MELIOIDOSIS: RESULTS OF CENTENARY STUDY, MODERN PROBLEMS AND NEAREST PERSPECTIVES

Full Text

История изучения В 1912 г. английский патолог Alfred Whitmore (1876-1946) при вскрытии трупов людей с признаками септикопиемии и множественными абсцессами в печени и селезенке выделил возбудителя по своим биологическим и патогенным свойствам по многим параметрам сходного с возбудителем сапа. В своих публикациях [44, 45] он назвал возбудителя Bacillus pseudomallei, а заболевание обозначил как «септико-пиемия морфинистов», ибо в анамнезе 38 погибших фигурировало употребление наркотиков и A. Whitmore считал, что заражение происходило в результате инъекций морфина. Несколько позже A. Stanton и W. Fletcher [41, 42] описали сходное заболевание с выделением сапопо-добной подвижной палочки от животных (лошади, кролики, кошки, собаки) и людей с симптомами, напоминающими холеру. Доказательство ее роли как этиологического фактора в развитии инфекции было получено ими путем заражения выделенной культурой подопытных обезьян. Название заболевания «мелиоидоз» (болезнь ослов) официально было при- Для корреспонденции Илюхин Владимир Иванович, д-р мед. наук, проф., зав. отделом сапа и мелиоидоза, e-mail: vari2@ sprint-v.com.ru нято в 1921 г. на IV конгрессе Дальневосточной ассоциации тропической медицины [41]. Длительное время биноминальное наименование возбудителя, особенно в родовой его части претерпевало многократные изменения: Bacillus (1912), Flavobacterium (1930), Actinobacillus (1936), Malleomyces (1939), Lo-efflerella (1951), Pseudomonas (1957) [2, 5, 20, 47]. Некорректность включения возбудителя мелиоидоза в обширный род Pseudomonas особенно ярко была отмечена в период активного внедрения в таксономию микробов генотипических методов. Было показано, что уровень гомологии рРНК псевдомонад 2-й группы (куда входили возбудители мелиоидоза и сапа) отличался в большей степени от такового в 1-й группе (включающей типовой вид рода Pseudomonas aeruginosa) псевдомонад, чем от Escherichia coli [31]. В дальнейшем на основании результатов генотипических исследований, изучения состава жирных кислот, клеточных липидов и фенотипических характеристик псевдомонады 2-й группы рРНК-гомологии выделили в самостоятельный род - Bur-kholderia, включающий в настоящее время порядка 30 видов бактерий, подавляющее большинство которых состоит из свободноживущих сапрофитов и фитопатогенов [21, 47]. В род Burkholderia (с типовым видом B. cepacia) помимо B. pseudomallei входят также филогенетически близкие ей виды B. mallei и 41 ЭПИДЕМИОЛОГИЯ И ИНФЕКЦИОННЫЕ БОЛЕЗНИ, № 5, 2012 B. thailandensis, уровень фенотипического сходства которых с возбудителем мелиоидоза при наличии определенных различий в размерах и функциях хромосом позволяет их объединить в одну таксономическую группу [4, 13, 23, 25]. Стоит отметить, что некоторые исследователи считают, что B. mallei и B. thailandensis являются делеционными мутантами B. pseudomallei, утратившими в одном случае способность к сапрофитному существованию, а в другом - наоборот, сохранившими свойства только для обитания во внешней среде, потеряв при этом факторы патогенности для человека и животных [5, 32]. Стабильная утрата патогенных свойств B. thai-landensis позволяет использовать штаммы этого вида для разработки вакцинных препаратов, а также применять их в качестве имитаторов возбудителя мелиоидоза при обучении курсантов и проведении занятий по индикации патогенных биологических агентов [4, 5]. Эпидемиология и экология Длительное время источником заражения мелиоидозом людей считали крыс, однако проведенные в 30-х годах прошлого столетия исследования диких грызунов, в том числе крыс, опровергли исходную гипотезу резервуара инфекции. Более того, было показано, что все случаи заболевания людей и животных связаны с наличием возбудителя мелиоидоза в почве и воде окружающей среды [7, 14, 20, 37]. В настоящее время является аксиомой, что B. pseudomallei относится к свободноживущим естественным обитателям почвы на территориях с влажным субтропическим климатом, в географических регионах между 200 северной и 200 южной широты [2, 14, 27, 40, 43, 46]. Эндемичными по мелиоидозу помимо стран Юго-Восточной Азии в настоящее время считаются Китай, Индия, Австралия, Корея, Индонезия, Бразилия, Нигер, Сальвадор, Иран и ряд островных стран Тихого и Индийского океанов [14-16, 18, 30, 33, 35, 37, 46, 48]. Основными механизмами заражения в этих регионах считаются чрескожный, чаще всего профессиональный, - у рисоводов, и аэрогенный (доказано на примере вертолетчиков), заражение алиментарным путем является более редким, чаще всего у животных при поедании грубого корма, контаминированного возбудителем, с повреждением слизистой оболочки рта [7, 15, 20, 26, 33, 34, 37, 48]. Отчетливо проявляется сезонность пика заболеваемости, наибольший подъем которой наступает через 2 нед после начала сезона летних дождей [14, 15, 34]. В период подсыхания почвы концентрация возбудителя мелиоидоза под влиянием дегидратации и инсоляции резко снижается и B. pseudomallei при специальных исследованиях с помощью биопроб и селективных сред обнаруживают, как правило, на глубине 15-30 см от поверхности, в концентрации 102 -106 м. к. на 1 мл почвенного экстракта [14, 27, 43, 46]. Кстати, подобная же концентрация микробов характерна и для других видов буркхольдерий, считающихся типичными представителями ризосферы [8, 9, 17]. Наиболее часто возбудитель мелиоидоза выделяется из ризосферы риса, маиса и ряда других тропических растений [27, 34, 46]. Особое внимание привлекает регулярное выделение B. pseudomallei в районах выращивания каучуковых деревьев (Hevea brasiliensis, Manihot glaziovii), импортированных в ныне эндемичные регионы Юго-Восточной Азии, Австралии, Западной Африки в XIX веке из Бразилии. Высказывается гипотеза, что исторически возбудитель мелиоидоза был завезен из Южной Америки в нынешние эндемичные территории с каучуковыми деревьями или с остатками почвы на их корнях; дополнительным аргументом в пользу этой теории являются данные о генотипической идентичности штаммов B. pseudomallei, выделенных в Бразилии и регионах Австралии и Юго-Восточной Азии с плантациями каучуконосцев [27, 35]. В нормальных условиях возбудитель мелиоидоза не обнаруживается в виде монодисперсной, планктонной суспензии. Естественным состоянием популяции микробов B. pseudomallei являются биопленки в области ризосферы или в местах соприкосновения водных поверхностей с растениями и почвой. Биопленки состоят из популяции бактерий с замедленным ростом и экстраклеточного полисахарида [19, 27, 38], рост и отмирание клеток биопленки обеспечивается системой quorum-sensing, микробные клетки в состоянии биопленки обладают более высокой степенью устойчивости к неблагоприятным факторам внешней среды, в том числе и к антибиотикам. Вторым вариантом сохранения и существования во внешней среде B. pseudomallei является интернализация в фагосомах простейших, чаще всего в Acanthamoeba astronyxys, A. castellanii, A. polyphaga, Hartmanella vermiformis. Образно говоря, почвенные простейшие «пасутся» на влажных биопленках буркхольдерий, которые в свою очередь проникают в амебы и в состоянии симбиоза поддерживают рост популяции, так как в интернализированном состоянии они более устойчивы к воздействию факторов внешней среды [14, 27]. В период накопления бактерий в фагосомах простейших не только происходит сохранение популяции, но и отмечено повышение вирулентности культур [8]. Особенности экологии B. pseudomallei определяют и формирование резервуара возбудителя инфекции, а тем самым и эпидемиологию мелиоидоза. Стоит отметить сразу, что относительно данной инфекции понятие «механизм передачи» является условным, ибо B. pseudomallei относится к типичным незавершенным паразитам и объекты внешней среды нельзя рассматривать в качестве факторов передачи, поскольку в них происходит естественное обитание и накопление возбудителя [6, 7, 27, 40]. Основные механизмы заражения (чрескожный и воздушно-пылевой) определяют и контингент заболевших мелиоидозом в эндемичных районах. Так, в странах Юго-Восточной Азии более 80 % случаев мелиоидоза регистрируется среди рисоводов, основной возраст заболевших 40-60 лет, в большинстве своем это мужчины (> 70%). Среди заболевших бо 42 лее молодого возраста в анамнезе травмы, аварии с обязательным повреждением кожных покровов [15, 20, 24, 30, 34]. Особое внимание привлекает преобладающее значение как предрасполагающего фактора диабета, который в анамнезе больных мелиоидозом превышает 50 % [14, 15, 34, 48]. Кроме того, к факторам, способствующим формированию мелиоидоза, относят онкологические заболевания, алкоголизм, тяжелые травмы, ретровирусные инфекции, переутомление и прочие заболевания и воздействия, снижающие иммунитет организма. Тем не менее отнести мелиоидоз к оппортунистической инфекции, конечно, не представляется возможным, так как имеются многочисленные (> 20 % от обычного числа заболевших) зафиксированные случаи заболевания среди абсолютно здоровых молодых людей (военнослужащих, спортсменов), сюда же можно включить и заболевания среди медицинского персонала в случае вну-трилабораторного заражения при работе с культурой B. pseudomallei [24, 26, 34, 39]. Превращение мелиоидоза из экзотической инфекции в мировую проблему, доказательства опасности этой инфекции для ареала с более чем 2-миллиардным населением, факты заноса инфекции в страны с умеренным и даже холодным климатом, конечно, обусловлены существенным повышением качества методов выделения и идентификации B. pseudomallei и диагностики мелиоидоза у человека и животных. Диагностика Основным методом диагностики в довоенные годы был морфологический - патоморфология очагов болезни (абсцессы во внутренних органах) плюс характеристика этиологического фактора (подвижная аэробная палочка, фенотипически сходная с P aeruginosa). Внедрение в лабораторную практику иммунологических методик привело к существенному прогрессу диагностики мелиоидоза. В середине ХХ века стали активно использовать реакцию агглютинации для идентификации культур и РПГА для выявления специфических антител при подозрении на наличие заболевания у человека и животных [5, 20, 28]. Тщательное изучение фенотипических свойств бактерий параллельно с внедрением в практику нумерической таксономии позволило не только использовать в лабораторных исследованиях дихотомические ключи для определения вида бактерий, но и заложить основу полуавтоматических систем идентификации, широко используемых в настоящее время в практике клинических лабораторий (API, Vitek, Microbact, Nefermtest, Rapid NE). Применение этих систем не только в клиничеких исследованиях, но и при исследовании образцов почвы и воды с использованием селективных сред позволило существенно изменить взгляд медицинского сообщества на ареал распространения B. pseudomallei в природе и уровень заболеваемости населения на эндемичных территориях [10, 11, 22, 29]. И если вполне можно осознать, что эти исследования показали, что в ряде стран Юго-Восточной Азии мелиоидоз является в настоящее время доминирующей нозологической единицей по показателю летальности среди всех инфекционных заболеваний [14, 34], то уж совсем неожиданным оказалось выявление заболеваний мелиоидозом практически во всех странах Европы и Северной Америки среди не только иммигрантов, но и коренных жителей стран с умеренным климатом, посещавших по службе или в качестве туриста эндемичные территории [7, 14, 20, 26]. Ранее в этих случаях, не имея оснований для эпидемиологической настороженности, выделяемые культуры B. pseudomallei идентифицировались как беспигментная P aeruginosa или просто как глюко-зунеферментирующая бактерия. Внедрение в микробиологию генетических методов сыграло серьезную роль не только в таксономии и идентификации, но и во внутривидовом типиро-вании патогенных культур, создав условия для эпидемиологического анализа вспышек заболеваний, в том числе и мелиоидоза [1, 23, 47, 48]. Именно проведение фундаментальных исследований состава нуклеиновых кислот, ДНК - рРНК гибридизации, секвенирования 16S рРНК и позволили выделить из обширного семейства Pseudomonadaceae самостоятельный род Burkholderia семейства Burkhold-eriaceae. Метод ДНК - ДНК-гибридизации считается весьма убедительным при определении таксономического положения микроорганизмов, однако он оказался неэффективным для разграничения видов группы рseudomallei. Для диагностических целей дифференциации видов B. pseudomallei, B. mallei и B. thailandensis оказались пригодными ДНК-зонды, сконструированные за счет негомологичных участков ДНК этих близкородственных видов [1]. Наиболее чувствительным и вполне применимым в практике в настоящее время считается метод полимеразной цепной реакции (ПЦР). Праймеры на основе генов 23S рРНК обладают достаточной чувствительностью и специфичностью, позволяя выявлять возбудитель мелиоидоза в концентрации η·102 м.к/мл при исследовании крови и мокроты больных людей и животных [1, 14, 34]. Принципиальный шаг вперед за счет использования молекулярно-биологических методов типирования сделан в области расшифровки эпидемических вспышек в очагах мелиоидоза. К этим методам относятся ПЦР-амплификация с произвольными праймерами (RAPD), определение сходных варьирующихся по длине нуклеотидных повторов (VNTR), метод мультилокусного сиквенс-типирования (MLST). В данное время именно MLST обеспечивает наиболее высокий уровень внутривидового типирования штаммов B. pseudomallei [1, 23]. Молекулярно-биологические методы полезны не только при эпидемиологическом анализе, но и для оценки характера повторных заболеваний, позволяя дифференцировать случаи рецидива инфекции вторичного инфицирования [14, 15, 34]. Клиника Клиническая картина заболевания мелиоидозом весьма варьируется, вполне оправдывая метафори 43 ЭПИДЕМИОЛОГИЯ И ИНФЕКЦИОННЫЕ БОЛЕЗНИ, № 5, 2012 ческие названия «болезнь с обезьяньим лицом» и «великий имитатор» [5, 36]. В литературе на равных правах существуют 2 классификации - одна построена на скорости течения болезни (молниеносная, острая, подострая и латентная), другая - на анатомических проявлениях (септическая, септикопиемиче-ская, местная, включая легочную). Более распространенной является первая классификация клинических форм мелиоидоза [2, 15, 20, 34]. Инкубационный период при мелиоидозе при точно установленном сроке заражения (внутрилабораторная авария, травма с повреждением кожного покрова) составляет 3-4 дня [24, 34, 39]. В то же время мелиоидоз относится к уникальным заболеваниям, при которых манифестация клинических проявлений может наступать через несколько месяцев и даже лет (максимально из достоверно описанных случаев через 24 и 26 лет) после пребывания в эндемичной зоне [5, 14, 16, 34]. Для молниеносной формы характерно бурное начало, резкий подъем температуры, головные и мышечные боли, одышка. Больные, как правило, поступают в клинику в бреду, с явлениями поноса и рвоты. Болезнь стремительно прогрессирует с развитием коллапса, и больной погибает нередко уже в первые часы после поступления. При острой форме у больных преобладают лихорадка, общая слабость, одышка, на коже отмечают пустулы, сыпь, первичный диагноз нередко определяется как сыпной или брюшной тиф, малярия, спирохетоз, чума. Бактериологическая диагностика в этих случаях, как правило, положительная: культура B. pseudomallei выделяется из крови, пустул, содержимого абсцессов. При вовлечении в патологический процесс легких развивается пневмония с явлениями лихорадки, кашля, болей в груди, рентгенологически выявляются модулярные инфильтраты, каверны, экссудативный плеврит [5, 15, 20]. При экстрапульмональных формах в процесс вовлекаются мочеполовая, опорно-двигательная системы, характерным является выявление абсцессов во внутренних паренхиматозных органах. У детей очень часто формируется гнойный паротит. Для всех форм заболевания независимо от локализации основных очагов поражения характерно затяжное течение с рецидивами в непредсказуемые сроки [14, 19, 34]. Характерным, далеко не изученным проявлением мелиоидоза, из-за которого его именуют «бомбой замедленного действия». является латентная (инаппарантная) форма инфекции, которая может неожиданно приводить при манифестации к любой клинической форме в разные сроки как у жителей эндемичных территорий, так и у лиц, находившихся в служебных или туристических поездках в эндемичных по мелиоидозу районах. Только в США таких лиц по данным серологических обследований насчитывается более 200 тыс. [26, 39]. Выделение культуры в этих случаях обычными бактериологическими методами невозможно, есть предположение, что сохранение B. pseudomallei в макроорганизме происходит или в виде L-форм или в форме так называемых некультивируемых клеток (VBNC), кото рые формируются у B. pseudomallei в анаэробных условиях [3, 27]. Лечение больных мелиоидозом определяется комбинацией факторов: формой заболевания, состоянием пациента в момент поступления, особое значение придается его возрасту и иммунному статусу, и, конечно, необходимо быстрое определение антибиоти-кограммы выделенной культуры. B. pseudomallei высокоустойчивый микроб к большинству известных в настоящее время антибиотиков [5, 14, 19, 30]. Наиболее активными химиотерапевтическими препаратами являются тетрациклины, цефалоспорины третьей генерации, карбапенемы, некоторые хинолоны и ко-тримоксазол. При этом следует отметить, что многие антибиотики, активные in vitro, в процессе лечения оказываются неэффективными как по причине внутриклеточного расположения возбудителя, так и вследствие формирования in vivo микроколоний, окруженных гликокаликсом. В обоих случаях инфект оказывается в значительной мере более резистентным к воздействию химиопрепарата, чем он был при исследовании его in vitro в планктоническом состоянии [19, 38]. В процессе лечения необходимо проводить повторные исследования антибиотико-чувствительности, ибо в процессе химиотерапии возможна селекция резистентных клонов B. pseudomallei. В настоящее время наиболее успешной считается следующая схема лечения. При тяжелых формах мелиоидоза с явлениями септицемии и (или) пневмонии лечение требует внутривенного введения цефтазидима (100 мг/кг в день) в сочетании с ко-тримоксазолом (48 мг/кг в день). Альтернативой этому сочетанию может служить меропенем (25 мг/кг в день). Суточную дозу вводят в три приема с интервалом 8 ч. Подобный курс парентеральной терапии продолжается до появления отчетливых признаков улучшения клинического состояния пациента, обычно он длится 10-14 дней. Затем переходят к перо-ральной поддерживающей терапии, при которой используют чаще всего доксициклин, ко-тримоксазол, амоксициллин-клавунат, длится эта фаза лечения от 8 до 20 нед. Контроль окончательного выздоровления осуществляется по сочетанию клинических признаков и результатов серологических исследований [5, 14, 16, 19, 34]. При лечении локальных форм заболевания препараты вводят перорально (доксициклин, ко-тримоксазол, амоксициллин-клавунат). Длительность лечения при этом обычно короче - в пределах 6 нед. При любом курсе лечения требуется проводить терапию по индивидуальным клиническим показаниям (сердечные препараты, инсулин при наличии диабета, оксигенация, хирургические вмешательства при абсцессах и т. п.) [14, 34]. Эффективность лечения при различных формах заболевания колеблется в зависимости от качества медицинской помощи (ранняя диагностика, подготовленность персонала, наличие эффективных средств лечения). В настоящее время уровень летальности при острых формах в клиниках стран 44 Юго-ВосточнойАзии доходит до 50%, а в Австралии - до 20%, при локальных формах мелиоидоза этот показатель существенно ниже (менее 10%) [14, 15, 19, 34]. Серьезнейшей проблемой при лечении любой формы мелиоидоза является опасность рецидива заболевания, процент рецидивов, по данным различных авторов, колеблется от 13 до 30 % [14, 19, 34]. При этом рецидивы практически не встречаются у излеченных детей. Обращает на себя внимание, что более 90% культур, выделенных от больных при рецидивах, являются генетически изогенными по отношению к изолятам, выделенным при первичном заболевании. При этом не исключается вероятность (в пределах 10 %) и повторного заражения гетерогенными штаммами [34]. Перспективы Для повышения эффективности лечения мелиоидоза лежат, конечно, в подборе наиболее активных антибиотиков и их сочетаний с препаратами, повышающими активность клеточного иммунитета, например гранулоцит-колониестимулирующий фактор (G - CSF), а также препятствующими формированию биопленок in vivo [14, 19]. Принципиальное значение имеют также исследования, направленные на выявление при латентной инфекции некультиви-руемых форм клеток-VBNC и разработка методов санации от них организма. Все усилия по разработке средств специфической профилактики пока остаются безуспешными. Вакцины, разработанные на основе аттенуированных штаммов или протективных антигенов, имеют низкую эффективность и совершенно бесполезны при аэрогенном заражении [5, 12]. Есть основания предполагать, что перспективы в области усовершенствования мелиоидозной вакцины лежат в создании химических вакцин на основе конъюгатов CpG олигонуклеотидов с иммуногенными протеинами или с рекомбинантной ДНК, кодирующей факторы патогенности. В условиях эксперимента вакцинация подобными конъюгатами защищала от не только парентерального, но и аэрогенного заражения культурами B. pseudomallei и B. mallei [5, 19]. Профилактика заболевания сводится к проведению жестких ветеринарных санитарных мероприятий в районах, где обнаружены случаи мелиоидоза, соблюдению режима санитарных норм для медицинских и ветеринарных учреждений, по характеру своей работы связанных с возбудителем мелиоидоза. В ряде западных стран лица, посещавшие территории, эндемичные по мелиоидозу, имеют соответствующую отметку в своих медицинских карточках, что повышает настороженность лечащих врачей при различных лихорадящих состояниях у этих пациентов [5, 19, 26]. Тяжесть течения заболевания, устойчивость возбудителя к антибактериальным препаратам, отсутствие эффективной вакцины в сочетании с возможностью аэрогенного заражения послужили основанием включения B. pseudomallei в категорию возбудителей II группы патогенности, являющихся реальными агентами БО [2, 5, 14, 19, 34], В то же время регулярная регистрация в странах с умеренным климатом (Северная Америка, Европа, включая Скандинавию) спорадических случаев заболевания мелиоидозом среди лиц, посещавших или прибывших из эндемичных территорий на фоне отсутствия зарегистрированных случаев этого заболевания в РФ является в определенной мере индикатором недостаточной санитарно-просветительной работы и эпидемиологической настороженности при мизерном количестве используемых в клинических лабораториях автоматических систем идентификации микроорганизмов.

About the authors

VI. I Ilyukhin

Federal Treasury Institution of healthcare "Volgogorad Research Institute for Plague Control" of the Federal Service for Surveillance on Consumer Rights Protection and Human Well-being

Email: vari2@sprint-v.com.ru

T. V. Senina

Federal Treasury Institution of healthcare "Volgogorad Research Institute for Plague Control" of the Federal Service for Surveillance on Consumer Rights Protection and Human Well-being

References

Supplementary files