The results of the monitoring of vibrio cholerae in the Taganrog Bay of the Azov sea in 2011-2012

Full Text

По данным государственной санитарно-эпидемиологической службы Украины, с мая 2011 г. среди населения Мариуполя регистрировались случаи холеры, вызванные токсигенными штаммами холерных вибрионов эльтор Огава и связанные с употреблением в пищу морских рыбных продуктов. Ростовская область относится к территориям I типа по эпидемиологическим проявлениям холеры, имеет общую акваторию Азовского моря с Донецкой областью Украины, а также интенсивную миграцию населения в пунктах пропуска через государственную границу Российской Федерации. В связи с этим в рамках эпидемиологического надзора за холерой были проведены мероприятия в целях предотвращения завоза холеры с сопредельной территории [1, 2]. Это касалось интенсификации (с 6 июня 2011 г.) мониторинговых исследований морской воды Таганрогского залива Для корреспонденции: Мазрухо Алексей Борисович, канд. мед. наук, зав. лаб. питательных сред, e-mail: plague@aaanet.ru Азовского моря на присутствие Vibrio cholerae, которые были продолжены и в 2012 г. Цель настоящего исследования состояла в анализе результатов мониторинга наличия холерных вибрионов в морской воде Таганрогского залива с расширенной фено- и генотипической характеристикой выделенных штаммов и оценке эффективности указанных мероприятий в связи с предупреждением завоза инфекции на территорию нашей страны. Материалы и методы Отбор проб морской воды в зонах рекреации и местах сброса сточных вод и их исследование на присутствие V. cholerae О1 осуществляли 2 раза в неделю по 12 точкам, в том числе 6 стационарным и 6 дополнительным. Выделение и идентификацию культур холерных вибрионов проводили в соответствии с действующими нормативно-методическими документами [3, 4]. ПЦР-генотипирование исследуемых штаммов V. cholerae О1 проводили по набору следующих генов: все гены СТХ и RS-элементов (cep, orfU, ace, 39 ЭПИДЕМИОЛОГИЯ И ИНФЕКЦИОННЫЕ БОЛЕЗНИ, № 6, 2013 Таблица 1 Характеристика штаммов V. cholerae O1 eltor, выделенных из морской воды Таганрогского залива в период 2011-2012 г. Серовар и но- Дата вы Источник выделения Ген В том числе по тестам идентификации мер штамма деления ctxA tcpA фаг эльтор фаг классический фаготип гемолиз Inaba № 76 16.06.11 Морская вода, место сброса сточных вод ОСК МУП, Управление "Водоканал", Дми-тридиадовка, Неклиновский район - - 10-2 ц 15 + Ogava № 229 20.07.11 Морская вода, зона рекреации, пляж "Центральный", Таганрог - - 10-2 - 13 + Inaba № 301 03.08.11 Морская вода, зона рекреации, пляж "Солнечный", Таганрог + + ц 10-1 10-2 - 15 - Ogava № 180 19.07.12 Морская вода, с. Петрушино (место сброса ливневой канализации, Таганрог) - - ц ц 13 + zot, ctxA, ctxBelt и ctxBclass, rstB, rstRelt и rstRclass, rstA, rstC), attRS, VPI (tcpAelt и tcpAclass, toxT), VPI-2 (int, nanH, vce), кластер MARTX (rtxA, acd-rtxA, rtxC), гены контактно-зависимых систем секреции T3SS (vcsN2, vcsC2, vcsV2, vspD) и T6SS (vasA, vasF, vasK, pbd-vgrG3, acd-vgrG1, hcp), гены cef, hapA, toxR, mshA, tolQRA, vpsA, vpsL, sltA, stn/sto c использованием как специфических праймеров, описанных ранее [5], так и сконструированых нами. VNTR-генотип каждого конкретного штамма О1 выражали в цифровом виде через комбинацию составляющих его генотип аллелей локусов VcA, VcB, VcC, VcD, VcG. Кластерный анализ проводили с использованием разработанной в Ростовском-на-Дону противочумном институте Геоинформационной системы «Холера. Штаммы - VNTR» № 2007620389 [6]. Секвенирование фрагментов ДРК токсигенного штамма осуществляли на генетическом анализаторе ABI Prism 3130 с использованием набора The BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit, согласно рекомендациям изготовителя. Анализ полученных нуклеотидных последовательностей проводили с помощью набора компьютерных программ Vector NTI Suite 11 (www.informax.com). Результаты и обсуждение В ходе проведения мониторинга наличия холерных вибрионов в водных объектах в период с 2011 по 2012 г. было исследовано 778 проб. В результате изолировано 4 штамма V.cholerae О1, которые были типичны по культурально-морфологическим, биохимическим, серологическим свойствам. В 2011 г. при исследовании 522 проб воды было выделено 2 атоксигенных и 1 токсигенный штаммы холерного вибриона О1 (№ 301). После выделения последнего с 6 августа по 8 сентября 2011 г. количество дополнительных точек по эпидемиологическим показаниям увеличилось до 26 (пробы морской и пресной воды, стоков, рыбы, гидро-бионтов), были введены контрольные и ограничительные мероприятия. В результате V. cholerae 01 в этом году больше не выделялись. В 2012 г. при исследования 256 проб воды был изолирован один атоксигенный штамм V. cholerae О1. Харак теристика обнаруженных штаммов представлена в табл. 1. По данным ПЦР-анализа штаммы № 76 и 229, несмотря на то что были выделены в разные сроки и относились к разным сероварам, имели идентичные генотипы (табл. 2). Оба штамма были лишены профагов CTX и RS1 и острова патогенности VPI, т. е. не представляли эпидемической опасности. Второй остров патогенности VPI-2 содержал делецию в 3’-концевой части (vce), сохранив интактный ген nanH. Интересной особенностью этих штаммов явилось присутствие в их геномах генов T3SS, которая может участвовать в патогенезе заболеваний, вызываемых нетоксигенными штаммами. У них также были обнаружены гены vasA, vasF и vasK, входящие в кластер второй контактно-зависимой системы секреции - T6SS, а также ген ее транслокона hcp. Однако эта система вряд ли функциональна, поскольку у данных штаммов не было выявлено последовательностей, кодирующих два ее активных домена - acd-vgrG1 и pbd-vgrG3. Штаммы также содержали гены ряда дополнительных факторов патогенности/персистен-ции. Не исключено, что они обладают измененным геном термостабильного токсина stn/sto, поскольку с одной из двух использованных пар праймеров в ПЦР был получен слабоположительный сигнал. Штаммы с аналогичными генотипами выделялись из водных источников внешней среды и ранее [7]. Таблица 2 Результаты ПЦР-генотипирования Ген Номер штамма 76 229 301 180 CTX, RS1 - - + tcpAeltor, toxT - - + vce - - + acd-vgrG1, pbd-vgrG3 - - + + vcsN2, vcsV2, vcsC2, vspD + + - + attRS, rtxA, rtxC, acd-rtxA, int, nanH, vasA, vasF, vasK, hcp, hapA, cef, mshA, tolQRA, vspA, vspL, toxR + + + + stn/sto, slt1 +/- +/- +/- +/- 40 Наибольший интерес представлял штамм № 301, который содержал профаги CTX и RS1, а также остров патогенности VPI. В отличие от штаммов, вызвавших эпидосложнения в Украине, он относился к серовару Инаба. Расширенный ПЦР-анализ позволил выявить в его геноме ген rstR типа эльтор и ctxB классического типа. Вопрос о копийности ctx в геноме этого штамма остается открытым и является предметом отдельного исследования, однако если он дуплицирован, то обе копии скорее всего идентичны, поэтому мы осуществили секвенирование межгенной области zot-ctxA и 5’-концевой последовательности гена ctxB с использованием ампли-фикатов тотальной ДНК штамма №301. Результаты показали наличие четырех повторов TTTTGAT в промоторной области ctxA, что характерно для вибрионов эльтор, хотя в последнее время были выявлены и классические профаги с таким числом повторов, тогда как ранее считалось, что они должны содержать 7-8 повторов. Последовательность гена ctxB была типичной для классических профагов -содержала C в позициях 115 и 203 (у профагов эль-тор в этих позициях находится T). Эти результаты полностью согласуются с данными других авторов по этому штамму [8]. Таким образом, штамм № 301 содержал гибридный профаг, имеющий ген rstR типа эльтор, 4 повтора TTTTGAT и ген ctxB классического типа. По совокупности этих признаков этот профаг отличался от таковых, интегрированных в геном трех штаммов, выделенных в 2010 г. от больных в Москве (завоз из Индии), которые содержали rstR обоих типов, 5 указанных повторов и дополнительную замену С/А в положении 58 в гене ctxB [9]. С другой стороны, он был сходен с профагами штаммов, выделенных от больных в Иркутске и Ачинске в 1997 г. (завоз из Казахстана) [10]. В связи с отсутствием в нашем распоряжении штаммов, выделенных в Украине, мы не могли сравнить их генотипы с генотипом штамма № 301 и полагаем, что он не был занесен из Мариупольского очага только на основании принадлежности к другому серовару. По всей видимости, этот штамм имел другое происхождение. При VNTR-типировании было установлено, что у штамма № 301 локус VcA содержал 19 повторов, VcB - 16, VcC - 10, VcD - 4 и VcG - 5. Этот генотип оказался близким к таковым завозных клинических штаммов, выделенных ранее (Владивосток, 1999; Москва, 2005), а одному из них был идентичен. VNTR- генотип штамма № 76 оказался уникальным и ранее не встречался на территории Российской Федерации. Штамм № 180 имел сходство со штаммами, выделенными в Ростовской области в период с 2008 по 2011 г., и был идентичен одному из них. Штамм № 229 оказался идентичным штаммам, выделенным в Ростовской области в 2008-2009 гг., и являлся генетически близкородственным вышеупомянутому штамму № 180, а также штаммам, выделенным в 2008 и 2010 гг. Заключение Несмотря на географическую близость Таганрога к Донецкой области Украины, где в 2011 г. отмечалось осложнение эпидемиологической обстановки по холере, токсигенный штамм V. cholerae, выделенный нами в этот же период из воды Таганрогского залива, по всей видимости, имел другое происхождение. Тем не менее факт обнаружения эпидемического штамма холерного вибриона, а также не-токсигенных, но содержащих гены дополнительных факторов патогенности штаммов указывает на необходимость постоянного мониторинга за возбудителем в данном регионе. Полученные данные позволили определить (для лабораторий регионального и федерального уровня) оптимальные последовательность и алгоритм ПЦР- и VNTR-генотипирования штаммов холерных вибрионов. Благодаря своевременному осуществлению мер по оптимизации эпидемиологического надзора за холерой на территории Ростовской области, в том числе мероприятий ограничительного характера, распространение холеры на территорию Российской Федерации в 2011-2012 гг. допущено не было.

About the authors

A. B Mazrukho

“Rostov-on-Don Anti-Plague Institute”

Email: plague@aaanet.ru

V. D Kruglikov

“Rostov-on-Don Anti-Plague Institute”

E. V. Monakhova

“Rostov-on-Don Anti-Plague Institute”

E. A Moskvitina

“Rostov-on-Don Anti-Plague Institute”

L. S Shestialtynova

“Rostov-on-Don Anti-Plague Institute”

O. A Podoynitsyna

“Rostov-on-Don Anti-Plague Institute”

A. S Vodopyanov

“Rostov-on-Don Anti-Plague Institute”

S. O Vodopyanov

“Rostov-on-Don Anti-Plague Institute”

R. V. Pisanov

“Rostov-on-Don Anti-Plague Institute”

D. A Zubkova

“Rostov-on-Don Anti-Plague Institute”

T. A Kudryakova

“Rostov-on-Don Anti-Plague Institute”

M. I Ezhova

“Rostov-on-Don Anti-Plague Institute”

N. N Uskova

“Rostov-on-Don Anti-Plague Institute”

M. V Skachko

“Rostov-on-Don Anti-Plague Institute”

References

Supplementary files