Hepatitis C in infection with recombinant strain RF2k/1b of the virus: clinical course and therapy

Full Text

Введение Вирус гепатита С (ВГС) вызывает острое и хроническое заболевание печени, последнее может стать причиной развития цирроза и гепатоклеточ-ной карциномы. Отсутствие профилактической вакцины, скрытое течение острого и начальных стадий хронического гепатита С (ХГС) в большинстве случаев приводят к тому, что для многих стран мира, в том числе и для нашей, эпидемиологическая ситуация с ХГС остается сложной [1]. ВГС - представитель семейства Flaviviridae рода Hepacivirus. Отличительной генетической особенностью этого вируса является высокая изменчивость генома. Причиной такой изменчивости является отсутствие у вирусной РНК-зависимой РНК-полимеразы механизма исправления ошибок во вновь синтезируемой цепи РНК. Из-за этого в организме инфицированного человека ВГС представлен набором близкородственных генетических вариантов, которые меняются с течением времени: одни Для корреспонденции: Николаева Людмила Ивановна, доктор биол. наук, руководитель лаб. генно-инженерных препаратов, e-mail: L.i.nikolaeva@mail.ru варианты удаляются иммунной системой, когда на них сформирован эффективный Т- и В-клеточный ответ, другие - возникают. В основу современной классификации изолятов ВГС положен филогенетический анализ областей генома core/E1 и NS5B, по структуре которых недавно выделено 7 генотипов и 67 субтипов [2]. В нашей стране наибольшее распространение получили вирусы генотипов 1, 2 и 3. Считается, что пациенты, инфицированные вирусом 1-го генотипа, реже достигают устойчивого вирусологического ответа (УВО) на терапию пегилированным интерфероном-а2 (пегИФН-а2) и рибавирином, чем больные с вирусом 2-го и 3-го генотипов [3]. Однако, как показано недавно, пациенты, инфицированные вирусом 3-го генотипа, имеют более высокий риск агрессивного течения хронического гепатита и рецидива после терапии [4]. Впервые в мире в 2002 г. в Санкт-Петербурге группа исследователей, анализируя вирус, выделенный из крови инфицированных потребителей инъекционных наркотиков (ПИН), обнаружила естественный межгенотипный рекомбинант RF2k/1b [2, 5]. Возникновение этого рекомбинанта связывают с распростра 9 ЭПИДЕМИОЛОГИЯ И ИНФЕКЦИОННЫЕ БОЛЕЗНИ, № 3, 2014 нением гемотрансфузии и формированием банков крови в нашей стране в начале ХХ века. По молекулярно-генетическим данным, рекомбинант возник в период между 20-ми и 50-ми годами [6]. Затем во второй половине ХХ века он проник в среду ПИН, и это, очевидно, интенсифицировало его распространение. В последнее время межгенотипный рекомбинант RF2k/1b был обнаружен в разных странах Европы и Азии [6]. К настоящему времени установлено существование и других межгенотипных рекомбинантов ВГС: RF2i/6p, RF2b/1b_1, RF2/5, RF2b/6w, RF2b/1b_2, RF2b/1a, RF2b/1b_3, RF2b/1b_4 [2]. Порядок расположения зон вирусных полипептидов в РНК рекомбинантной формы RF2k/1b не изменен [2, 5]. Но часть вирусного генома от 5'-не-транслируемой области (НТО) до точки рекомбинации, которая расположена в зоне NS2, относится к субтипу 2k, а далее от места рекомбинации, включая зоны всех неструктурных белков, до 3 '-НТО к субтипу 1b. Такой рекомбинантный ВГС с фрагментами генома разных генотипов ставит клинически сложный вопрос, как расценивать и лечить инфицированного им больного: как пациента с вирусом генотипа 2 или 1. В печати имеются единичные публикации, касающиеся аспектов распространения межгено-типного рекомбинанта RF2k/1b в Московском регионе, а также чувствительности его к стандартной двойной терапии [7, 8]. Ранее в модельных экспериментах на химерных мышах, содержащих человеческие гепатоциты, была показана стандартная чувствительность рекомбинантной формы RF2k/1b к комбинированной терапии ИФН-а2 и рибавири-ном [9]. До настоящего времени мало сведений об особенностях течения гепатита у пациентов, инфицированных этой рекомбинантной формой вируса, о скорости развития фиброза печени у них и эффективности антивирусной терапии. Цель данного исследования - клинический анализ особенностей течения хронического гепатита С у пациентов, инфицированных рекомбинантом RF2k/1b, и оценка эффективности стандартной двойной терапии у этих больных. Материалы и методы Группы пациентов были сформированы из больных с хроническим гепатитом С, наблюдавшихся на кафедре инфекционных болезней ГБОУ ДПО РМАПО и на кафедре инфекционных болезней у детей № 1 педиатрического факультета ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова в Москве в период с 2010 по 2013 г. Факторы риска инфицирования больных устанавливались путем опроса по стандартному протоколу каждого из исследовательских центров. От всех пациентов было получено информированное согласие на участие в исследовании. РНК ВГС выявляли методом ОТ-ПЦР (обратная транскрипция и полимеразная цепная реакция), как описано ранее [10]. Генотипирование и определение межгенотипной рекомбинации выполняли секвенированием областей вирусного генома 5'-NTR-core и NS5B, которые были сопоставлены с референс-ными нуклеотидными последовательностями из базы данных GenBank NCBI (США). Вирусную нагрузку определяли с помощью коммерческих тест-систем «ОТ-гепатоген-С-количественный» («ДНК-технология», Россия) и «РеалБест РНК ВГС» («Вектор-Бест», Россия). Серологические маркеры ВГС-инфекции - антитела к суммарным и раздельным антигенам - выявляли методом твердофазного иммуноферментного анализа, используя коммерческие тест-системы Ре-комбиБест анти-ВГС-IgM и Бест анти-ВГС-спектр («Вектор-Бест», Россия). Титрование сывороток крови выполняли по методике, описанной ранее [11]. Стадии фиброза печени определяли методом кратковременной эластографии печени или с помощью фибротеста по протоколу производителя. Эла-стографию печени проводили, используя аппарат фиброскан («Echosense», Франция). Стадии фиброза оценивали по системе METAVIR. Скорость развития фиброза печени оценивали в фибротических единицах в год (ФЕ/г) как частное от деления стадии фиброза печени на длительность ХГС, что было предложено Т. Poynard и соавт. [12]. Однонуклеодитный полиморфизм (ОНП) гена IL28B по полиморфным локусам rs8099915 и rs12979860 определяли методом ПЦР в реальном времени с помощью тест-системы Иммуногенетика IL28B («ДНК-Технология», Россия), предварительно выделив ДНК пациента экспресс-методом, используя набор реактивов Проба-рапид-генетика («ДНК-Технология», Россия). Условия ПЦР соответствовали инструкции производителя. Больным ХГС, инфицированным рекомбинантной формой RF2k/1b ВГС, была проведена стандартная двойная интерферонотерапия. Оценка эффективности терапии проводилась согласно рекомендациям EASL-2011. Дозировка пегилированного ИФН-а2 и рибавирина подбиралась в соответствии с весовыми характеристиками больных. Результаты и обсуждение Анализируемая группа пациентов, инфицированных рекомбинантом RF2k/1b За время наблюдения было выявлено 6 пациентов, инфицированных рекомбинантным вариантом ВГС RF2k/1b. Возраст инфицированных от 10 до 48 лет (табл. 1). Гендерное соотношение 1:1. Пять больных относились к возрастной группе взрослых и один пациент - ребенок 10 лет. Все взрослые пациенты были инфицированы в возрасте до 40 лет. В момент обращения в клинику все больные имели хроническую форму заболевания. Средняя продолжительность гепатита до постановки диагноза составила 11,3 ± 2,2 года без учета ребенка, инфицированного перинатально (пациент № 6). Двое пациентов из 5 взрослых больных имели высокий риск заражения при внутривенном введении психоактивных веществ. 10 Таблица 1 Клинико-анамнестические данные пациентов, инфицированных рекомбинантом RF2k/1b Пациент, № Возраст при постановке диагноза, годы Пол Фактор риска Длительность болезни, годы Возраст при инфицировании, годы 1 25 М ПИН 9 16 2 48 М Не установлен 15 33 3 40 М ПИН 18 22 4 42 Ж Не установлен 13 29 5 40 Ж Хирургические операции 2 38 6 10 Ж Перинатально 10 0 (При рождении) Средний возраст при постановке диагноза в группе взрослых больных составил 39,0 ± 3,8 года. Данные обследования пациентов перед началом лечения представлены в табл. 2. Стандартная комбинированная интерфероноте-рапия не проводилась у одной пациентки № 6 (ребенок). У нее была обнаружена выраженная виремия при очень слабом гуморальном ответе на антигены ВГС. Перед назначением терапии все взрослые пациенты, кроме одной больной (№ 4), имели умеренную биохимическую активность. Средний показатель активностей АЛТ и АСТ в группе этих пациентов составил 3,13 ± 0,53 и 2,31 ± 1,18 относительно верхней границы нормы. Аллельные варианты по полиморфным локусам гена IL28B были неблагоприятными только у одной пациентки № 4. У половины больных локус rs12979860 гена IL28B имел благоприятный для достижения УВО вариант С/С. В этой группе пациентов доминировали стадии фиброза печени F2 и F3, которые в сумме составили 83,3%. Средняя скорость развития фиброза печени в группе составила 0,25 ± 0,05 ФЕ/г. Средняя вирусная нагрузка в группе имела значение 4,26 • 106 МЕ/мл. Только у одной пациентки №4 был выявлен неблагоприятный серологический маркер - высокие титры анти-ВГС IgM, что обычно сочетается с неуспехом в терапии [13]. Средний геометрический титр анти-ВГС IgM составил 1:17, а IgG к белкам core, NS3, NS4AB и NS5A - 1:2089, 1:532, 1:131 и 1:138 соответственно. Проведенные наблюдения за пациентами во время терапии показали, что 4 пациента из 5 оказались неответчиками. Только 1 участница достигла снача ла быстрого вирусологического ответа, а впоследствии и УВО. Через несколько лет после неудачного завершения терапии у 2 пациентов (№ 2 и 3) был выявлен цирроз печени. Средний временной показатель от инфицирования до развития цирроза печени составил 16,5 ± 1,5 года. Группа сравнения - пациенты, инфицированные ВГС субтипа 1b Группу сравнения (ГС) сформировали из 42 пациентов, которые были инфицированы вирусом субтипа 1b. Пациентов, инфицированных вирусом субтипа 2k, за все время наблюдения не было выявлено. Средний возрастной показатель в ГС сравнения достиг 35,6 ± 2,1 года, доля мужчин (64,3%) была выше, чем доля женщин (35,7%). Ниже приведены клинико-анамнестические данные с учетом результата терапии (табл. 3). Сопоставление данных ГС и анализируемой группы пациентов, инфицированных рекомбинантной формой RF2k/1b, показало, что по возрасту, когда проводилась терапия, и по длительности заболевания анализируемая группа близка к группе больных, инфицированных субтипом 1b и не достигших УВО. Анализируемая группа пациентов, инфицированная рекомбинантом, имела сходство по активностям АЛТ и АСТ и по вирусной нагрузке с группой, инфицированной субтипом 1b и достигшей УВО, по стадии фиброза печени была близка к группе без УВО (табл. 4). Статистически значимых различий между всеми группами по ОНП гена IL28B не выявлено. В гуморальном ответе выявлено сходство с Таблица 2 Данные обследования пациентов, инфицированных рекомбинантной формой RF2k/1b, перед началом терапии Пациент, № АЛТ/АСТ* ОНП гена IL28B Стадия фиброза Вирусная нагрузка, МЕ/мл Анти-ВГС IgM** Анти-core IgG Анти-^3 IgG Анти-^4аЬ IgG Анти-^5а IgG 1 3,1/3,0 C/Т, Т/Т F3 2, 3 0 0 1:1024 1:512 1:256 1:256 2 1,75/1,0 C/C, Т/G F3 1,7 • 105 1:16 1:4096 1:2048 1:1024 1:512 3 3,2/2,73 C/C, Т/Т F3 7, 6 0 1:16 1:1024 1:1024 1:512 1:1024 4 5,56/4,08 Т /Т, G /G F 2 1,3 • 107 1:64 1:4096 1:1024 1:64 1:512 5 2,85/1,84 C/Т, Т/Т F1 2, 4 05 0 1:4096 1:128 1:8 1:8 6 2,32/1,2 C/C, Т/Т F1-2 2,27 • 106 0 0 1:8 0 0 Примечание. * - активности АЛТ и АСТ представлены как кратное от верхней границы нормы. ** - приведены титры антител. 11 ЭПИДЕМИОЛОГИЯ И ИНФЕКЦИОННЫЕ БОЛЕЗНИ, № 3, 2014 Таблица 3 Клинико-анамнестические данные пациентов, инфицированных вирусом субтипа 1b, с учетом ответа на терапию Ответ на терапию Возраст терапии, годы Гендерный состав Основные факторы риска Длительность болезни, годы Есть УВО 33,7 ± 1,3 М - 76,2%, Ж - 23,8% ПИН - 38,1%, Неизвестен - 33,4% 6,62 ± 0,6 Нет УВО 37,6 ± 2,8 М - 37,6%, Ж - 47,6% Неизвестен - 38,1%, ПИН - 23,8% 9,40 ± 0,9 группой с УВО по титрам анти-core IgG, но по титрам анти-ВГС IgM и по титрам иммуноглобулинов G ко всем неструктурным белкам - с группой пациентов, инфицированных вирусом субтипа 1b и не достигших УВО. Течение и эффективность терапии у пациентов с ХГС при инфицировании вирусом субтипа 1b изучается давно и во многих странах, поскольку он широко распространен [3, 19]. С этим субтипом связывают более быстрое поражение печени и меньшую вероятность достижения УВО при двойной противовирусной терапии. Среди больных ХГС в цирротической стадии доминируют пациенты, инфицированные вирусом субтипа 1b, что может быть связано с его преобладанием относительно других субтипов и/или с его свойствами [12-15]. Данных в международной печати об особенностях течения ХГС у пациентов, инфицированных вирусом субтипа 2k, нет. Известно, что этот субтип выявляется на территории Азербайджана и Молдавии, откуда он был выделен впервые [16]. Для вируса 2-го генотипа показана высокая чувствительность к пегИФН-а2 и рибавирину [3, 8, 17]. При ХГС развитие клинически значимых проявлений гепатита часто наступает поздно. Поэтому время от инфицирования до постановки диагноза может достигать, по данным разных авторов, от 10 до 38 лет [18, 19]. В нашем исследовании оно составило 11,3 года. Однако большинство пациентов уже имели фиброз печени в стадии F2-3. Cкорость развития фиброза в нашем исследовании составила 0,25 ФЕ/г. Для сравнения: низкой скорости развития фиброза соответствуют показатели менее 0,08 ФЕ/г, умеренной - 0,13-19 ФЕ/г, а высокой - более 0,20 [12, 20]. Таким образом, наши пациенты, попадают в группу с высокой скоростью развития фиброза печени. Однако небольшая выборка пациентов позволяет только предположить высокую скорость фиброзирования печени у наших больных, инфицированных рекомбинантным вариантом вируса RF2k/1b. Известно, что скорость развития фиброза является нелинейным параметром и зависит от возраста больного. Если инфицирование пациента произошло после 45 лет, то скорость может быть более высокой, особенно после стадии F2 [21]. В нашем исследовании 5 из 6 пациентов были инфицированы ВГС в возрасте до 40 лет и 1 - в детском возрасте. Таким образом, зрелый возраст как фактор, с которым ассоциируется более быстрое развитие фиброза печени, в нашем исследовании надо исключить. Пациенты, инфицированные рекомбинантым вариантом ВГС RF2k/1b, имели умеренную биохимическую активность гепатита - 2-3-кратное превышение нормальных значений активности АЛТ и АСТ. По этим показателям они были похожи на пациентов, инфицированных ВГС субтипа 1b. Повышенные активности трансаминаз свидетельствуют о разрушении мембран гепатоцитов и/или их гибели. Не существует прямой зависимости между значениями АЛТ и АСТ и степенью поражения печени: при низких и даже при нормальных показателях трансаминаз фиброз печени также прогрессирует, хотя и медленнее [22]. Вирусная нагрузка, которая отражает репликативную активность вируса, у пациентов, инфицированных рекомбинантной формой ВГС, соответствовала таковой в группе больных, инфицированных субтипом 1b и достигших УВО. Однако она была на порядок меньше, чем у пациентов с вирусом 1b и не достигших УВО. Вероятно, для этой рекомбинантной формы вируса нехарактерна высокая репликативная активность. Важный иммуногенетический фактор больного, который ассоциирован с достижением УВО, - это полиморфизм гена IL28B. У половины пациентов, инфицированных рекомбинантной формой, он имел благоприятный аллельный вариант C/C по локусу rs12979860. Поэтому генетический фактор пациентов по полиморфному гену IL28B надо исключить как ведущий компонент, обеспечивающий неэффек Таблица 4 Данные обследования пациентов, инфицированных вирусом субтипа 1b, с учетом результата терапии Группа АЛТ/АСТ* ОНП гена IL28B, % Стадия фиброза, % Вирусная нагрузка, МЕ/мл Анти-ВГС IgM** Анти-core IgG Анти-NS3 IgG Анти-NS4ab IgG Анти-NS5a IgG УВО 3,15 ± 0,49/ 2,34 ± 0,56 C/C - 61,9 C/T - 38,1 Т/Т - 0 F3 - 0 F1/2 - 39,5 F0 - 60,5 3,63 • 106 1:4 1:2253 1:66 1:134 1:69 Без УВО 2,75 ± 0,24/ 2,00 ± 0,33 C/C - 38,1 C/T - 38,1 Т/Т - 23,8 F3 - 50 F2 - 33,3 F1 - 16,7 8,16 • 107 1:16 1:4174 1:262 1:261 1:129 Примечание. * - данные представлены как превышение верхней границы нормы; ** - указан средний геометрический титр для антител ко всем антигенам. 12 тивность двойной терапии у наших больных, инфицированных рекомбинантом RF2k/1b. Специфический В-клеточный иммунный ответ (гуморальный иммунитет) у пациентов, инфицированных рекомбинантной формой, был близок по титрам анти-core IgG к больным, инфицированным вирусом субтипа 1b и достигшим УВО. Нуклеокап-сидный (core) белок в рекомбинантной форме представлен core-протеином субтипа 2k. В-клеточный ответ в виде иммуноглобулинов G к неструктурным белкам, которые соответствовали протеинам субтипа 1b, по титрам приближался к значениям, обнаруженным в группе пациентов, инфицированных вирусом субтипа 1b и не достигших УВО. Среднее значение титров анти-ВГС IgM в группе пациентов, инфицированных RF2k/1b, практически соответствовало аналогичному показателю в группе больных, инфицированных субтипом 1b и не достигших УВО. Очевидны различия в В-клеточном ответе на структурный core-протеин и неструктурные белки в случае рекомбинантной формы. Наиболее эффективным способом, препятствующим прогрессированию ХГС в цирроз печени, является стандартная противовирусная терапия. В литературе имеются единичные работы, касающиеся чувствительности рекомбинанта RF2k/1b к стандартной терапии пегИФН-а и рибавирином [9, 23]. В одной публикации, где у пациента были обнаружены как субтип 3 а, так и рекомбинантная форма RF2k/1b, после стандартной двойной интер-феронотерапии перестала выявляться вирусная РНК субтипа 3а, но рекомбинантая - определялась [23]. Этот случай свидетельствует в пользу плохой чувствительности рекомбинанта RF2k/1b к стандартной двойной интерферонотерапии. В нашем исследовании только одной пациентке удалось достичь УВО. Вероятно, это связано с небольшой длительностью заболевания, стадией фиброза F1 и женским полом больной. Отсутствие УВО у большинства пациентов может быть связано, с одной стороны, с возрастом на момент терапии, продвинутой стадией фиброза печени и умеренной биохимической активностью, а с другой - с особенностями рекомбинантного варианта вируса. Принадлежность неструктурной части генома рекомбинанта RF2k/1b к субтипу 1b позволяет дискутировать на тему эффективности лечения. Во-первых, известно, что пациенты, инфицированные 1-м генотипом ВГС, хуже отвечают на стандартную двойную интерферонотерапию и им рекомендовано более длительное лечение, чем пациентам, инфицированным 2-м или 3-м генотипом. Во-вторых, для больных, инфицированных 1-м генотипом ВГС, разработана новая схема лечения с использованием ингибиторов сериновой протеазы NS3/4А - телапривира и боцепривира. Учитывая, что в рекомбинантном варианте вируса сериновая протеаза по структуре относится к 1-му генотипу, возможно применение ингибиторов протеазы NS3/4. Очевидно, такая тройная терапия приведет к увеличению частоты достижения УВО. Следует ли перед назначением стандартной двойной терапии рассматривать больных с рекомбинантом RF2k/1b как пациентов, инфицированных 1-м генотипом ВГС? Вероятно, да. В наших исследованиях и в работе V. Morel и соавт. [23] больные, инфицированные рекомбинантной формой RF2k/1b ВГС, имели высокую скорость развития фиброза печени и чаще не отвечали на двойную интерферонотерапию за единичным исключением. В последнее время коммерческие диагностические лаборатории стали предлагать типирование ВГС путем определения только генотипа, не проводя детализации до субтипов. Считается, что в алгоритме обследования с целью выбора эффективной схемы лечения будет достаточно дифференцировать пациентов, инфицированных 1-м генотипом ВГС, от больных, инфицированных другими генотипами. Однако не исключено, что в таких случаях, неудачи в терапии пациентов, инфицированных 2-м генотипом ВГС, могут быть связаны с наличием у них рекомбинантой формы RF2k/1b. В связи с этим целесообразно в клинической практике проводить субтипирование ВГС, если пациент инфицирован вирусом 2-го генотипа. Выводы 1. Получены данные, свидетельствующие в пользу высокого риска быстрого развития фиброза печени у пациентов, инфицированных рекомбинантным вариантом 2k/1b ВГС. 2. Обнаружено, что для таких пациентов свойственна умеренная биохимическая активность гепатита и умеренно высокая вирусная нагрузка. 3. Стандартная двойная интерферонотерапия для таких пациентов в нашем исследовании была малоэффективна.

About the authors

L. I Nikolaeva

D.I. Ivanovsky Institute of Virology

Email: L.i.nikolaeva@mail.ru

G. V Sapronov

Russian Medical Academy of Postgraduate Education

Email: geo8@inbox.ru

A. V Kolotvin

D.I. Ivanovsky Institute of Virology; M.V Lomonosov Moscow State University

Email: protey8484@mail.ru

E. I Samokhvalov

D.I. Ivanovsky Institute of Virology

Email: e_samokh@hotmail.com

E. A Leybman

D.I. Ivanovsky Institute of Virology

Email: dr.leybman@gmail.com

L. M Samokhodskaya

N.I. Pirogov Russian National Medical University of the Ministry of Health of the Russian Federation

Email: slm@fbm.msu.ru

References

Supplementary files