THE STUDY OF THE LEVEL OF NEUROTRANSMITTER SEROTONIN FOR THE PREDICTION OF THE PARALYTIC FORM OF TICK-BORNE ENCEPHALITIS

Full Text

Широкое распространение клещевого энцефалита (КЭ), высокий уровень заболеваемости, часто приводящей к инвалидизации, вероятность летальных исходов обусловливают высокую медико-социальную и экономическую значимость инфекции и делают необходимым дальнейший поиск новых ранних методов прогнозирования ее течения [1, 2]. Первые 2-4 дня заболевания КЭ еще не определяют его клинической формы и тяжести. Ведущим в это время часто бывает общеинфекционный синдром, а неврологические проявления развиваются позднее. Однако клиническая симптоматика также не всегда отражает истинную тяжесть и степень поражения центральной нервной системы (ЦНС) [2], вследствие чего исход заболевания, в том числе и неблагоприятный, становится очевидным далеко не в первые дни от начала болезни. В связи с этим актуальным является поиск прогностических маркеров, отражающих выраженность патологических изменений в ЦНС, с целью назначения раннего адекватного лечения. Поражение нервной ткани сопровождается закономерным развитием нейромедиаторного дисбаланса со стороны одной из активно функционирующих систем головного мозга - серотонинергической, вызывающей разнообразные физиологические эффекты во многих тканях организма [3]. В настоящее время описано 15 видов серотониновых рецепторов, участвующих в регуляции сна и температуры тела, боли, биоповеденческих и моторных реакций [4-6]. Помимо этого, доказано, что серотонин является нейромедиатором, обладающим выраженным иммуномодулирующим действием. В ряде исследований показано его влияние на снижение содержания в крови провоспалительных цитокинов IL-6 и TNFa и повышение концентрации противовоспалительного цитокина IL-10 [7]. Аналогом серотонинергического нейрона по ряду морфологических, цитологических, биохимических и фармакологических характеристик является тромбоцит [4, 8, 9]. Он находится за пределами ЦНС, в кровеносном русле, и может служить удобной периферической моделью серотонинергического синапса. Для измерения концентрации серотонина используется ряд современных биохимических и имму-нохимических способов, пришедших на смену недостаточно чувствительному колориметрическому определению. К ним относятся высокоэффективная жидкостная и газовая хроматография с различными видами детекции, радиоиммунологический и имму-ноферментный тесты. В большинстве исследований концентрация серотонина измеряется с помощью хроматографических методов, точных и высокочувствительных, однако дорогостоящих и предъявляю Для корреспонденции: Сумливая Ольга Николаевна, канд. мед. наук, доцент каф. инфекционных болезней ГБОУ ВПО «Пермская государственная медицинская академия им. акад. Е.А. Вагнера» Минздрава России, 614990, Пермь, Петропавловская, 26, e-mail: son-2005@yandex.ru щих высокие требования к персоналу, что ограничивает внедрение их в практику. Появление нового метода иммуноферментного анализа (ИФА), не уступающего по чувствительности и специфичности рутинным тестам [10], создало возможность проводить исследование концентрации серотонина, используя уже существующую инструментальную базу и опыт сотрудников, владеющих этой техникой. Определение серотонина с помощью ИФА имеет ряд особенностей вследствие того, что специфические высокоаффинные антитела удается получить только к молекулам ацилированных производных нейротрансмиттера. Поэтому перед исследованием необходимо подвергнуть биологические образцы дополнительной стадии обработки, включающей экстракцию, ацилирование и гидролиз. Появление усовершенствованных модификаций открыло перспективу широкого внедрения этих тестов в лабораторную диагностику. До настоящего времени исследование серотонина в тромбоцитах у больных при КЭ не проводилось. Цель исследования - изучить количественное содержание серотонина в тромбоцитах крови у больных в остром периоде КЭ и определить критерий прогнозирования развития паралитической (очаговой) формы инфекции. Материалы и методы Обследовано 44 больных с острым течением КЭ. Их них 24 мужчины и 20 женщин в возрасте от 18 до 71 года (44,3 ± 15,8 года). Больные были разделены на две группы в зависимости от клинической формы заболевания. 1-я группа включала 35 пациентов с непаралитической формой КЭ (у 19 человек - лихорадочная форма, у 16 - менингеальная). Во 2-ю группу вошли 9 человек с паралитической (очаговой) формой КЭ. Контрольную группу составили 15 здоровых лиц. Диагноз КЭ устанавливался на основании эпидемиологических (присасывание клеща или посещение леса в сроки, соответствующие инкубационному периоду), клинических (наличие интоксикационного, менингеального, очагового синдромов) и серологических (обнаружение в сыворотке крови специфических IgM к антигену вируса клещевого энцефалита) данных. Концентрацию тромбоцитарного серотонина (ТС) крови определяли методом твердофазного ИФА с использованием набора Serotonin ELISA Fast Track (LDN, Германия). Исследование выполнялось в период разгара (первые 2-4 дня) болезни. У больного с КЭ утром натощак забирали 5 мл крови из вены в пластиковую пробирку, содержащую цитрат. Далее для получения плазмы крови, обогащенной тромбоцитами (ПОТ) образцы центрифугировали при 200 х g в течение 10 мин при комнатной температуре. Переносили надосадочную жидкость в другую пробирку и проводили подсчет тромбоцитов. Осадок тромбоцитов получали путем добавления 800 мкл физиологического раствора к 200 мкл ПОТ и центрифугирования (4500 х g, 10 мин). Надосадочную жидкость 20 удаляли. К осадку тромбоцитов добавляли 200 мкл дистиллированной воды и тщательно перемешивали на вортексе. Для реакции ацилирования использовали 25 мкл надосадочной жидкости. До ИФА провели количественное ацилирование серотонина. интенсивность цветовой реакции измеряли при длине волны 450 нм, а количество серотонина в исследуемых образцах рассчитывали по калибровочной кривой, построенной по известным концентрациям в стандартах. Содержание серотонина в тромбоцитах определяли отношением к 109 тромбоцитов. Для статистического анализа использовали программы Statistica 6.0 (StatSoft Inc, США) с применением непараметрических методов. Результаты исследования выражали в виде среднего значения и его стандартного отклонения (M ± о). Выявление статистически значимых различий выборок по количественным показателям в независимых группах проводили с помощью U-критерия Манна-Уитни, в зависимых - по критерию Вилкоксона, различия считали значимыми при p < 0,05. Результаты и обсуждение исследование количественного содержания серотонина тромбоцитов крови у всех больных в остром периоде КЭ, независимо от клинической формы, выявило достоверное снижение данного показателя относительно контрольных значений. Средний уровень ТС составил 203,7 ± 107,1 нг/мл, а в контрольной группе - 585,4 ± 258,8 нг/мл (р < 0,05). Анализ концентрации тС, проведенный в разгар заболевания у больных с различными формами КЭ, позволил установить более низкий показатель при паралитической форме (111,8 ± 40,1 нг/мл), чем при непаралитической (237,1 ± 97,7 нг/мл;р < 0,05) (рис. 1). При лихорадочной и менингеальной формах концентрации ТС колебались в одних и тех же пределах, составляя соответственно 230,9 ± 99,9 и 245,45 ± 98,9 нг/мл (р > 0,05), но были значительно (в 2 раза) ниже, чем у здоровых лиц (рис. 2). Выявлено достоверное различие значений ТС между очаговой и лихорадочной (р < 0,05), очаговой и менингеальной (р < 0,05) формами. Причем при паралитической форме заболевания имело место наиболее резкое снижение ТС. В качестве примера приводим выписки из истории болезни. Больная П., 35 лет, преподаватель, поступила в краевую клиническую инфекционную больницу на 2-й день болезни с жалобами на высокую температуру, сильную головную боль, боли при движении глазных яблок, слабость. Эпидемиологический анамнез: 7 дней назад была в лесу, отмечала присасывание клеща. От КЭ не вакцинирована. Заболела остро, повысилась температура тела до 38,0oC, озноб, головная боль, миалгии, тошнота, рвота на высоте головной боли. При объективном обследовании в стационаре: состояние средней тяжести, температура тела 38,2oC, гиперемия лица и ротоглотки, инъекция сосудов склер, АД 110/70 мм рт. ст., пульс 88 в минуту. Отмечалась легкая ригидность затылочных мышц, симптом Кернига отрицательный, очаговых неврологических симптомов нет. В общем анализе крови: Hb 122 г/л, эр. 4,0 ■ 1012/л, тр. 252 ■ 109/л, л. 4,1 ■ 109/л, э. 1%, п. 2%, с. 53%, лимф. 37%, мц. 6%; СОЭ 2 мм/ч. Проведена люмбальная пункция, ликвор прозрачный, реакция Панди отрицательная, лимфоцитарный плеоцитоз 3 клетки/мкл, белок 330 мг/л, сахар 3,7 ммоль/л. В ИФА сыворотки крови обнаружены антитела класса IgM к вирусу КЭ. Тромбоцитарный серотонин 325,7 нг/мл. Диагноз: КЭ, лихорадочная (непаралитическая) форма. После проведенного лечения выписана на 12-й день заболевания в удовлетворительном состоянии. Определение незначительно сниженного уровня ТС позволило уже в первые дни заболевания с высокой вероятностью предполагать отсутствие поражения вещества головного мозга у данной пациентки и с учетом клинических и лабораторных данных диагностировать лихорадочную форму заболевания. Больная Х ., 61 год, пенсионерка, поступила в краевую клиническую инфекционную больницу на 3-й день болезни с жалобами на высокую температуру, сильную головную боль в затылочной области, ТС нг/мл форма форма Рис. 1. Уровень ТС у больных с паралитической и непаралитической формами в остром периоде КЭ. ТС нг/мл форма форма Рис. 2. Уровень ТС у больных с различными формами КЭ в остром периоде заболевания. 21 ЭПИДЕМИОЛОГИЯ И ИНФЕКЦИОННЫЕ БОЛЕЗНИ, № 4, 2013 слабость, боли в мышцах и суставах. Эпидемиологический анамнез: за 12 дней до заболевания было присасывание клеща в область шеи, клещ не исследован, от КЭ не вакцинирована. Заболела остро, температура 38,8oC, озноб, головная боль, артралгии, миалгии, рвота. Объективные данные: состояние средней тяжести, температура 39,3oC, больная в сознании, гиперемия лица и ротоглотки, инъекция сосудов склер, АД 160/100 мм рт. ст., пульс 96 в минуту. Ригидность затылочных мышц и симптом Кернига умеренно выражены. В общем анализе крови: Hb 106 г/л, эр. 3,5 ■ 1012/л, тр. 240 ■ 109/л, л. 8,0 ■ 109/л, п. 3%, с. 86%, лимф. 7%, мц. 4%; СОЭ 32 мм/ч. Проведена люмбальная пункция, ликвор прозрачный, реакция Пан-ди резко положительная, лимфоцитарный плеоцитоз 725 клеток/мкл, белок 1240 мг/л, сахар 1,72 ммоль/л. В ИФА сыворотки крови обнаружены IgM к вирусу КЭ. Тромбоцитарный серотонин 59,4 нг/мл. Диагноз: КЭ, менингеальная форма. На 5-й день болезни состояние ухудшилось, появились дизартрия, расходящийся страбизм, больная была переведена для лечения в реанимационное отделение, где через 14 дней наступил летальный исход. Заключительный диагноз: клещевой энцефалит, менингоэнцефалити-ческая (паралитическая) форма. Обнаружение резко сниженного содержания Тс у данной пациентки на 3-й день заболевания (в день поступления в стационар) позволило прогнозировать тяжелое течение инфекции со значительным поражением ЦНС, развитие паралитической формы. Исходя из результатов работ отечественных и зарубежных авторов, свидетельствующих о том, что содержание серотонина в тромбоцитах периферической крови может рассматриваться в качестве показателя, отражающего в определенной степени его концентрацию в нейронах головного мозга [4, 8, 9], нами впервые установлено снижение активности церебральных серотонинергических структур в остром периоде КЭ. Анализ уровня ТС крови у больных выявил достоверное снижение данного показателя относительно контрольных значений. Причем при паралитической (очаговой) форме КЭ количественные показатели Тс были существенно ниже, чем при непаралитической (лихорадочной и менингеальной). Наличие достоверной разницы между тяжелой паралитической и менее тяжелой непаралитической формой КЭ в разгар болезни позволило нам использовать данный показатель в качестве прогностического критерия для оценки тяжести заболевания (патент на изобретение РФ № 2474819 «Способ прогнозирования развития очаговых форм клещевого энцефалита в остром периоде»). Заключение Таким образом, исследование нейротрансмиттера серотонина у больных КЭ в остром периоде представляет теоретический и практический интерес, поскольку позволяет оценить степень потенциального повреждения нервной ткани при воспалительном процессе и прогнозировать течение инфекции. Можно предполагать, что серотонин выполняет функ цию модулятора противовоспалительной реакции и играет некую защитную церебропротекторную роль в остром периоде КЭ. Анализ полученных результатов дает возможность инфекционистам и неврологам уже в первые дни болезни прогнозировать формирование паралитических (очаговых) форм, назначить адекватную терапию и уменьшить количество осложнений.

About the authors

O. N. Sumlivaya

Perm State Medical Academy named after Acad. E.A. Vagner

Email: son-2005@yandex.ru

N. N. Vorobiova

Perm State Medical Academy named after Acad. E.A. Vagner

Email: infect-perm@mail.ru

Yu. V. Karakulova

Perm State Medical Academy named after Acad. E.A. Vagner

Email: julia.karakulova@mail.ru

A. P. Nebolsina

Perm Regional Clinical Hospital for Infectious Diseases

Email: gkib1@inbox.ru

L. S. Patrakova

Perm Regional Clinical Hospital for Infectious Diseases

Email: gkib1@inbox.ru

S. G. Ivantsova

Perm Regional Clinical Hospital for Infectious Diseases

Email: gkib1@inbox.ru

References

Supplementary files