TO THE QUESTION OF THE EVOLUTION OF BACILLUS ANTHRACIS MICROBE

Full Text

Возбудитель сибирской язвы (антракса) Bacillus anthracis привлекает внимание огромного количества исследователей во многих странах мира. Одна из причин этого - ведущая роль сибиреязвенного микроба как потенциального агента биотерроризма [1, 2]. Заболевания сибирской язвой в США в 2001 г., связанные с отправленными по почте конвертами, заполненными сухим порошком спор вирулентного штамма B. anthracis Ames, явились причиной смерти 5 из 11 человек с ингаляционной формой сибирской язвы [1]. Эти события еще более усилили интерес к изучению вопросов диагностики, лечения, профилактики сибирской язвы, а также характеристике факторов вирулентности B. anthracis. B. anthracis - единственный облигатный патоген человека и травоядных млекопитающих в группе близкородственных бацилл, именуемой B. cereus sensu lato (в широком смысле) [3, 4]. Кроме того, Для корреспонденции: Липницкий Анатолий Васильевич, доктор мед. наук, проф., гл. науч. сотр. лаб. сибирской язвы ФКУЗ Волгоградский научно-исследовательский институт Роспотребнадзора, e-mail: lipnitskii@list.ru в эту группу входят B. cereus sensu stricto (в узком смысле): B. thuringiensis, B. mycoides, B. pseudomy-coides и B. weihenstephanensis. B. cereus - почвенный сапрофит, однако отдельные его штаммы вызывают пищевые отравления с симптомами рвоты и диареи [5-8]. Многие штаммы B. thuringiensis содержат па-распоральные кристаллические белки, токсичные для насекомых и некоторых видов беспозвоночных [9, 10]. B. mycoides и B. pseudomycoides - непатогенные сапрофиты, образующие колонии у корней растений [11]. Штаммы B. weihenstephanensis, обитающие в почве, физиологически приспособлены к низким температурам окружающей среды [12]. По мнению некоторых ученых, все виды бацилл, входящие в группу B. cereus s.l., по существу представляют один вид в связи с незначительными генетическими отличиями по данным анализа полиморфизма 16S - 23 S рРНК генах [13], multilocus sequence typing (MLST) - мультилокусного сиквенс-типирования [14] и высокой степени общности состава генов [15]. Молекулярно-генетические исследования подтвердили данные о том, что виды, входящие в группу B. cereus, составляют три клада [14, 16, 17]. Первый включает все изученные штаммы B. anthracis и часть штаммов B. cereus. Осталь 49 ЭПИДЕМИОЛОГИЯ И ИНФЕКЦИОННЫЕ БОЛЕЗНИ, № 5, 2013 ные штаммы B. cereus и большинство штаммов B. thuringiensis включены во второй клад. Клад 3-й составляют штаммы B. mycoides, B. pseudomycoides и B. weihenstephanensis. Они обозначены как кластеры C, Т и W [18]. Didelot и соавт. [19] попытались реконструировать эволюционную историю штаммов группы B. cereus. С помощью MLST было исследовано 667 штаммов бацилл, вызывающих различные заболевания. 155 штаммов, патогенных для человека, разделены на 6 групп: 31 штамм - B. anthracis; 29 штаммов, вызывали эндокардит, нейтропению и лихорадку; 22 - диарею; 15 - другие поражения желудочно-кишечного тракта с симптомами тошноты и рвоты; 14 - пневмонию и другие поражения легких; 44 - раневые инфекции, включая штаммы, выделенные при ожогах, укусах насекомых и послеоперационных осложнениях. Авторы подтвердили существование трех основных кладов в группе B. cereus, принадлежность B. anthracis к первому кладу и распределение штаммов B. cereus между первым и вторым кладами. При этом, хотя авторы и сделали заключение о существовании некоторых барьеров в обмене генетической информации («генного потока») между кладами, однако не выявлено отличий в характеристике рекомбинационных процессов между патогенными и сапрофитическими штаммами B. cereus s.l. Классическая схема исторической эволюции возбудителя сибирской язвы, обусловившая его вирулентность для людей и большинства травоядных млекопитающих, включает два этапа [3]. На первом этапе произошло отделение в группу B. cereus ряда близкородственных видов бацилл от огромного большинства бацилл, обитающих в почве, на втором - отделение B. anthracis от остальных членов группы B. cereus путем приобретения детерминант основных факторов вирулентности - плазмид рХО1 и рХО2, кодирующих соответственно трехкомпонентный токсин и капсулообразование, а также некоторых хромосомных мутаций [20]. Как известно, основной «образ жизни» сибиреязвенного микроба определяется длительным существованием в окружающей среде в виде покоящихся спор и альтернативным коротким периодом пребывания в организме млекопитающих проросших из спор вегетативных клеток, репликация которых при инфицировании составляет 20-40 генераций [20, 21]. Таков средний период нахождения в организме B. anthracis от момента инфицирования до гибели или выздоровления. После этого сибиреязвенный микроб вновь возвращается в состояние «покоя». Из этого следует, что генетическая эволюция B. an-thracis ограничена короткими периодами существования микроорганизма в вегетативной форме. Как полагают, в связи с этим B. anthracis эволюционирует очень медленно по сравнению с большинством других видов бактерий с подобными периодами генераций, и поэтому он генетически и фенотипически высоко гомогенен [15, 22]. На основе canonical Single nucleotide polymorphism (canSNP) - канонических единичных полиморфизмов и Multiple Loci Variable Number of Tandem Repeats Analysis (MLVA) - мультилокусного анализа количества вариабельных тандемных повторов Pilo, Frey [20] показали возможность создания молекулярно-эпидемиологической модели для определения возраста диверсификации в эволюции B. anthracis и глобального распределения этого патогена. Последнее было в основном связано с мировым движением домашнего рогатого скота вместе с переселенцами, международной торговлей конта-минированными возбудителем сибирской язвы продуктами животноводства. Несмотря на очевидные достижения в расшифровке эволюционного развития B. anthracis, участившиеся в последнее десятилетие проявления «антраксоподобных» заболеваний людей и животных, вызванные вирулентными штаммами B. cereus s. s. (в некоторых случаях и B. thuringiensis [23, 24], а не «классическими» штаммами B. anthracis, поставили вопрос о закономерностях и причинах этого явления, а также определили необходимость детального молекулярно-генетического изучения подобных штаммов. В 1994 г. в штате Луизиана, США от сварщика, заболевшего тяжелой пневмонией, был выделен штамм B. cereus G9241. В октябре и ноябре 2003 г. с разницей в три недели в двух разных местах штата Техас были описаны два смертельных случая заболевания рабочих, связанных с обработкой металла, напоминающие клинически ингаляционную форму сибирской язвы. В первом случае из культуры крови был выделен штамм B. cereus 03ВВ102, а из образцов с рабочего места - B. cereus 03ВВ108. Во втором случае из крови был изолирован штамм B. cereus 03ВВ87. Прежде всего следует отметить, что никакой эпидемиологической связи между случаями заболеваний в Техасе и случаем в Луизиане не выявлено. Тем не менее один из штаммов, выделенных в Техасе (03ВВ87), был почти неотличим от штамма B. cereus G9241, изолированного в 1994 г. в Луизиане. Единственное различие было связано со степенью экспрессии генов капсулы. Штаммы B. cereus, выделенные в Техасе, исследовались с помощью Amplified fragment length polymorphism (AFLP) (анализ полиморфизма длин амплификационных фрагментов) и MLST, который был основан на сек-венировании семи «housekeeping» генов (glpF, gmk, ilvD, pta, pur, pycA, tpi). Штаммы B. œreus 03BB102 и 03BB108 были похожи, но отличались друг от друга по генетическому профилю плазмиды рХО1, а также по морфологии колоний. B. œreus 03BB108 не происходит от B. сєгєш 03BB102 в результате простой потери плазмидной ДНК. Дальнейшее сравнение B. œreus 03BB102 и 03BB108 с другими штаммами B. anthracis, B. œreus и В. thuringiensis показало, что, они филогенетически более схожи с B. anthracis, чем с B. cereus 03BB87 и G9241. Они также тесно 50 связаны с двумя другими патогенными Bacillus (B. thuringiensis 97-27 и B. cereus E33L) и двумя токси-генными изолятами B. cereus (D17 и 3а). Штаммы B. cereus 03BB87 и G9241отнесены к сиквенс-типу 78, B. œreus 03BB102 и 03BB108 - 11, все штаммы - к кладу 1 [25-27]. Oh и соавт. [28] при секвенировании штамма B. cereus G9241 также выявили две плазмиды вирулентности, близкие к рХО1 и рХО2. Плазмида рВСХО1 кодировала pagA1-гомолог протективного антигена B. anthracis и hasACB, обеспечивающий образование капсулы из гиалуроновой кислоты. Плазмида рВС218 контролировала bpsx-n - экзополисахарид B. cereus, формирующий вторую капсулу. При антраксоподобном заболевании, вызванном штаммом B. cereus G9241, происходило образование обеих капсул, которые вместе, по-видимому, играли существенную роль в патогенезе заболевания людей. Однако, по данным Wilson и соавт. [29], штамм B. cereus G9241 был авирулентным для кроликов после подкожного заражения и в 100 раз менее вирулентным, чем референтный штамм B. anthracis Ames, после аэрозольного заражения. Для мышей нескольких линий LD50 этого штамма была значительно выше, чем для B. anthracis Ames, и близка к таковой токсигенного бескапсульного вакцинного штамма B. anthracis Sterne. В 2001-2002 гг. от 6 шимпанзе и горилл в Западной Африке (Камерун) и от 6 диких шимпанзе, скоропостижно умерших в национальном парке Тан в Кот-д’Ивуар с симптомами сибирской язвы, также выделены штаммы B. cereus, содержащие обе плазмиды вирулентности B. anthracis рХО1 и рХО2 [3032]. В последующем они подверглись детальному молекулярно-генетическому исследованию. Было проведено полное секвенирование генома одного из этих штаммов, изолированного от шимпанзе «Лео» (CI) [33]. В отличие от классических штаммов B. anthracis, штамм CI оказался подвижным, у него отсутствовали 4 профага и не выявлялась нонсенс-мутация. Были идентифицированы четыре реплико-на - хромосома и три плазмиды. Сравнительный геномный анализ показал, что его хромосома напоминает таковую других видов группы B. cereus, но не B. anthracis, тогда как две плазмиды были идентичны плазмидам вирулентности B. anthracis рХО 1 и рХО2. Функция впервые обнаруженной третьей плазмиды с длиной 14 т.п.н. пока остается неизвестной. Сравнение геномных локусов, кодирующих ключевые функции, подтвердила более тесную близость этого штамма со штаммом B. thuringiensis 97-27, серовар konkukian и B. cereus E33L, чем со штаммами B. anthracis. Эти два штамма были выбраны для сравнительного анализа в связи с тем, что они проявляют вирулентность и по данным MLST [14, 16, 34] тесно связаны c B. anthracis: штамм B. thuringiensis 97-27 был изолирован от человека с тяжелым некрозом ткани, а B. cereus E33L - от зебры, предположительно умершей от сибирской язвы, хотя этот диагноз в последующем не подтвержден. Авторы впервые показали, что штамм CI, вызывающий заболевание, напоминающее сибирскую язву, не принадлежит по генетической структуре к монофильной группе штаммов B. anthracis. Они предположили, что он эволюционировал из штамма B. cereus независимо от классических штаммов B. anthracis, сохранив черты B. cereus, но приобрел новый «образ жизни», характерный для возбудителя сибирской язвы. Поэтому было предложено именовать этот штамм как «B. cereus variety (var) anthracis». Однако открытие «странных» сибиреязвенных штаммов продолжалось. Оказалось, что они являются причиной вспышек смертельной болезни и выделяются не только от обезьян, но и от крупного рогатого скота, в частности в Камеруне. Pilo и соавт. [35], анализируя один из таких штаммов (JF3964), указали на то, что филогенетически он проявляет себя как B. cereus - резистентен к специфическому для B. anthracis у-фагу и пенициллину. В то же время в отличие от B. cereus он не проявлял гемолитическую активность. Хромосомные маркеры, используемые как диагностические при идентификации сибиреязвенного микробам - sap и Ва 813 у этого штамма отсутствовали. Однако он содержал гены вирулентности, обусловленные плазмидами B. anthracis рХО1 и рХО2. Наличие обеих плазмид было подтверждено их экстракцией из штамма вместе с выделением их из типичного штамма B. anthracis Vollum. В упомянутой работе генетическая характеристика штаммов, выделенных в Камеруне во время вспышек сибирской язвы среди крупного рогатого скота, проводилась с помощью canSNP, который признан эволюционно стабильным и наилучшим для оценки филогенетических взаимоотношений B. anthracis, а также MLVA - самого точного метода субтипирования штаммов сибиреязвенного микроба. Авторы показали, что штаммы B. anthracis, изолированные от крупного рогатого скота в Западной и Центральной Африке, принадлежат к филогенетической группе Аß, которая ранее не выявлялась вне этой зоны. Более того, они сделали заключение, что в этом регионе присутствует субтип B. anthra-cis, принадлежащий к новому кладу (D), имеющий тесное родство с B. cereus и вызывающий симптомы антракса у крупного рогатого скота, как и у приматов Западной и Центральной Африки. Несмотря на наличие ограниченного количества штаммов из группы B. cereus, вызывающих антраксоподобные заболевания человека и животных, появление новых штаммов с подобными свойствами кажется вполне реальным. В частности, известно, что плазмиды рХО1, рХО2 или со сходной генетической структурой обнаружены и у других видов рода Bacillus - отдаленных родственников сибиреязвенного микроба. Так, капсульный оперон плазмиды рХО2 B. anthracis был выявлен в составе крупных плазмид у двух первично не идентифицированных штаммов бацилл, выделенных из внешней среды. 51 ЭПИДЕМИОЛОГИЯ И ИНФЕКЦИОННЫЕ БОЛЕЗНИ, № 5, 2013 Один из них в дальнейшем был идентифицирован как B. circulans, второй - не принадлежит ни к одному из известных видов бацилл, но более тесно связан с B. luciferensis [36]. Таким образом, впервые крупные плазмиды с генами вирулентности B. anthracis идентифицированы у видов бацилл, не входящих в группу B. cereus. Однако по данным рестрикционного анализа плазмида B. circulans (ŒD118) отличалась от «классической» плазмиды рХО2. Плазмида, обнаруженная в другом штамме ^BD!^), также имела сходство с рХО2. Тем не менее у обоих штаммов, несмотря на наличие плазмиды, экспрессия капсулы не происходила [36]. Учитывая приведенные факты, связанные с появлением вирулентных для человека и животных штаммов бацилл с фенотипом, отличным по ряду признаков от «классических» штаммов B. anthracis, возникает вопрос об эволюционном происхождении таких штаммов. Существует обоснованное мнение, что сибиреязвенный микроб имеет крайне ограниченные естественные возможности обмена генетическим материалом (в том числе плазмидами вирулентности) с другими бациллами, даже с родственными видами группы B. cereus [37]. Как уже указывалось, это обусловлено тем, что основная (споровая) форма B. anthracis десятилетиями может находиться в почве в покоящемся состоянии и неспособна к рекомбинационным процессам. Правда, существует мнение, подкрепленное некоторыми экспериментами, что штаммы B. anthracis могут прорастать в ризосфере определенных травянистых растений из спор в длинные цепи вегетативных клеток, в которых возможен обмен плазмидами [38]. Сообщается о возможности прорастания B. anthracis, лишенного плазмиды рХО2, в обогащенной автоклавированной почве [20]. Однако, на наш взгляд, проведенные экспериментальные исследования пока недостаточны для суждения о реальной возможности генетического обмена между B. anthracis и другими бациллами в окружающей среде. Следовательно, естественный генетический обмен, в частности горизонтальный перенос генов плазмид вирулентности рХО 1 и рХО2, возможен в ограниченный период инфекционного заболевания, который, по-видимому, не приводит к каким-либо генетическим вариациям даже внутри вида [39, 40]. Ведь наиболее отличающиеся между собой штаммы B. anthracis имеют более 99,99% идентичности нуклеотидной последовательности [40] и внутривидовая дифференциация сибиреязвенного микроба возможна лишь с помощью SNP и VNTR [41]. Мы не имеем экспериментальных данных, подтверждающих, что такой естественный генетический обмен плазмидами вирулентности между B. anthracis и другими бациллами может происходить в организме человека и животных. Тем не менее в лабораторных условиях осуществление переноса плазмид между штаммами внутри группы B. cereus не представляет серьезных трудностей, поскольку имеются многочисленные гены мобильности и гены с конъюгативной функцией на плазмиде рХО2 [33, 42]. Плазмиды B. anthracis не самотрансмиссибель-ны, но как рХО1, так и рХО2 могут быть перенесены от B. anthracis к излеченным от плазмид штаммам B. anthracis или реципиентным штаммам B. cereus с помощью мобилизующих плазмид. Необходимым условием для горизонтального переноса генов является прямой (конъюгация) или непрямой (трансформация, трансдукция) контакты вегетативных клеток штаммов донора и реципиента. Предполагается, что конъюгация - наиболее реальный путь переноса плазмид в группе B. cereus [43]. Итак, эволюция вирулентных штаммов бацилл, прежде всего из группы B. cereus, вызывающих «антраксоподобные» заболевания, пока не ясна. С одной стороны, вирулентный потенциал членов этой группы, генетически весьма близких к B. anthracis, очень высок и полностью обусловлен «шансом» получения токсиносодержащей и капсульной плазмид путем горизонтального переноса генов. Патогены такого типа названы «многообещающими монстрами (hopeful monsters)» [44]. В прошлом, хотя и относительно недавно в историческом смысле, т.е. 20-30 тыс. лет назад [45] B. anthracis, будучи «многообещающим монстром» осуществил такую возможность и распространился по всему миру. Высокая вариабельность внутри группы B. cereus по наличию крупных плазмид, свидетельствует об интенсивном обмене информацией путем горизонтального переноса генов [46, 47]. По данным Han и соавт. [48], B. cereus и B. thuringiensis имеют полные наборы генов, необходимых для кодирования трехкомпонентного токсина и капсулы из полиглутаминовой кислоты. С другой стороны, отсутствие рекомбинаций в эволюционной истории сибиреязвенного микроба, низкие уровни его генетической вариабельности связаны именно с ограниченными возможностями дивергенции его вегетативной формы в природе [22]. По-видимому, лишь дальнейшие эпидемиологические и молекулярно-биологические исследования, особенно важные в связи с обнаружением наиболее отличных от B. anthracis вирулентных штаммов B. cereus, преимущественно африканского происхождения, помогут установить место, время и обстоятельства, приведшие к появлению таких штаммов. С учетом своеобразия природных условий Западной Африки, следует обратить особое внимание на возможности сохранения и размножения вегетативной формы сибиреязвенного микроба в окружающей среде. Тем не менее нельзя исключить, что подобные штаммы могли быть генетически сконструированы в лабораторных условиях. Независимо от причин появления таких штаммов, следует отметить, что микробиологические методы диагностики сибирской язвы, основанные на множестве общепринятых признаков идентификации B. anthracis, таких как отсутствие подвижности 52 и гемолиза, чувствительность к специфическому Y-фагу и пенициллину (тест «жемчужного ожерелья») и других, с подобными штаммами могут дать ложноотрицательные результаты. По-видимому, неоднозначные результаты могут быть получены и при оценке их вирулентности на лабораторных животных. В этих условиях наиболее надежными кажутся молекулярно-генетические методы, основанные на обнаружении двух плазмид вирулентности (рХО 1 и рХО2). В то же время необходимо помнить о бес-плазмидных штаммах и штаммах с элиминацией одной из плазмид B. anthracis, которые иногда выделяются из окружающей среды [1]. Таким образом, при эпидемиологическом расследовании и лабораторной диагностике инфекционных заболеваний с клиническими симптомами сибирской язвы необходимо учитывать возможность обнаружения необычных штаммов B. anthracis или других бацилл. Адекватный диагноз, в этом случае, возможен лишь при исследовании принципов по-лифазной таксономии, т. е. комплексного подхода, включающего наряду с бактериологией и серологией генодиагностику и генотипирование.

About the authors

A. V Lipnitskiy

Volgograd Research Anti-Plague Institute

Email: lipnitskii@list.ru
7, Golubinsky Str., Volgograd, Russian Federation, 400131

I. A Barkova

Volgograd Research Anti-Plague Institute

7, Golubinsky Str., Volgograd, Russian Federation, 400131

V. A Antonov

Volgograd Research Anti-Plague Institute

7, Golubinsky Str., Volgograd, Russian Federation, 400131

A. M Barkov

Volgograd Research Anti-Plague Institute

7, Golubinsky Str., Volgograd, Russian Federation, 400131

A. V Novozhenina

Volgograd Research Anti-Plague Institute

7, Golubinsky Str., Volgograd, Russian Federation, 400131

References

Supplementary files