Comparative analysis of the genome regions associated with virulence in original classic and El Tor Biovars of Vibrio cholerae strains



Cite item

Full Text

Abstract

The comparative analysis of the genome regions associated with virulence in various V. cholerae strains: classical biovar, as well as typical and genetically altered strains of El Tor biovar was performed with the use of PCR assays and fragment sequencing. V. cholerae classical biovar genome was demonstrated to be more stable in comparison with the same in V. cholerae El Tor biovar. Within the genome of El Tor vibrios there were identified extensive variable regions carrying pathogenicity genes. It was also found that unlike classical cholera vibrios, in the V. cholerae El Tor genome there is absent CRISPR-system limiting horizontal transfer of the genes. The obtained data concerning these structural peculiarities of V. cholerae El Tor genome may be used in the delivery of the new generations of gene-diagnostic preparations and for improvement of molecular-epidemiological monitoring in case of cholera.

Full Text

Холера - особо опасная инфекционная болезнь, которая приводит к серьезному экономическому и социальному ущербу. Число больных холерой за последние 10 лет (2003-2012) составляет свыше 2 200 000 человек [4]. Возбудителем холеры являются Vibrio cholerae О1- и О139-серогрупп. Холерные вибрионы O1 серогруппы представлены двумя био-варами, отличающимися друг от друга по фенотипическим и генетическим свойствам: классическим, вызвавшим, видимо, первые шесть пандемий холеры, и биоваром Эль Тор, являющимся возбудителем текущей седьмой пандемии. За время эволюции возбудитель холеры Эль Тор претерпел значительные изменения, чему во многом способствовало присутствие в его геноме значительного количества мобильных генетических элементов (МГЭ), таких как профаги (СТХф и RS19), острова патогенности (VPI-1 и VPI-2), пандемич-ности (VSP-I и VSP-II) и персистенции (EPI), инте-гронный остров, а также транспозоны и IS-элементы [9, 21]. Благодаря пластичности генома возбудитель Для корреспонденции: Кульшань Татьяна Алексеевна, канд. мед. наук, науч. сотр. ФКУЗ РосНИПЧИ “Микроб”, e-mail: rusrapi@microbe.ru 26 холеры способен обитать в различных экологических нишах - в организме человека и водной среде. Кроме того, присутствие МГЭ делает геном V cholerae нестабильным, что проявляется в утрате и/ или приобретении новой генетической информации, включая гены вирулентности. Так, в начале 90-х годов прошлого столетия появились высоковирулентные геноварианты V. cholerae биовара Эль Тор [3, 7, 8, 19, 22, 23]. Эти штаммы отличались от типичных изолятов возбудителя присутствием в геноме профага CTXф, кодирующего холерный токсин (СТ - от cholera toxin), гена ctxB классического типа (ctxBl), характерного для V. cholerae классического биовара. Несмотря на то что V. cholerae классического биовара к 1923 г. утратил эпидемическую значимость, этот возбудитель остается природным резервуаром генов патогенности. В то же время до сих пор отсутствуют полные данные о генетическом разнообразии штаммов возбудителя холеры этого биовара. Между тем такие сведения крайне необходимы для разработки нового поколения диагностических и профилактических препаратов, а также для оптимизации эпидемиологического надзора. В связи с этим цель работы состояла в проведении сравнительного анализа структуры участков генома, связанных с вирулентностью и жизнеобеспечением у природных штаммов V. cholerae 01. Материалы и методы В работе был использован 271 штамм холерного вибриона, из которых 40 штаммов относились к классическому биовару, выделенные в 1937-1962 гг. в России и ряде государств Азии (Афганистан, Пакистан, Индия, Китай, Корея), и 231 штамм принадлежал биовару Эль Тор, изолированных в 1970-2010 гг. в России, Украине и Узбекистане. Штаммы были получены из Государственной коллекции патогенных бактерий. Все штаммы выращивали на агаре LB, pH 7,2 в течение 16-18 ч при температуре 37оС. Выделение бактериальной ДНК. ДНК выделяли из клеток V. cholerae стандартным методом [2]. Полученные образцы, содержащие тотальную ДНК холерного вибриона, использовали для амплификации фрагментов генов. Полимеразную цепную реакцию проводили с помощью олигонуклеотидных праймеров, синтезированных в ЗАО «Синтол» (Россия) на программируемом амплификаторе «Терцик» («ДНК-Технология», Россия). Продукты, полученные в ПЦР, анализировали методом электрофореза в 2% агарозном геле. В качестве контроля молекулярной массы использовали коммерческие маркеры GenRuler TM 100 bp DNA Ladder (MBI Fermentas, Литва). Фотодокументирование результатов проводили в системе для гель-документации VersaDoc фирмы BIORAD (США) с использованием программы Quantity One v 4.6.9 (BIORAD, США). Секвенирование геномной ДНК проводили на приборе 3500xL Genetic Analyzers (Applied Biosystems. США) по методу F. Sanger, 1977. Полученные последовательности анализировали с использованием программы Mega 5.0 и выравнивали с соответствующим участком прототипных последовательностей референтных штаммов V. cholerae N16961 биовара Эль Тор и V.cholerae О395 классического биовара, депонированных в базе данных GenBank. Результаты и обсуждение Поскольку совместное существование холерных вибрионов двух биоваров в эндемичных по холере регионах в течение довольно длительного периода могло привести к появлению ряда штаммов V. cholerae классического биовара с измененным геномом как за счет обмена генетической информацией с V. cholerae биовара Эль Тор, так и в результате накопления различных мутаций, возникающих под действием изменяющейся окружающей среды, на первом этапе работы методом ПЦР было определено присутствие в геноме 40 штаммов V. cholerae классического биовара 20 генов вирулентности и жизнеобеспечения, локализованных на семи МГЭ (табл. 1). Установлено, что у всех изученных штаммов присутствовали 15 тестируемых генов, локализованных в коровой части хромосомы (toxR, hapA, rtx.А, attRS), а также на четырех МГЭ - профаге СТХф (ctxA, zot, ace), островах патогенности VPI-1 (tcpA, toxT, aldA, mop) и VpI-2 (hel1760, nanH, rep1803), острове персистенции EPI (mshA). Вместе с тем в их геноме отсутствовали 5 генов (rstC, deo0175, tnp0185 и vco0490, vco0496), входящих в состав трех МГЭ (RS^, VSP-I и VSP-II). Поскольку указанные гены являются генетическими маркерами этих МГЭ, полученные данные означают отсутствие в геноме классических вибрионов профага RS^ и острова Таблица 1 Гены вирулентности и жизнеобеспечения Место локализации Название гена Продукт или функция Профаг СТХф ctxA А-субъединица СТ ctxB В-субъединица СТ P ctxAB Промотор rtxAB zot Токсин зонального поглощения ace Дополнительный СТ Профаг RS^ rstC Антирепрессор rstR Остров патогенности VPI-1 tcpAEltor/ tcpAClass Основная субъединица TCP классических и Эль Тор-вибрионов toxT Регуляторный белок aldA Альдолаза mop Цинксодержащая периплаз-матическая протеаза Остров патогенности VPI-2 hel1760 Хеликаза nanH Нейраминидаза rep1803 Гипотетический белок Остров пандемично-сти VSP-I deo0175 Деоксицитидилат диаминазо-подобный белок tnp0185 Транспозаза Остров пандемично-сти VSP-II vc0490 Связанный с плазмидой белок vc0496 Гипотетический белок Остров персистенции EPI mshA Основная субъединица маннозочувствительных гемагглютинирующих пилей Коровая область хромосомы attRS Сайт для внедрения в хромосому профага СТХф toxR Регуляторный белок rtxA RTX-токсин hapA Растворимая гемагглютинин-протеаза SXT-генетический элемент dfrA Резистентность к тримето-приму strB Резистентность к стрептомицину sulII Резистентность к сульфоме-токсазолу SXT Область SXT-элемента CRISPR-система cas3 Нуклеаза/хеликаза-ограничение горизонтального переноса генов 27 NJ 00 R R R R R R R -35 область -10 область ctxA I-1-1-1-1-1-1-1 ,-'-s. |=0 0395 AGGACTAAATAGTATATTTTGATTTTTGATTTTTGATTTTTGATTTTTGATTTTTGATTTTTGATTTCAAATAATACAAATTTATTTACTTATTTAATTGTTTTGATCAATTATTTTTCTGTTAAACAAAC-GGAGCATTATATGGTAAAGA M8 AGGACTAAATAGTATATTTTGATTTTTGATTTTTGATTTTTGAT---------------------TT CAAATAATACAAATTTATTTACTTATTTAATTGTTTTGATCAATTATTTTTCTC-TTAAACAAAGGGAGCATTATATGGTAAAGA МЭ AGGACTAAATAGTATATTTTGATTTTTGATTTTTGATTTTTGATTTTTGATTTTTGATTTTTGATTTCAAATAATACAAATTTATTTACTTATTTAATTGTTTTGATCAATTATTTTTCTGTTAAACAAAGGGAGCATTATATGGTAAAGA Ml 4 AGGACTAAATAGTATATTTTGATTTTTGATTTTTGATTTTTGAT.....................TT CAAATAATACAAATTTATTTACTTATTTAATT GTTTTGATCAATTATTTTTCTGTTAAACAAAGGGAGCATTATATGGTAAAGA Ml 6 AGGACTAAATAGTATATTTTGATTrTTGATTTTTGATTTTTGAT-....................TT CAAATAATACAAATTTATTTACTTATTTAATTGTTTTGATCAATTATTTTTCTGTTAAACAAAGGGAGCATTATATGGTAAAGA Mi 8 AGGACTAAATAGTATATTTTGATTTTTGATTTTTGATTTTTGAT-....................TT CAAATAATACAAATTTATTTACTTATTTAATTGTTTTGATCAATTATTTTTCTGTTAAACAAAC-GGAGCATTATATGGTAAAGA Ml 9 AGGACTAAATAGTATATTTTGATTTTTGATTTTTGATTTTTGAT---------------------TT CAAATAATACAAATTTATTTACTTATTTAATTGTTTTGATCAATTATTTTTCTGTTAAACAAAGGGAGCATTATATGGTAAAGA M22 AGGACTAAATAGTATATTTTGATTTTTGATTTTTGATTTTTGAT.....................TTCAAATAATACAAATTTATTTACTTATTTAATTGTTTTGATCAATTATTTTTCTGTTAAACAAAGGGAGCATTATATGGTAAAGA M29 AC-C-AC TAAATAGTATAT T T TGAT T T T T GAT T T T TGAT T TT TGAT---------------------TT CAAATAATACAAATTTATTTACTTATTTAATTGTTTTGATCAATTATTTTTCTGTTAAACAAAGGGAGCATTATATGGTAAAGA M30 AGGACTAAATAGTATATTTTGATTTTT GATTTTTGATTTTT GAT - -...................TT CAAATAATACAAATTTATTTACTTATTTAATTGTTTTGATCAATTATTTTTCTGTTAAACAAAGGGAGCATTATATGGTAAAGA М3 4 AGGACTAAATAGTATATTTTGATTTTTGATTTTTGATTTTTGAT....................-TT CAAATAATACAAATTTATTTACTTATTTAATTGTTTTGATCAATTATTTTTCTGTTAAACAAAGGGAGCATTATATC-GTAAAGA М3 5 AGGACTAAATAC-TATATTTTGATTTTTGATTTTTGATTTTTGAT.....................TT CAAATAATACAAATTTATTTACTTATTTAATTGTTTTGATCAATTATTTTTCTGTTAAACAAAGGGAGCATTATATGGTAAAGA M41 AGGACTAAATAGTATATTTTGATTTTTGATTTTTGATTTTTGAT....................-TT CAAATAATACAAATTTATTTACTTATTTAATTGTTTTGATCAATTATTTTTCTGTTAAACAAAGGGAGCATTATATGGTAAAGA 16002Б AGGAATAAATAGTATATTTTGATTTTTGATTTTTGATTTTTGATTTTTGATTTTTGATTTTTGATTTCAAATAATACAAATTTATTTACTTATTTAATTGTTTTGATCAATTATTTTTCTGTTAAACAAAGGGAGCATTATATGGTAAAGA 27Kor AGGACTAAATAGTATATTTTGATTTTTGATTTTTGATTTTTGATTTTTGAT.............-TT CAAATAATACAAATTTATTTACTTATTTAATTGTTTTGATCAATTATTTTTCTGTTAAACAAAGGGAGCATTATATGGTAAAGA 66 AGGACTAAATAGTATATTTTGAT T T T TGATTTTTGATTTTTGATTTTTGAT............-TTCAAATAATACAAATTTATTTACTTATTTAATTGTTTTGATCAATTATTTTTCTGTTAAACAAAGGGAGCATTATATGGTAAAGA 76 AGGACTAAATAGTATATTTTGATTTTTGATTTTTGATTTTTGATTTTTGATTTTTGAT-------TTCAAATAATACAAATTTATTTACTTATTTAATTGTTTTGATCAATTATTTTTCTGTTAAACAAAGGGAGCATTATATGGTAAAGA 110 AGGACTAAATAGTATATTTTGATTTTTGAT ITT TGATTTTTGAT---------------------TTCAAATAATACAAATTTATTTACTTATTTAATTGTTTTGATCAATTATTTTTCTGTTAAACAAAGGGAGCATTATATGGTAAAGA 4Afg AGGACTAAATAGTATATTITGATTTTTGATTTTTGATTTTTGATTTTTGATTTTTGATTTTTGATTTCAAATAATACAAATTTATTTACTTATTTAATTGTTTTGATCAATTATTTTTCTGTTAAACAAAGGGAGCATTATATGGTAAAGA 76(1-2) AGGACTAAATAGTATATTTTGATTTTTGATTTTTGAT----------------------------TTCAAATAATACAAATTTATTTACTTATTTAATTGTTTTGATCAATTATTTTTCTGTTAAACAAAGGGAGCATTATATC-GTAAAGA B-53-1 AGGAC TAAATAC-TATATTTT GAT T TTTGAT T T TT GAT T TT TGATTT TT GAT--------------TT CAAATAATACAAATTTATTTACTTATTTAATT GTTTT GATCAATTATTTTTCTGTTAAACAAAGGGAGCATTATATGGTAAAGA KieS61 AGGACTAAATAGTATATTTTGATTTTTGATTTTTGATTTTTGAT---------------------TTCAAATAATACAAATTTATTTACTTATTTAATTGTTTTGATCAATTATTTTTCTGTTAAACAAAGGGAGCATTATATGGTAAAGA Рис. 1. Нуклеотидные последовательности промоторной области генов ctxAB классических штаммов V cholerae. R означает нуклеотидную последовательность повторов TTTTGAT, являющихся сайтами связывания с регуляторным белком ToxR. 0395 и N16961 - референсные штаммы V. cholerae соответственно классического и Эль Тор-биоваров (нуклеотидные последовательности взяты из GenBank). М8, М9, М14, М16, М18, М19, М22, М29, МЗО, М34, М35, М41, 1600В, 27Ког, 66, 76, 110, 4Afg, 76(1-2), В-53-1 - штаммы классического биовара. ti Я Р р В в о ш о Hi- О р ь- q и и ^ н О ьз ЭПИДЕМИОЛОГИЯ И ИНФЕКЦИОННЫЕ БОЛЕЗНИ, № 2, 2014 Рис. 2. Нуклеотидная последовательность фрагментов гена tcpA изученных штаммов V. cholerae классического биовара. M8, M9, M14, M16, M18, M19, M22, M29, M30, M34, M35, M41, 1600B, 27Kor, 66, 76, 110, 4Afg, 76(1-2), B-53-1 - штаммы V. cholerae классического биовара; O395 и N16961 - референсные штаммы V. cholerae соответственно классического и Эль-Тор-биоваров, нуклеотидные последовательности гена tcpA которых представлены в GenBank. Идентичные нуклеотидные обозначены точками. Shot Palindromic Repeats) [6, 10, 18]. Обнаружение ранее лишь у одного штамма этого биовара (V cholerae О395) CRISPR-системы [14], которая защищает клетку от проникновения чужеродной ДНК, позволяет предположить, что именно эта система могла быть одной из причин относительной стабильности генома возбудителя азиатской холеры. Для проверки этого предположения мы определили присутствие Таблица 2 Генотипы природных штаммов Vibrio cholerae биовара Эль Тор, выделенных в РФ, Украине и Узбекистане в период 7-й пандемии холеры Характеристика генома Коли чество штаммов CTXф VPI-I VPI-II VSP-I VSP-II EPI CRISPR-система ctxA zot rstC tcpA toxT aldA mop nanH tnp0185 vco0490 vco0496 mshA hapA cas3 Штаммы, выделенные от людей Типичные штаммы, выделенные в 1970-1990 гг.. strB dfrA SXT + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + -/н.о - - - - 20/17 - - - - + + + + + + + + + + + + + + + + н.о - - - - 1 - + + + + + + + - + - - - - - + + + + + 3 Измененные варианты, выделенные в 1988 -2010 гг. + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + - + + + + 15 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + - + - + + 8 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + - н.о н.о н.о н.о 11 Штаммы, выделенные из внешней среды + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + -/н.о - - - - 12/13 - - - + + + + + + + + + + + + + + + + + н.о - - - - 1 - - - - - - - - - + - - - + - + + + + + н.о - - - - 1 + + + + + -/н.о - - - - 1/68 + - + + + -/н.о - - - - 1/15 + + + + + + н.о - - - - 8 - - - - - - - - - + - - - - - + + + + + н.о - - - - 13 + + - + + + н.о - - - - 1 + + + + + + н.о - - - - 2 - - - + - - - - - - - - - - - + + + + + н.о - - - - 1 - - - - + + + + + + + + + + + + + + + + н.о - - - - 2 29 ЭПИДЕМИОЛОГИЯ И ИНФЕКЦИОННЫЕ БОЛЕЗНИ, № 2, 2014 CRISPR-системы в геноме 25 штаммов V. cholerae классического биовара. Для ПЦР-идентификации CRISPR-системы был выбран ген cas3, кодирующий нуклеазу/хеликазу, которая производит разрезание чужеродной ДНК и находится в непосредственной близости от CRISPR-кассеты. В результате было установлено присутствие гена cas3 и, следовательно, CRISPR-системы в хромосоме всех 25 изученных штаммов V. cholerae классического биовара. Таким образом, несмотря на давнее возникновение возбудителя азиатской холеры, изученные участки его генома в целом остаются стабильными, поскольку не было выявлено штаммов с утратой хотя бы одного из 15 тестируемых генов, размещенных как в коровой области хромосомы, так и на четырех указанных выше МГЭ. Это, возможно, обусловлено присутствием CRISPR-системы, ограничивающей горизонтальный перенос генов от неизвестных доноров в геном V. cholerae классического биовара. Вместе с тем представленные данные свидетельствуют о том, что штаммы холерного вибриона классического биовара различаются между собой по структуре промоторной области оперона ctxАB, а также гена tcpA, кодирующих ключевые факторы патогенности. Далее с помощью ПЦР мы изучили присутствие тех же 25 генов в геноме 92 клинических штаммов V. cholerae биовара Эль Тор, изолированных в 1970 2010 гг. на территории России, Украины и Узбекистана (табл. 2). Оказалось, что все тестируемые гены коровой области хромосомы (toxR, hapA, rtxА, attRS) присутствовали в хромосоме всех изученных штаммов. Что касается МГЭ, то в геноме 96% штаммов V. cholerae биовара Эль Тор помимо четырех геномных островов (CTXф, VPI-1, VPI-2, EPI), обнаруженных у V. cholerae классического биовара, имелись три дополнительных генных блока - профаг RS^ и два острова пандемичности VSP-I, VSP-II. Эти данные полностью совпадают с ранее опубликованными результатами и говорят о том, что возбудитель холеры Эль Тор, мог приобрести их в процессе эволюции через горизонтальный перенос генетической информации от неизвестных до сих пор доноров [16, 20]. В связи с этим особого внимания заслуживает тот факт, что, согласно нашим данным, ни один из исследованных штаммов V. cholerae био-вара Эль Тор не имел гена cas3 и, следовательно, CRISPR-системы, которая могла бы ограничить горизонтальный перенос генов. На следующем этапе нашей работы мы оценили вариабельность генома клинических штаммов V. cholerae Эль Тор-биовара. В результате исследования было установлено, что среди 92 штаммов 4 изолята были лишены профага CTXф, кодирующего СТ, либо несли дефектный профаг, не имеющий гена ctxA. К тому же один нетоксигенный штамм (М885) был лишен и второго профага RS^. Кроме того, у трех штаммов (М867, М868, М870) наряду с отсутствием гена ctxA из профага CTXф не было островов пандемичности VSP-I и VSP-II, а остров патогенности VPI-2 был дефектным, поскольку не содержал краевых генов hel1740 и rep1803 при наличии гена nanH. Таким образом, генетическое разнообразие клинических штаммов V. cholerae Эль Тор выражалось в следующем: отсутствие профагов CTXф и RS^: островов пандемичности VSP-I и VSP-II, а также наличие дефектного профага CTXф и острова патогенности VPI-2. Это означает, что в отличие от V. cholerae классического биовара геном V. cholerae биовара Эль Тор является нестабильным за счет структурных изменений, связанных с мобильными элементами. При этом среди изученных МГЭ наиболее вариабельным оказался геном профага CTXф. Появление генетически измененных штаммов V. cholerae биовара Эль Тор, несущих ген ctxB1 (классического типа), отличающийся от ctxB3 (характерный для Эль Тор-биовара) наличием двух однонуклеотидных замен в положениях 115 и 203 (С/Т), привело к тому, что геноварианты стали более вирулентными по сравнению с типичными изолята-ми [19] и вытеснили типичные Эль Тор-штаммы во многих эндемичных по холере регионах, что определяет реальную возможность завоза данного возбудителя на территорию России [1, 3, 4, 7, 8]. В связи с этим на следующем этапе работы у изучаемых Эль Тор-штаммов было проведено секвенирование гена ctxB из профага CTXф, которое показало, что все штаммы, выделенные на территории России после 1990 г. несли аллельный ген ctxB1, т. е. были генова-риантами возбудителя холеры Эль Тор. Обнаружение в геноме изученных штаммов V. cholerae биова-ра Эль Тор генов классического холерного вибриона подтверждает возникновение в современный период 7-й пандемии холеры природных генетически измененных штаммов ее возбудителя в результате горизонтального переноса генов холеры [7, 8, 11, 19, 23]. Особый интерес заслуживает вопрос о присутствии в геноме клинических штаммов возбудителя холеры Эль Тор SXTEI - генетического элемента, ответственного за распространение бактериальных генов лекарственной устойчивости. В результате установлена четкая временная связь между обнаружением первого источника SXT^10 - генетического элемента - V. cholerae О139 и появлением штаммов V. cholerae биовара Эль Тор с множественной устойчивостью к лекарственным препаратам, кодируемым генами этого элемента. Так, штаммы, выделенные до 1993 г., были лишены данного элемента, в то время как все штаммы, выделенные позже, несли в своем геноме SXT-элемент с генами лекарственной устойчивости к сульфометоксазолу, триметоприму и стрептомицину и были чувствительны к указанным препаратам, что согласуется с ранее полученными данными [5, 12] (см. табл. 2). Присутствие SXT-элемента в хромосоме всех исследованных нами генетически измененных штаммов V. cholerae биова- 30 ра Эль Тор, начиная с 1993 г., может означать, что в природных популяциях V. cholerae Эль Тор-биовара довольно часто происходил генетический обмен как с V. cholerae классического биовара, так и с V. cholerae О139. Поскольку холерные вибрионы представляют собой группу бактерий, которые являются автохтонными для речных, прибрежных и устьевых экосистем, а водная среда выступает в качестве основного источника передачи данного возбудителя и способствуют обширным генетическим взаимодействиям между различными штаммами V. cholerae [13, 16], то на следующем этапе работы было изучено 139 штаммов, изолированных на разных территориях из водных источников (1970-2004). Обнаружено, что все исследованные штаммы были лишены SXT-генетического элемента и представляли собой три большие группы (см. табл. 2). В 1-ю группу входили 85 (61%) типично водных штаммов, содержащих лишь гены коровой области хромосомы (rtxA, hapA, toxR) и ген mshA острова персистенции, 72 из них содержали и ген attRS. 2-я группа содержала 25 (18%) штаммов, несущих в своем геноме, помимо генов коровой области хромосомы все МГЭ, кроме SXT - генетического элемента. 3-ю группу составляли 29 (21%) штаммов, претерпевших ряд геномных перестроек: 1) утрату генов профагов СТХф и RS^ (гены ctxA, zot, ace, rstC) - 3 штамма при наличии других тестируемых генов; 2) присутствие в геноме авирулентных штаммов гена nanH из ОП VPI-2 - 14 штаммов; 3) сохранение дефектных островов пандемичности VSP-I и VSP-II, так как в их геноме был выявлен один из генов, входящих в состав данных МГЭ - deo0175, tnp0185, vco0490, vco0496 - 12 штаммов (см. табл. 2). Особенности генотипа таких штаммов подтверждают ранее высказанное предположение, что они могли произойти от вирулентных в результате утраты ими в водной среде МГЭ, несущих ключевые гены патогенности. Таким образом, выявленный нами высокий уровень генетического разнообразия природных штаммов возбудителя холеры, изолированных из воды открытых водоемов, указывает на необходимость проведения постоянного молекулярноэпидемиологического мониторинга внешней среды. Заключение В целом полученные данные о генетическом разнообразии штаммов возбудителя холеры двух биова-ров с помощью ПЦР и метода секвенирования показали, что геном штаммов V. cholerae классического биовара, несмотря на более древнее происхождение, является более стабильным по сравнению с таковым V. cholerae биовара Эль Тор. Из восьми тестируемых мобильных элементов (cTXф, RS^, VPI-1, VPI-2, VSP-I, VSP-II, EPI, SXT) в геноме всех проверенных штаммов этого возбудителя присутствует только четыре (CTXф, VPI-1, VPI-2, EPI). Другая важная особенность этого возбудителя состоит в том, что в хромосоме всех штаммов V. cholerae классического биовара имеется CRISPR-система, которая могла создать препятствия получению этим возбудителем дополнительной генетической информации через горизонтальный перенос генов. Вместе с тем мы впервые независимо от недавно проведенных исследований [3, 17] обнаружили у классических вибрионов вариабельность двух участков генома, связанных с вирулентностью - промоторной области оперона ctxAB и гена tcpA, входящих в состав профага CTX9 и острова патогенности VPI-1, кодирующих биосинтез СТ и токсинкорегулируемых пилей. Выявленная вариабельность проявляется в разном количестве повторов TTTTGAT в промоторной области ctx.АБ у разных штаммов, а также однонуклеотидной синонимической замене в гене tcpA (G/Т). Следствием такой изменчивости структуры генома классических вибрионов может быть различный уровень продукции СТ у разных штаммов. Что касается эпидемически опасных штаммов V. cholerae биовара Эль Тор, то для их генома характерно наличие протяженных вариабельных участков, в состав которых входят профаги CTXф и RS^, остров патогенности VPI-2 и остров пандемичности VSP-II. Вариабельность генома возбудителя холеры Эль Тор выражается в потере различных фрагментов ДНК, связанных с патогенностью и эпидемическим потенциалом. Другой важный механизм генетической изменчивости штаммов этого биовара - приобретение нового генетического материала через горизонтальный перенос. Эволюционно значимый результат таких событий - появление штаммов, несущих коньюгатив-ный SXT-элемент с четырьмя генами устойчивости к лекарственным препаратам, а также возникновение ге-новариантов возбудителя с повышенной вирулентностью. Выявленное широкое генетическое разнообразие изученных штаммов V. cholerae биовара Эль Тор может быть отражением различных экологических условий обитания, а также продолжающейся эволюцией генома этого возбудителя. Таким образом, проведенное исследование позволило получить более полные сведения о структуре генома значительного количества штаммов V. cholerae классического и Эль Тор-биоваров, выделенных на разных эндемичных по холере территориях и занесенных на территорию России. Эти сведения необходимы для разработки нового поколения холерных генодиагностических препаратов, а также могут быть использованы для совершенствования молекулярно-эпидемиологического мониторинга внешней среды.
×

About the authors

T. A. Kul’shan

Russian Research Anti-Plague Institute “Microbe”

Email: rusrapi@microbe.ru

N. B. Cheldyshova

Russian Research Anti-Plague Institute “Microbe”

N. P. Guseva

Russian Research Anti-Plague Institute “Microbe”

Email: rusrapi@microbe.ru

N. I. Smirnova

Russian Research Anti-Plague Institute “Microbe”

Email: rusrapi@microbe.ru

References

  1. Ломов Ю.М., Москвитина Э.А., Арешина О.А., Адаменко О.Л. Оценка эпидемиологической обстановки по холере в мире в современный период. Прогноз. Проблемы особо опасных инфекций. 2011; 1 (107): 16-9.
  2. Методические указания (МУ) 1.3.2569-09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности». М; 2010.
  3. Миронова Л.В., Балахонов С.В., Урбанович Л.Я., Кожевникова А.С. и др. Молекулярно-генетический анализ эпидемически опасных штаммов Vibrio cholerae Eltor, изолированных в Сибирском и Дальневосточном регионах России. Молекулярная генетика, микробиология, вирусология. 2012; 2: 13 - 20.
  4. Москвитина Э.А., Мазрухо А.Б., Адаменко О.Л., Кругликов В.Д. Холера в начале XXI века. Прогноз на глобальном уровне. Проблемы особо опасных инфекций. 2012; 1 (111): 11-16.
  5. Подшивалова М.В., Захарова И.Б., Викторов Д.В., Алексеев В.В. Распространенность интегронов класса I и SXT-элементов в изолятах Vibrio cholerae, выделенных на территории Волгоградской области. В кн.: Холера и патогенные для человека вибрионы: Материалы проблемной комиссии. Ростов-н/Д; 2007; 20: 105-8.
  6. Пугач К.С., Лопатина А.В., Северинов К.С. CRISPR-системы адаптивного иммунитета прокариот. Молекулярная биология. 2012; 46 (2): 195-203.
  7. Савельев В.Н., Савельева И.В., Бабенышев Б.В., Куличенко A.Н. Эволюция возбудителя и клинико-эпидемиологические особенности современной холеры Эль-Тор. Эпидемиология и инфекционные болезни. 2012; 5: 31-5.
  8. Смирнова Н.И., Заднова С.П., Шашкова А.В., Кутырев B.В. Вариабельность генома измененных вариантов Vibrio cholerae биовара Эль Тор, завезенных на территорию России в современный период. Молекулярная генететика, микробиология и вирусология. 2011; 4: 11-8.
  9. Смирнова Н.И., Кутырев В.В. Эволюция возбудителя холеры. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2004; 4: 3-13.
  10. Шашкова А.В., Горяев А.А., Смирнова Н.И. Строение и функциональная роль CRISPR-системы бактерий. Проблемы особо опасных инфекций. 2011; 2 (108): 49-52.
  11. Borkakoty B., Biswas D., Devi U. et al. Emergence of classical ctxB genotype 1 and tetracycline resistant strains of Vibrio cholerae O1 El Tor in Assam, India. Trans. Roy. Soc. Trop. Med. Hyg. 2012; 106 (6): 382-6.
  12. Burras V., Quezada-Calvillo R., Marrero J. et al. SXT-related integrating conjugative element in New World Vibrio cholerae. Appl. Environ. Microbiol. 2006; 72 (4): 3054-7.
  13. Chakraborti S., Mukhopadhyay A.K., Bhadra R.K. et al. Virulence genes in environmental strains of Vibrio cholerae. Appl. Environ. Microbiol. 2000: 66 (9) 4022-8.
  14. Chakraborty S., Waise T.M.Z., Hassan F. et al. Assessement of the evolutionary origin and possibility of CRISPR-Cas (CASS) mediated RNA interference pathway in Vibrio cholera O395. In Silico Biol. 2009; 9 (4): 245-54.
  15. Dziejman M., Balon E., Boydet D. et al. Comparative genomic analysis of Vibrio cholerae: genes that correlate with cholera endemic and pandemic disease. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002; 99: 1556-61.
  16. Faruque S.M., Mekalanos J.J. Phage-bacterial interactions in the evolution of toxigenic Vibrio cholerae. Review. 2012; 3 (7): 1-10.
  17. Halder K., Das B., Nair B. et al. Molecular evidence favouring step-wise evolution of Mozambique Vibrio cholera O1 El Tor hybrid strain. Microbiology. 2010; 156: 99-107.
  18. Makarova K.S., Aravind L., Grishin N.V. et al. A DNA repair system specific for thermophilisarchaea and bacteria predicted by genomic context analysis. Nucl. Acids Res. 2009; 30: 482-96.
  19. Morita M., Ohnishi M., Arakawa E. et al. Development and validation of a mismatch amplification mutation PCR assay to monitor the dissemination of an emerging variant of Vibrio cholerae O1 biotype El Tor. Microbiol. and Immunol. 2008; 52 (6): 314-7.
  20. Murphy R.A., Boyd E.F. Three pathogenicity islands of Vibrio cholerae can excise from the chromosome and form circular intermediates. J. Bacteriol. 2008; 190 (2): 636-47.
  21. Mutreja A., Thomson N.R., Connor T.R. et al. Evidence for several waves of global transmission in the seventh cholera pandemic. Nature. 2011; 477: 462-5.
  22. Nair G.B., Qadri F., Holmgren J., Svennerholm A.M. et al. Cholera due to altered El Tor strains of Vibrio cholerae O1 in Bangladesh. J. Clin. Microbiol. 2006; 44: 4211-3.
  23. Nair G.B., Faruque S.M., Bhuiyan N.A. et al. New Variants of Vibrio cholerae O1 biotype El Tor with attributes of the classical biotype from hospitalized patients with acute diarrhea in Bangladesh. J. Clin. Microbiol. 2002; 40 (9): 3296-9.
  24. O’Shea Y.A., Finnan S., Reen F.J. et al. The Vibrio seventh pandemic island-II is a 26,9 kb genomic island present in Vibrio cholerae El Tor and O139 serogroup isolates that shows homology to a 43,4 kb genomic island in V. vulnificus. Microbiology. 2004; 150: 4053-63.

Supplementary files

Supplementary Files
Action
1. JATS XML
Download

Copyright (c) 2014 Eco-vector


СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).
Регистрационный номер и дата принятия решения о регистрации СМИ: № 014448 от 08.02.1996. 
СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).
Регистрационный номер и дата принятия решения о регистрации СМИ: серия ЭЛ № ФС 77 - 80652 от 15.03.2021 .


This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies