контакта с клетками при 37°C в течение 1 ч инокулят удаляли и вносили метилцеллюлозное покрытие (Sigma). После инкубации при 37°C в течение 6-7 сут, полужидкое покрытие удаляли, клетки отмывали 0,85% раствором NaCl. Монослой клеток фиксировали 96% этиловым спиртом, после чего клетки троекратно отмывали и вносили в лунки специфические анти- хантавирусные антитела. После контакта при 37°C в течение 60 мин клетки троекратно по 5 мин отмывали и вносили в лунки меченный пероксидазой белок “А” (Sigma). После контакта в течение 60 мин при 37°C клетки троекратно по 10 мин отмывали и вносили индикатор пероксидазы. В качестве субстрат- индикаторной системы применяли 0,05% диамино- бензидин тетрахлорид (Sigma) с добавлением 0,02% NiCl2 (Sigma) и 0,01% Н2О2. Через 15-20 мин лунки промывали проточной водой, подсушивали и проводили учет опыта. Подсчитывали количество инфицированных колоний клеток, выявляемых визуально в виде темно-серых пятен ФОЕ; титр вируса выражали в lg ФОЕ в 1 мл вносимого для инфицирования клеток образца. Для выявления вирусной РНК применяли универсальную родоспецифическую гнездовую Pan-Hanta- L-PCR [15]. Для выделения вирусной РНК использовали культуральную жидкость и лизаты клеток инфицированных клеточных культур. В качестве лизирую- щего буфера использовали TRIZOL (Sigma) в соотношении 900 мкл реагента к 100 мкл образца. Выделение РНК проводили методом хлороформ-фенольной экстракции. К-ДНК получали обратной транскрипцией в смеси объемом 20 мкл, содержащей 4 мкл буфера (x 5) (Fermentas), 2 мкл 2,5М смеси трифосфатов (Си- бЭнзим), 2 мкл N6 праймера (СибЭнзим), 0,5 мкл обратной транскриптазы (Thermo Scientific Maxima Reverse Transcriptase, 200 е. а/мкл), 10 мкл раствора РНК. Образцы инкубировали при 25, 42 и 96°C в течение 10, 30 и 6 мин соответственно. Внешние праймеры: HAN-L1F: 5 -ATG TAY GTB AGT GCW GAT GC-3'; HAN-L1R: 5-AAC CAD TCW GTY CCR TCA TC-3'. Внутренние праймеры (Nested): HAN-L2F: 5'- TGC WGA TGC HAC IAA RTG GTC-3'; HAN-L2R: 5 -GCR TCR TCW GAR TGR TGD GCA A-3'. Готовили смесь (20 мкл), содержащую: 2 мкл буфера (x 10) и 2 мкл 2,5М смеси трифосфатов (СибЭнзим), 2 мкл 50 мМ MgCl2 (СибЭнзим), по 10 пМ каждого праймера, 2 мкл к-ДНК (или амплификата), 1 мкл Hot Start Taq ДНК полимеразы (1000 е.а., Сибэнзим). Амплификацию проводили в терцике (ДНК-Технология) с маслом (Helicon) в условиях: 95°C 15 мин, затем 40 (или 25 в случае NESTED) циклов по 30 с при 95°C, 45 с при 53°C, 45 с при 72°C, терминация 72°C 6 мин. Детекция амплификатов проводилась с помощью горизонтального гель-электрофореза в 2% агарозе (Amresco) и ТБЕ-буфере. В качестве стандарта использовали GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder Unit Size 50 мкг (Fermentas). Монослойные клеточные культуры, выращенные во флаконах 25 или 75 см2, заражали соответствующим вирусом в объеме инокулята 1,0 или 2,0 мл с множественностью 0,1-0,5 ФОЕ/кл. В качестве сравнения служила культура Vero E6, в которой хан- тавирусные штаммы были изначально изолированы. Для полноценной адаптации к росту в клеточной системе, отличной от Vero E6, применяли метод пассирования хронически зараженной культуры, используемый при изоляции хантавирусных штаммов от естественных хозяев, а также пассажи лизатов инфицированных клеток. Пассаж зараженной культуры осуществляли через 14 дней (1-3-й пассажи), далее через 9-11 дней; в это же время проводили контроль зараженности клеток, а также инфекционного вируса в культуральной жидкости. Результаты и обсуждение Для выяснения степени чувствительности способов детекции размножения вируса в клеточных культурах было проведено сравнение методов выявления вирусного антигена по иммунофлюоресценции и ИФА, индикации инфекционного вируса по титрованию ФОЕ в культуральной жидкости и лизате клеток, а также определение вирусной РНК. Полученные данные, обобщенные в таблице, показали, что для индикации размножения вируса Индикация вируса Добрава, штамм Ар1584/Сочи-01 в культуре Vero E6 Часы после ДОБ/ заражения Сочи ФОЕ ИФА ПЦР МФА 24 КЛ Отр. Отр. К/и ед. кл. 48 КЛ Отр. Отр. Отр. 10-15% 72 КЖ 3,1 Отр. Отр. КЛ 3,5 Отр. Отр. 25-30% 96 КЖ 3,6 Отр. + КЛ 4 + + 50-60% КЖ 4,4 + + 120 КЛ 4,6 + + 75-80% КЖ 4,7 + + 144 КЛ 5,2 + + 90-95% 100-, 2 О j» 80- 90s ii 604 70- 5040 3020100 И Я 2 100-1 g 90- Si 80- I 70- eo 60- “ 50° 40- Ш 30- I 20- § 10- ct 0и I I I a О Cl L 12 3 Культура клеток 13 Vero E6 0 Vero 0 4647 0 455 НПТ-1 8 ' 14184 б Номер пассажа вируса Культура клеток -S3-Е-6 -A-Vero HD-4647 -ЧН- 455 ПТ-1 -0-4184 Культура клеток H Vero E6 0 Vero ] 4647 0 455 ИПТ-1 14184 Добрава наиболее чувствительным является определение вирусного антигена в клетках методом иммунофлюоресценции. Антигенсодержащие клетки можно было наблюдать через 24 ч после заражения культуры, тогда как методом ифА антиген обнаруживался спустя 96-120 ч после заражения. Вторым по чувствительности явился метод титрования вируса по ФОЕ: инфекционный вирус обнаруживался в КЖ и лизате КЛ культуры Vero E6 при зараженности более 25% клеток. Вирусная РНК определялась при титре вируса более 3,5 lg ФОЕ/мл. Похожие результаты были получены и для вируса Пуумала, штамм К27/Уфа-85 (результаты не приводятся). Исходя из этих данных, оценка чувствительности той или иной клеточной линии к размножению хантавиру- сов проводилась по результатам определения специфического антигена МФА и инфекционного вируса по выявлению ФОЕ как наиболее чувствительных и специфичных методов. Результаты динамики накопления вирусного антигена в клетках и инфекционного вируса в культуральной жидкости исследуемых клеточных культур отражены на рис. 1, а, б (Пуумала, штамм К27/Уфа- 85), 2, а, б (Добрава-Куркино, шт. ЕАТ/Липецк-07). Рис. 1. Динамика накопления. а - внутриклеточного антигена вируса Пуумала; б - вируса Пуумала в культуральной жидкости. Здесь и на рис. 2 стрелками показано заражение монослоя культуры лизатом клеток предыдущего вирусного пассажа. 6 Номер пассажа вируса Культура клеток -S3- Е-6 -A- Vero HD-4647 -<Н- 455 ПТ-1 -0-4184 Наиболее успешно штаммы обоих хантавирусов адаптировались к размножению в культуре Vero: через 3-5 пассажей максимальные титры вирусов Пуумала и Добрава соответствовали таковым в культуре Vero E6 и составили 5,9-6,2 lg ФОЕ/мл. Этот результат был исключительно важен с точки зрения перспективы использования культуры Vero в качестве продуцента вакцины. В серии опытов по влиянию множественности заражения (МЗ) на накопление внеклеточного вируса было показано, что при МЗ 5-10 ФОЕ/кл максимальный выход вирусов Пуумала и Добрава в КЖ приходится на 5-6-е сутки после заражения, при более низкой МЗ смещается на 2-3 сут, а при МЗ ниже 0,001 титр вируса уже не достигает максимальных показателей за весь период наблюдения (36 дней). При МЗ 0,1-1 ФОЕ/кл урожай вируса Пуумала с титром 5,48 ± 0,38-5,62 ± 0,72 lg ФОЕ/мл можно получать в результате ежедневных сливов КЖ с 6-х по 11-е сутки после заражения; максимальный титр вируса регистрируется на 7-8-е сутки (рис. 3). В культуре 4647, которая также получена из почки зеленой мартышки, после 2-3 пассажей как вируса Пуумала, так и Добрава, зараженность клеток соответствовала таковой в пермиссивной культуре, т. е. около 100%, однако титр вируса в культуральной жидкости на протяжении 8 последовательных Рис. 2. Динамика накопления внутриклеточного антигена вируса Добрава-Куркино - а; б - вируса Добрава-Куркино в культуральной жидкости. Сутки после заражения Рис. 3. Динамика накопления вируса Пуумала в КЖ клеток Vero при роллерном культивировании. Сборы КЖ с титром вируса > 5,0 lg ФОЕ/мл могут использоваться для производства цельновирионной инактивированной вакцины. пассажей оставался на 0,8-1,3 lg ФОЕ/мл ниже, чем в культуре Vero E6. Таким образом, отечественная культура клеток зеленой мартышки, сертифицированная для производства вакцин, оказалась менее чувствительной к размножению хантавирусов - возбудителей ГЛПС по сравнению с культурами Vero и Vero Е6. Еще более низкий уровень размножения вирусов Пуумала и Добрава отмечен в культуре клеток селезенки взрослой зеленой мартышки - 455. Максимальная зараженность клеток как вирусом Пуумала, так и Добрава не превысила 60%, а титр вируса не достигал 4 lg ФОЕ/мл через 8 пассажей в этой культуре. Следует отметить, что на 1-м пассаже обоих вирусов зараженными были лишь единичные клетки, тогда как в культуре 4647 уже на первом пассаже зараженность клеток составляла около 70%. На 2-м пассаже клеток селезенки зеленой мартышки - 455, инфицированных вирусами Пуумала и Добрава, антигенсодержащими были около 40-50% клеток, однако интенсивность свечения была слабой, вирус в культуральной жидкости не определялся. После заражения монослоя культуры 455 лизатом клеток с 40% содержанием антигена вируса Пуумала (4-й пассаж), зараженность клеток составила на 11-е сутки толь- ко10%, однако уже в следующем пассаже этих клеток антигенсодержащими были 60% с выходом вируса в КЖ с титром 2,3 lg ФОЕ/мл. В дальнейшем на 7-м и 8-м пассажах зараженность клеток не превысила 60%, а титр внеклеточного вируса - 3,2 lg ФОЕ/мл. Динамика накопления размножения вируса Добрава в культуре 455 характеризовалась колебанием количества антигенсодержащих клеток со 2-го по 8-й пассаж между 40-60%, при этом инфекционный вирус в КЖ определялся на последних двух пассажах с максимальным титром 3,6 lg ФОЕ/мл. В культуре клеток почки эмбриона овцы, 4184, оба хантавируса размножались слабо на протяжении 8 последовательных пассажей как инфицированной культуры, так и лизатов инфицированных клеток. Количество клеток, инфицированных вирусом Пуу- мала, не превышало 20%, вирусом Добрава - 40% со слабой интенсивностью свечения антигена; инфекционный вирус в КЖ оставался на неопределяемом уровне. В культуре клеток почки теленка, ПТ-1, максимальная зараженность вирусом Пуумала составила 45%, титр вируса в КЖ - около 2 lg ФОЕ/мл; максимальная зараженность вирусом Добрава составила 75%, титр вируса в КЖ - 2,3 lg ФОЕ/мл. В отличие от культуры 455 и, особенно, 4184, в клетках ПТ-1, инфицированных как вирусом Пуумала, так и До- брава (оба варианта), антиген интенсивно накапливался, что выражалось ярким гранулярным свечением в цитоплазме при исследовании МФА с гомологичными сыворотками. Способность культуры ПТ-1 интенсивно накапливать внутриклеточный антиген была использована для приготовления антигенных слайдов. Эти антигенные препараты были применены для выявления антихантавирусных флюоресцирующих антител при контроле специфической им- муногенной активности вакцинных препаратов. Использование клеток необезьяньего происхождения в качестве антигенного субстрата позволяет избежать неспецифических реакций, обусловленных иммунным ответом на возможное присутствие в вакцинном препарате белков цитоскелета (в данном случае субстратом вакцины являлись клетки Vero). Как было ранее показано на модели эндотелиальных клеток человека и подтверждено на модели эндотелиоцитов аорты теленка, патогенные ханта- вирусы используют для проникновения в клетку Ь3-интегрины [16, 17]. Последние присутствуют во всех клетках организма позвоночных животных, но обладают видовой специфичностью. Вероятно, b3- интегрины не всех животных способны связываться с хантавирусами ввиду их естественных отличий, что определяет видовой барьер распространения хантавирусных инфекций. Нами впервые показана возможность адаптации патогенных хантавиру- сов Пуумала и Добрава к размножению в клетках перевиваемых линий почки овцы и почки теленка. При высокой множественности заражения, обеспечивающего на 3-и сутки почти 100% зараженность пермиссивных клеток Vero Е6, зараженность клеток ПТ-1 и 4184 вирусом Пуумала была представлена единичными клетками к 14-му дню, вирусом Добра- ва - единичными клетками и 10% клеток соответственно. Несмотря на то, что общая зараженность клеток и выход инфекционного вируса в КЖ не достигли показателей пермиссивной культуры даже через 8 последовательных пассажей вируса, факт репликации этих вирусов в новой системе “хозяина” открывает возможности дальнейшего изучения вопросов, связанных с преодолением видового барьера, вирусной трансмиссии и экологии хантавирусов. Эти результаты косвенно подтверждают факт неоднородности хантавирусной популяции, наличия в ней “квазивидов”, способных узнавать и связываться с лигандами (Ь3-интегрины) другой видовой специфичности. Проведенные нами исследования демонстрируют большую консервативность вируса Пуумала сравнительно с вирусом Добрава при адаптации к размножению в другой клеточной культуре и подтверждают наши предыдущие наблюдения о том, что хантавирусы, эволюционно связанные с грызунами подсемейства Хомяковых (в том числе вирус Пуумала), менее эффективно выделяются в клеточных культурах по сравнению с вирусами, ассоциированными с грызунами подсемейства мышиных (Хантаан, Сеул и Добрава) [18]. Важным положительным результатом исследований явилась успешная репликация в культуре Vero штаммов вирусов Пуумала и Добрава: после 3-4 последовательных пассажей инфицированных клеток титр вируса в КЖ этой культуры соответствовал таковому в культуре Vero Е6. Известно, что патогенные хантавирусы подавляют экспрессию а-интерферона и MxA белка в первые 48 ч после инфекции [19], тем не менее, наличие в культурах Vero Е6 и Vero дефекта гена - индуктора а-интерферона [20], по-видимому, благоприятно сказывается на размножении патогенных хантавирусов в этих культурах. Данные динамики накопления вируса Пуумала в КЖ Vero при роллерном культивировании указывают на возможность ежедневных сборов КЖ в качестве вакцинного полуфабриката с 6-х по 11-е сутки. Заключение Впервые установлена возможность адаптации патогенных хантавирусов Пуумала и Добрава, изолированных в культуре клеток Vero Е6, к размножению в перевиваемых клетках почки овцы и почки теленка. Выявлена большая консервативность вируса Пу- умала сравнительно с вирусом Добрава при адаптации к размножению в клеточной культуре, отличной по хозяинному происхождению от Vero Е6, в которой штаммы этих вирусов были изолированы. Показано, что после 3-4 пассажей культура Vero поддерживает размножение хантавирусов Пуумала и Добрава на уровне пермиссивной клеточной культуры Vero Е6. Определены динамика накопления вирусов Пуумала и Добрава в культуре клеток Vero при различной множественности заражения и оптимальные сроки сбора вирусного урожая.

About the authors

G. A Malkin

M.P. Chumakov Institute of Poliomyelitis and Viral Encephalitides

Email: centrglps@rambler.ru
27@th km. of Kiev Highway, Leninsky District, Moscow Region, Russian Federation, 142782

T. K Dzagurova

M.P. Chumakov Institute of Poliomyelitis and Viral Encephalitides

Email: centrglps@rambler.ru
27@th km. of Kiev Highway, Leninsky District, Moscow Region, Russian Federation, 142782

N. A Korotina

M.P. Chumakov Institute of Poliomyelitis and Viral Encephalitides

Email: centrglps@rambler.ru
27@th km. of Kiev Highway, Leninsky District, Moscow Region, Russian Federation, 142782

M. V Balovneva

M.P. Chumakov Institute of Poliomyelitis and Viral Encephalitides

Email: centrglps@rambler.ru
27@th km. of Kiev Highway, Leninsky District, Moscow Region, Russian Federation, 142782

O. I Konyushko

M.P. Chumakov Institute of Poliomyelitis and Viral Encephalitides

Email: polcells@yandex.ru
27@th km. of Kiev Highway, Leninsky District, Moscow Region, Russian Federation, 142782

S. E Sotskova

M.P. Chumakov Institute of Poliomyelitis and Viral Encephalitides

Email: se-sotskova@mail.ru
27@th km. of Kiev Highway, Leninsky District, Moscow Region, Russian Federation, 142782

E. A Tkachenko

M.P. Chumakov Institute of Poliomyelitis and Viral Encephalitides

Email: evgeniytkach@mtu-net.ru
27@th km. of Kiev Highway, Leninsky District, Moscow Region, Russian Federation, 142782

References

Supplementary files