FEATURES OF THE CYTOKINE PROFILE IN CHILDREN SUFFERING FROM PERTUSSIS

Full Text

В течение последних лет в центре внимания клиницистов остаются вопросы, связанные с иммунологическими нарушениями при коклюше, а именно особенности цитокинового профиля, определяющего характер иммунного ответа и являющегося прогностическим маркером при ряде инфекционных заболеваний (1-3). В литературе в настоящее время имеются единичные исследования, посвященные изучению отдельных цитокинов при коклюше у детей. Кроме того, отсутствуют сведения о содержании цитокинов в крови, отражающие последовательные этапы формирования иммунного ответа. Несомненно представляет большой интерес анализ цитокино-вой сети в зависимости от вариантов течения коклюша - как моноинфекции или протекающего в ассоциации с другими инфекционными заболеваниями, что очень характерно для этой инфекции. В связи с этим задачей наших исследований явилось изучение цитокинового профиля у больных коклюшем в различные периоды заболевания в зависимости от варианта микстифекции и тяжести течения, а также выявление соотношения ТЫ- и Th2-типов иммунного ответа при этой инфекции. Материалы и методы Под наблюдением находилось 149 детей в возрасте от 1,5 до 14 лет, среди которых 41 перенес коклюш как моноинфекцию, 53 - в сочетании с ми- Для корреспонденции: Попова Ольга Петровна, канд. мед. наук, ст. науч. сотр. клин. отдела ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского, e-mail: doctorpopova@yandex.ru коплазменной инфекцией, 55 - с острыми респираторными вирусными инфекциями. По возрастной структуре больные были распределены следующим образом: дети в возрасте 1,5-3 года - 52 (34,8%), 4-6 лет - 37 (27,8%), 7-14 лет - 60 (40,3%). Диагноз коклюша был установлен на основании клинико-эпидемиологических данных, результатов бактериологических и серологических исследований. Серологиче ская диагно стика коклюша проводилась методом ИФА с использованием тест-системы Ridascreen /Bordetella IgM, IgG, IgA («R-biofarm», Германия). Для верификации микоплазменной инфекции были использованы исследование слизи из носоглотки методом реакции иммунофлюоресценции (РИФ), а также серологический метод имму-ноферментного анализа. Для выявления специфических антител к M. pnemoniae применяли набор Savyon (Израиль). Учет и трактовку результатов проводили в соответствии с инструкциями к перечисленным коммерческим тест-системам. Диагностика острых респираторных вирусных инфекций основывалась на клинических данных и результатах исследования слизи из носоглотки методом РИФ. Основная часть больных были обследованы на 3-4-й неделе заболевания: 61,0% детей при коклюше, протекающем как моноинфекция, 63,6% в ассоциации с респираторным микоплазмозом и 67,8% -с ОРВИ. На 2-й неделе исследования проводилиь у 34,1, 27,3, 21,4% детей, на 5-6-й неделе - у 4,9, 9,1 и 10,4% больных соответственно. Под наблюдением в катамнезе с иммунологическими исследованиями в динамике находились 34 ребенка. 33 ЭПИДЕМИОЛОГИЯ И ИНФЕКЦИОННЫЕ БОЛЕЗНИ, № 5, 2013 Таблица 1 Уровень индуцированной продукции ИФН-у в зависимости от сроков заболевания при различных вариантах течения коклюша у детей Вариант течения 2-я неделя 3-4-я неделя 5-6-я неделя Поздние сроки Моноинфекция Коклюш + респираторный микоплазмоз Коклюш + ОРВИ 521,8±366,1 739,5±230,0 468,3±483,1 733,3±205,4 507,9±129,2 1270,8±358,1 994,5±807,6 1044±336,3 2450,2±477,7 3018,7±299,4 2275,46±939,1 4688±944 Соотношение клинических форм по тяжести течения коклюшной инфекции отличалось в зависимости от вариантов течения. Так, среди больных с моноинфекцией удельный вес среднетяжелых форм составил 63,4%, легких - 36,6% (р<0,05), при микст-инфекциях в сочетании с респираторным микоплаз-мозом - 75,5 и 24,5% (р<0,001), с ОРВИ - 76,3 и 23,7 % (р<0,001) соответственно. При анализе прививочного анамнеза установлено, что 66,7% больных были привиты, 22,7% не привиты, 10,6% привиты против коклюша неполностью. Оценка функционирования цитокиновой сети у больных в нашей работе основывается на изучении следующих цитокинов: провоспалительных - ИЛ-6, ИЛ-8, ИФН-у, ФНОа и противовоспалительных -ИЛ-4, ИЛ-10. Иммунологические исследования проводились в лаборатории клеточных и молекулярных основ иммунитета ФБУН МНИИЭМ им. ГН. Габричевского (зав. лаб. - д-р биол. наук М.С. Бляхер). Культивирование клеток цельной крови с индукторами проводили при температуре 37°С в атмосфере с 5% содержанием СО2 в круглодонном 96-луночном планшете для культуральной работы. Для стимуляции продукции ИФН-у, ИЛ-10, ИЛ-17 использовали ФГА (72 ч инкубации), для ИЛ-6, ИЛ-8, ФНОа - ЛПС ( 24 ч инкубации), а для ИЛ-2 и ИЛ-4 - ФМА с иономицином ( 48 ч инкубации). Определение концентрации ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-10, ИЛ-17, ИФН-у, ФНОа в культуральных супернатантах проводили методом ИФА с использованием тест-систем фирм «Цитокин» (Россия), «Вектор-Бест» (Россия), с соблюденим всех пунктов, изложенных в прилагающихся инструкциях. Параметры функционирования цитокиновой сети сравнивались с показателями здоровых детей. Результаты и обсуждение Анализ особенностей цитокинового профиля у больных коклюшем показал, что наиболее значимые нарушения касались способности лимфоцитов к продукции ИФН-у. Индуцированная продукция ИФН-у была низкой начиная со 2-й недели на протяжении всего заболевания при всех вариантах течения коклюша (табл. 1). Обращало внимание, что на 3-4-й неделе у детей с коклюшем в сочетании с ОРВИ этот показатель был выше, чем у детей с моноинфекцией, и особенно в сравнении с группой детей, у которых заболевание было вызвано ассоциацией коклюша с респираторным микоплазмозом, составляя 1270,8±358,1, 733,3±205,4, 507,9±129,2 пг/мл соответственно (показатель у здоровых детей - 2312±1314 пг/мл) (р<05). Наибольший уровень индуцированной продукции ИФН-у в этой группе больных можно, вероятно, объяснить тем, что возбудители вирусных инфекций стимулируют продукцию данного цитокина. с другой стороны, значительная часть больных в сочетании с ОРВИ в связи с наличием выраженных катаральных явлений с начальных сроков болезни получали различные противовирусные препараты, также оказывающие влияние на индукцию ИФН-у. Наименьшая продукция этого цитокина в течение всех периодов заболевания коклюшем была у больных при сочетанном течении с респираторным микоплазмозом, что имеет определенное клиническое значение. Как показали предшествующие клинико-иммунологические исследования, в условиях длительной низкой продукции ИФН-у наряду с другими факторами создаются условия для экспрессии В-лимфоцитами IgE. Таким образом, могут развиваться IgE-опосредованные аллергические состояния в бронхолегочной системе, состояние гиперергии. Мы провели сравнительный анализ содержания IgE в крови у больных коклюшем при различных вариантах течения (см. рисунок). Было установлено, что наибольшим уровень 600 -, ч-0 А- і і Ч-с ff ч-0 ^ Ч-0 ж Концентрация IgE в сыворотках крови больных коклюшем. 34 продукции IgE отмечался у больных коклюшем в ассоциации с респираторным микоплазмозом. Сравнительный анализ показал, что повышенное содержание IgE в сыворотках крови больных наблюдалось при коклюше-моноинфекции - у 20%, при ассоциации коклюша с респираторным мико-плазмозом - у 83%, с ОРВИ - 31%, при сочетании с ОРВИ и микоплазменной инфекцией - у 50% детей. Важным аспектом в наших клинических наблюдениях явилось то, что при обследовании в катамнезе этот показатель у большинства детей находился в пределах возрастной нормы. Следовательно, можно утверждать, что IgE-опосредованные иммунопатологические состояния при коклюше обратимые и курируются с использованием адекватной иммуно-направленной терапии. Нами также установлено, что способность лимфоцитов к продукции ИФН-у различна в зависимости от клинических форм коклюша. С этой целью был проведен тщательный анализ динамики содержания цитокинов в крови больных с моноинфекцией (табл. 2). Удельный вес детей с низкими показателями ИФН-у был значительно больше при среднетяжелых формах коклюша - 89,7±4,9% против 54,5±10,6% при легких (р<0,05). Поскольку коклюш относится к управляемой вакцинацией инфекции, нами была предпринята попытка выявить зависимость продукции ИФН-у от прививочного анамненза. С целью исключения влияния сопутствующих инфекций этот анализ также ограничивался группой детей с моноинфекцией. Установлено, что у детей, привитых АКДС-вакциной, у 69,6±9,6% больных уровень продукции ИФН-у был ниже, чем у здоровых, у 30,4±9,6% - в пределах нормы. Среди непривитых удельный вес детей с низкими показателями был несколько выше и составил 85,7±9,4%, но без статистически достоверной разницы (р>0,05). Изучение продукции фактора некроза опухоли (ФНОа) лейкоцитами установлено, что индуцированная продукция этого цитокина у больных коклюшем была низкой на всех сроках обследования при всех вариантах течения (табл. 3). Обращает на себя внимание, что она была несколько выше при микстинфекциях как на 3-4-й, так и па 5-6-й неделе заболевания. Так, если у больных с моноинфекцией средний уровень продукции ФНОа на 3-4-й неделе составлял 579,1±115,5 пг/мл, то у детей с коклюшем в ассоциации с респираторным микоплазмозом и с ОРВИ - 1176,4 ± 710,1 и 873,7 ±346,3 пг /мл соответственно (показатель у здоровых детей 1799,0±284,0 пг/мл). Данное обстоятельство можно объяснить тем, что при микстинфекциях, сопровождающихся в различной мере воспалительными процессами, Таблица 2 Уровень индуцированной продукции ИФН-у в зависимости от тяжести заболевания при различных вариантах течения коклюша Клиническая форма Моноинфекция Коклюш и респираторный микоплазмоз Коклюш и ОРВИ Легкая Среднетяжелая 604,2 ± 226,4 389,6 ± 69,2 328,3 ± 185,2 420,2 ± 76,6 296,8 ± 96,0 406,2 ± 78,0 Таблица 3 Уровень индуцированной и спонтанной продукции ФНОа (в пг/мл) в зависимости от сроков заболевания при различных вариантах течения коклюша у детей 2-я неделя 3-4-я неделя 5-6-я неделя Поздние сроки Вариант течения индуцирован ная спонтанная индуцирован ная спонтанная индуцирован ная спонтан ная индуцирован ная спонтан ная Моноинфекция 501,2 ± 138,9 35,1 ± 22,5 579,1 ± 115,5 29,1 ± 9,4 404.5+365,5 10,0+4,6 953,0+123,8 6,3 +2,1 Коклюш + респираторный микоплазмоз 487,3 ± 147,4 42,5 ± 34,2 1176,4 ± 710,1 109,5 ± 46,5 562,8 ± 181,4 12,7+8,0 711,4 ± 241,7 6,5 ± 5,6 Коклюш + ОРВИ 541,3 ± 190,6 351,0 ± 305,2 873,7 ± 346,3 34,9 ± 16,0 813 ± 176,0 26,0 ± 11,4 718,3±156,3 1,0 ± 0,3 Таблица 4 Уровень индуцированной и спонтанной продукции ИЛ-8 (в пг/мл) в зависимости от сроков заболевания при различных вариантах течения коклюша у детей Вариант течения 2-я неделя 3-4-я неделя 5-6-я неделя Поздние сроки индуцирован ная спонтан ная индуцирован ная спонтанная индуцирован ная спонтанная индуцирован ная спонтанная Моноинфек ция 1819,0 ± 608,0 50,0 ± 6,2 2200,1 ± 288,8 127,2 ± 37,8 5110,0 ± 2159,8 456,3 ± 220,0 1704,8,0 ±51,5 48,5 ± 31,0 Коклюш + респираторный микоплазмоз 1819,5 ± 608,0 49,5 ± 8,0 3338,1 ± 853,0 126,7 ± 36,1 2171,0 ± 557,9 373,0 ± 165,7 1838,5 ± 900,0 41,8 ± 22,2 Коклюш + 687,0 ± 608,0 - 3671,9 ± 1013,3 473,3 ± 96,2 4563,2 ± 3044,8 147,8 ± 46,5 1824,0 ± 328,4 68,5 ± 18,5 ОРВИ 35 ЭПИДЕМИОЛОГИЯ И ИНФЕКЦИОННЫЕ БОЛЕЗНИ, № 5, 2013 Таблица 5 Уровень индуцированной и спонтанной продукции ИЛ-6 (в пг/мл) в зависимости от сроков заболевания при различных вариантах течения коклюша у детей Вариант течения 2-я неделя 3-4-я неделя 5-6-я неделя Поздние сроки индуцирован ная спонтанная индуцирован ная спонтанная индуцирован ная спонтанная индуцирован ная спонтан ная Моноин фекция 2950,2 ± 1327,4 5,5 ± 9,7 6269,1 ± 910,0 48,8 ± 16,3 3287,3 ± 730,0 36,0 ± 31,9 6253,5 ± 1817,8 39,3 ± 11,1 Коклюш + респираторный мико-плазмоз 5942,3 ± 556,8 122,7 ± 55,5 7874,2 ± 1611,3 517,9 ± +303,1 4945,2 ± 1463,9 40,8 ± 17,8 3970,4 ± 226,2 20,5 ± 9,8 Коклюш + ОРВИ - - 9075,0 ± 2975,0 125,8 ± 50,3 7189,8+752,1 40,7 ± 37,2 4609,0 ± 470,0 7,1 ± 7,1 происходит стимуляция такого цитокина как ФНОа, реализующего воспаление. Анализ спонтанной продукции ФНОа показал, что она была повышена при всех вариантах течения коклюшной инфекции и на всех сроках наблюдения (см. табл. 3). При этом, как свидетельствуют данные, представленные в таблице, стабильно высокие показатели спонтанной продукции ФНОа отмечались у больных коклюшем при ассоциации с респриратор-ным микоплазмозом. Так, если у больных с моноинфекцией на 2-й и 3-4-й неделе средний уровень продукции ФНОа составлял 35,1±22,5 и 29,1±9,4 пг/мл, то при сочетании с респираторным микоплазмо-зом - 42,5±34,2 и 109,5±46,5 пг/мл соответственно (показатель у здоровых детей 7,0±5,0 пг/мл). Таким образом, результаты наших исследований подтверждают данные (И.В. Бабаченко и соавт [1, 2], указывающих на наличие такого дисбаланса в иммунном ответе при коклюше, а именно на .сочетание высокой спонтанной и пониженной индуцированной продукции ФНОа. Данный факт может свидетельствовать об истощении данного звена ци-токиновой сети у больных коклюшем. Нами получены предварительные данные о влиянии сопутствующих инфекций и бронхолегочных осложнений на продукцию ИЛ-2, характеризующего уровень активации лимфоцитов. Так, средний уровень ИЛ-2 у больных с моноинфекцией составлял 15,3±8,5 пг/мл, с микстинфекциями - 31,9±16,65 пг/мл. В группе больных с микстинфекцией, осложненной пневмониями, этот показатель достигал 839,8±290,3 пг/мл (показатель у здоровых детей 902,0±372,0 пг/мл). Известно, что ИЛ-8 является хемокином, обеспечивающим миграцию клеток в очаг воспаления. При изучении продукции ИЛ-8 нами выявлено, что для коклюша, протекающего как моноинфекция, была характерна низкая как индуцированная, так и спонтанная продукция этого цитокина, лишь к 5-6-й неделе показатели достигали нормальных величин (табл. 4). Тем самым мы подтвердили данные зарубежных исследователей, свидетельствовавшие о подавлении коклюшным токсином продукции хемокинов в организме больного и миграцию лейкоцитов в легкие. Указанным обстоятельством, видимо, можно объяснить затяжной характер бронхолегочных изменений при коклюше. Таблица 6 Уровень индуцированной продукции ИЛ-4 (в пг/мл) в зависимости от сроков заболевания при различных вариантах течения коклюша у детей Вариант течения 2-я неделя 3-4-я неделя 5-6-я неделя Поздние сроки Моноинфекция Коклюш + респираторный микоплазмоз Коклюш + ОРВИ 108,0 ± 44,8 121,6 ± 40,2 76,4 ± 21,5 85,0 ± 29,2 51,6 ± 28,9 75,3+35,6 9,0 ± 5,0 329,5+96,5 81,61+15,5 45,1 ± 39,3 Таблица 7 Уровень индуцированной и спонтанной продукции ИЛ-10 (в пг/мл) в зависимости от сроков заболевания при различных вариантах течения коклюша у детей 2-я неделя 3-4-я неделя 5-6-я неделя Поздние сроки Вариант течения индуцирован ная спонтан ная индуцирован ная спонтанная индуцирован ная спонтанная индуциро ванная спонтанная Моноинфекция 223 ± 54,9 - 426,5 ± 85,5 7,8 ± 1,8 267 ± 130,1 - 178,7+65,8 3,6±2,5 Коклюш + респираторный микоплазмоз 340,8 ± 31,6 17,3 ± 5,9 585,6 ± 117,8 25,6 ± 21,5 221,4 ± 55,8 22,7 ± 18,9 279,1 ± 44,9 5,0 ± 3,2 Коклюш + ОРВИ 297 - 461,4 ± 197,0 5,6 ± 2,5 596,4 ± 431,5 14,6 ± 5,2 305,8 ± 54,8 5,8 ± 2,3 36 Незначительное повышение продукции ИЛ-8 отмечалось в наших наблюдениях лишь на 3-4-й неделе болезни, составляя 3338,1 ±853,0 пг/мл при сочетании с респираторным микоплазмозом и 3671,9±1013,3 пг/мл - с ОРВИ (показатель у здоровых детей 3328,0±712,0 пг/мл). Изучение особенностей продукции ИЛ-6 выявило тенденцию к нарастанию как индуцированной, так и спонтанной продукции этого цитокина, имевшей место при всех вариантах течения коклюша (табл. 5). При этом наибольший уровень продукции ИЛ-6 отмечался на 3-4-й неделе заболевания. Анализ продукции противовоспалительных ци-токинов показал, что для коклюша характерна активная продукция ИЛ-4 и ИЛ-10 на ранних сроках заболевания. При обследовании больных наибольший уровень индуцированной продукции ИЛ-4 отмечался на 2-й неделе заболевания (табл. 6). Так, у детей с моноинфекцией он составлял 108,0±44,8 пгм/л, с микстинфекцией - 121,6±40,2 пг/мл (показатель у здоровых детей 89,0±31,0 пг/мл). На 3-4-й неделе заболевания эти показатели снижались, составляя 76,4±21,5 пг/мл при моноинфекции и 85,0±29,2 и 51,6±28,9 пг/мл соответственно при ассоциации с респираторным микоплазмозом и с ОРВИ. Продукции ИЛ-10, как индуцированная, так и спонтанная, была выше нормальных показателей начиная уже со 2-й недели заболевания (табл. 7). На 3-4-й неделе заболевания отмечался наибольший уровень индуцированной продукции ИЛ-10 у всех больных коклюшем, составляя 426,5±85,5 пг/мл при моноинфекции и 585,6±117,8 и 461,4±197,0 пг/мл - при микстин-фекциях (показатель у здоровых детей 206,0±57,0 пг/мл). При оценке спонтанной продукции ИЛ-10 выявлены те же закономерности. Таким образом, наши исследования подтвердили тот факт, что ИЛ-10 является цитокином, активно участвующим в формировании иммунного ответа по ТЬ2-типу, доминирование которого характерно для определенной группы инфекций, в том числе и для коклюша. Выводы 1. Особенностью цитокинового профиля у детей, больных коклюшем, является снижение на протяжении всего заболевания индуцированной продукции провоспалительных цитокинов, прежде всего, ИФН-у, независимо от наличия или отсутствия со путствующих заболеваний (ОРВИ или респираторного микоплазмоза). 2. Наиболее низкая продукция ИФН-у наблюдается при сочетании коклюшной инфекции с респираторным микоплазмозом, что создает условия для развития гиперергии с IgE-опосредованным механизмом действия. 3. При всех вариантах течения коклюша отмечается повышенная продукция противовоспалительных цитокинов ИЛ-4 и ИЛ-10 начиная с ранних сроков заболевания, что свидетельствует о преобладании иммунного ответа по ТЬ2-типу.

About the authors

O. P Popova

G.N. Gabrichevsky Institute of Epidemiology and Microbiology

Email: doctorpopova@yandex.ru
10, Admirala Makarova Str., Moscow, Russian Federation, 125212

I. M Fedorova

G.N. Gabrichevsky Institute of Epidemiology and Microbiology

10, Admirala Makarova Str., Moscow, Russian Federation, 125212

S. I Koteleva

G.N. Gabrichevsky Institute of Epidemiology and Microbiology

10, Admirala Makarova Str., Moscow, Russian Federation, 125212

References

Supplementary files