THE INFLUENCE OF SOME FACTORS ON THE FORMATION OF BIOFILM BY TOXIGENIC AND NON-TOXIGENIC VIBRIO CHOLERAE EL TOR STRAINS

Full Text

Исследования последних лет показали, что Vibrio cholerae eltor существуют в природных экосистемах не только в виде свободно плавающих планктонных клеток, но и в виде высокоорганизованных и прикрепленных к субстратам биопленок, образование которых представляет собой сложно регулируемый биологический процесс, состоящий из нескольких стадий [10]. Первая стадия - планктонная представлена в виде свободноплавающих клеток. Вторая - стадия монослоя, при образовании которого важную роль играют жгутик, пили IV типа и системы кворум - сенсинг [8, 11, 12]. И заключительный этап - биопленка, где ключевую роль играет экзополисахарид (ЭПС). Синтезируясь на последнем этапе формирования биопленки, экзополисахарид окружает клетки защитным чехлом Для корреспонденции: Татаренко Ольга Александровна, науч. сотр. группы гибридом лаб. экологии холеры Ростовского-на-Дону противочумного института, e-mail: plague@aaanet и способствует формированию сложной трехмерной структуры с каналами, через которые поступают питательные вещества к бактериям и вымываются продукты их жизнедеятельности. Способность продуцировать экзополисахарид и формировать биопленку имеет решающее значение для выживания Vibrio cholerae eltor в водных средах в периоды между эпидемиями и способствует передаче инфекции во время эпидемий. Продукция экзополисахарида кодируется генами vps. Биопленка сформированная посредством межклеточного матрикса - экзополисахарида была обозначена как vps - зависимая [13]. Наибольшее количество данных о генетической регуляции образования биопленки получено зарубежными исследователями [10, 11]. Работы отечественных ученых немногочисленны и были направлены на изучение условий образования биопленки холерными вибрионами [4, 5], ингибирующей способности сахаров на пленкообразование [2] и участия определенных лектиновых рецепторов в образовании биопленки [3]. 36 Цель данной работы - изучение способности штаммов холерных вибрионов эльтор ctx+, ctx- различного происхождения, формировать монослой, как промежуточный этап биопленки в зависимости от условий культивирования. Материалы и методы Для проведения исследований были выбраны штаммы Vibrio cholerae eltor, с определенным набором генов: пять штаммов выделенных от человека 18895, 16214, 4696, 18826, 15301, ctx+ top+ Hly-; три штамма выделенных от человека 17391, 508, 18899 ctx- top+ Hly-; пять штаммов из объектов окружающей среды 18960, 18843, 18803, 18802, 18896 ctx- tep-Hly+; а также один RO - вариант 16197/1 человеческого происхождения ctx+ top+ Hly-. В работе использовали 4 ругозных варианта штаммов Vibrio cholerae eltor ctx+ 18895, 4696 Vibrio cholerae eltor ctx- 18843, 18960 полученные путем селекции в среде М9. Высевы на агаровые среды для получения ругозных колоний проводили еженедельно. Переход в ругозную форму наблюдали на 8 - 12-й день у штаммов Vibrio cholerae eltor ctx+ 18895, выделенного от человека и Vibrio cholerae eltor ctx- 18843 водного происхождения. Штаммы Vibrio cholerae eltor человеческого 4696 ctx+, и водного Vibrio cholerae eltor 18960 ctx- происхождения образовывали ругозные колонии на 15 - 25-й день выдерживания в среде М9. Тестирование штаммов Vibrio cholerae eltor на способность формировать монослой как промежуточный этап биопленки проводили в плоскодонных полистироловых планшетах. Бактериальные культуры вначале выращивали на плотной питательной среде (агаре Мартена, рН 7,6 - 7,8), затем вносили в бульон Мартена (рН 7,6 - 7,8) до конечной концентрации 107 мк кл/мл. Далее 18-часовую бульонную культуру разводили в 100 раз свежей порцией модифицированной нами среды М9 (pH9,0) или 1% пеп-тонной водой (pH 8,4) и вносили по 100 мкл в лунки 96-луночной панели, культивировали в течение 96 ч при 37° и 25°С. Среда М9 была следующего состава (в г/л): Na2HPO4 - 6; KH2PO4 - 3; NaCl - 0,5; NH4Cl - 1; CaCl2 · 2H2O - 0,01, MgiSO4 · 7H2O - 0,49; LiCl - 0,01, казаминовых кислот - 5, глюкозы - 0,1, маннозы - 1; вода дистиллированная, а 1% пептон-ная вода состояла из (в г/л) пептона -10; NaCl - 5; KNO3 -1; Na2CO3 -2,5; воды дистиллированной. В качестве отрицательного контроля в 4 лунки вносили питательную среду, в которой инкубировали культуры. Плавающие клетки удаляли промыванием лунок дистиллированной водой и вносили 0,1 % раствор кристаллического фиолетового на 30 мин. Затем краситель аккуратно отсасывали и лунки промывали 3 раза дистиллированной водой, после чего экстрагировали окрашенные клетки диметилсульфоксидом (ДМСО) в течение 45 мин при комнатной температуре. Интенсивность окрашивания в лунках планшет оценивали на фотометре при 540 нм. Анализ биопленок, образованных на полистироле в среде М9 при 25°С проводили с помощью ИФА с применением антител сыворотки к ЭПС Vibrio cholerae eltor. ИФА материала биопленок, формируемых на полистироле, проводили непосредственно в лунках 96 луночных планшетов по окончании культивирования в них вибрионов по методике [6]. Измерение оптической плотности исследуемых проб проводили при длине волны 492 нм. Экзополисахарид выявляли с помощью сыворотки, полученной к экзополисахариду штамма Vibrio cholerae eltor 18895, выделенного методом [1]. Для этого использовали беспородных мышей массой 2025 г. Иммуноген вводили внутрибрюшинно четырехкратно с интервалом 14 дней в полном адъюванте Фрейнда в количестве 50 мкг препарата экзополисахарида на одно животное. Забор крови и получение сывороток осуществляли через 10 дней после последней иммунизации. В экспериментах применяли МКА, узнающие эпитопы кор - олигосахарида полученные в лаборатории гибридом РостНИПЧИ. Результаты и обсуждение Все штаммы, взятые в исследование, были охарактеризованы с помощью ПЦР на наличие или отсутствие генов vps - кластера, hapR+, mshA+ и установлено, что независимо от эпидемической значимости их геном содержит эти гены. Исследуемые штаммы были также подвижны. На процесс формирования монослойной пленки, образованной на разделе фаз: жидкая среда - полистирол в виде ободка, состоящего из прикрепившихся к твердой поверхности клеток, влияют факторы окружающей среды и свойства клеток самого микроорганизма. Наиболее важными внешними факторами являются состав питательной среды клеток и температура. Поэтому мы сравнили способность к образованию монослоя Vibrio cholerae eltor при 37°С в 1% пептонной воде, традиционно применяемой для культивирования, и синтетической среде М9 путем количественной и визуальной оценки клеток, прикрепившихся к полистиролу в результате окрашивания их кристаллическим фиолетовым. После обработки последним монослои были видны в виде фиолетовых ободков на границе: жидкая среда - полистирол (см. рисунок). Как видно из табл. 1, штаммы отличались по интенсивности образования монослоя на поверхности полистироловых лунок после культивирования в 1% пептонной воде при 37°С. Наиболее высокие показатели способности к формированию монослоя после экстракции ДМСО выявлены у 2 токсигенных Vibrio cholerae eltor 18895, Vibrio cholerae eltor 4696, и двух атоксигенных Vibrio cholerae eltor 18843, Vibrio cholerae eltor 18960, выделенных от человека и из объектов окружающей среды соответственно ОП540 (0,877 ± 0,2, 0,730 ± 0,16; 0,847 ± 0,19, 0,409 ± 0,08). В то же время остальные токсигенные и атоксигенные штаммы Vibrio cholerae eltor формировали слабовыраженные кольца на границе двух сред, и соответственно после экстракции клеток ДМСО отличались низкими показателями ОП54р в пределах (0,360 ± 0,07-0,177 ± 0,02). У штамма Vibrio cholerae eltor 508 монослой отсутствовал. 37 ЭПИДЕМИОЛОГИЯ И ИНФЕКЦИОННЫЕ БОЛЕЗНИ, № 5, 2012 Рис.1. Биопленки Vibrio eltor в среде M9, окрашенные кристаллическим фиолетовым. а - V. eltor 18895; б - V. eltor 18802; в - V. eltor 508. При тестировании Vibrio cholerae eltor в среде М9 при 37°С с последующим окрашиванием кристаллическим фиолетовым, как и в 1% пептонной воде, те же два токсигенных и два атоксигенных штамма формировали достаточно плотный монослой, в противоположность этим штаммам менее выраженные ободки по периметру лунки планшета отмечены у остальных изученных культур. Экстракция ДМСО не позволила нам выявить статистически достоверной разницы по влиянию среды культивирования на способность штаммов формировать монослои. Формирование бактериальных биопленок подчинено некоторым общим закономерностям. Вместе с тем для каждого вида существуют свои особенности роста и развития, в значительной степени зависящие от температуры, определяющей в том числе и адгезию бактерий, и последующее формирование биопленки. В эксперименте по влиянию температурного режима нами использованы вышеописанные штаммы. При 25°С, т. е. при отсутствии интенсивного роста клеток у тех же токсигенных и атоксигенных штаммов Vibrio cholerae eltor 18895, 4696, 18843, 18960 в обеих средах наблюдали хорошо видимые монослои в виде широких, интенсивно окрашенных колец с экстинциями (1,104 ± 0,26, 0,815 ± 0,19, 0,981 ± 0,23, 0,731 ± 0,16), что свидетельствовало о значительном количестве прикрепившихся клеток. У остальных изученных штаммов Vibrio cholerae eltor зарегистрированы мене плотные монослои с ОП540 (0,598 ± 0,13-0,120 ± 0,01), что являлось следствием прикрепления меньшего количества клеток. Сравнив полученные показатели ОП с предыдущим опытом, нами не выявлено статистически достоверного увеличения способности образования монослоя при 25°С. Таким образом, изменение условий культивирования Vibrio cholerae eltor, а именно снижение температуры, не приводило к усилению образования монослоя. Учитывая, что ругозные варианты характеризуются повышенной продукцией ЭПС, мы сравнили способность экспериментально полученных ругоз-ных вариантов, двух токсигенных штаммов Vibrio cholerae eltor 18895, 4696 и двух атоксигенных штаммов Vibrio cholerae eltor 18843, 18960, формировать при 25°С в среде М9 монослои по сравнению с исходными культурами. В табл. 1 показано, что ругозные варианты ctx+ штаммов Vibrio cholerae eltor 18895, 4696 образовывали более плотные монослои, как показала экстракция ДМСО показатели ОП540 (2,700 ± 0,7, 2,400 ± 0,6) у них выше по сравнению с их типичными формами ОП540 (1,208 ± 0,29, 0,915 ± 0,21). У ругозных ^штаммов Vibrio cholerae eltor 18843, 18960 также зарегистрированы высокие значения ОП540 (1,195 ± 0,2-1,729 ± 0,4), а у их типичных вариантов ОП540 равняется 0,816 ± 0,19-0,994 ± 0,23, т. е. последние образуют менее плотные монослои. Известно, что экзополисахарид является основным компонентом и синтезируется на последнем этапе формирования биопленки. Закономерен вопрос, способны ли клетки монослоев Vibrio cholerae eltor продуцировать ЭПС. Анализ монослоев, образованных на полистироле при 25°С в среде М9, показал в ИФА (табл. 2), что те же два токсигенных и два атоксигенных штамма Vibrio cholerae eltor 18895, 4696, 18843, 18960, продуцируют ЭПС, судя по показателям ОП (3,00 ± 0,7, 2,278 ± 0,5, 2,000 ± 0,4, 1,683 ± 0,3), полученным в результате связывания клеток из монослоя с антителами к ЭПС. В монослоях остальных изученных штаммов ЭПС не выявлен и тому подтверждение, показатели ОП зарегистрированы на уровне отрицательного контроля. Отмечено также, что штаммы, продуцирующие ЭПС на уровне монослойной стадии биопленки, не вступают в реакцию с МКА к R-ЛПС, свидетельствуя о том, что в составе ЭПС нет антигенных детерминантов общих с R-ЛПС. Аналогичные результаты были получены при тестировании монослоев, образованных на полистироле при 25°С в 1% пептонной воде. Результаты и обсуждение В работе было исследовано влияние условий культивирования на образование монослоя, как промежуточного этапа биопленки клетками Vibrio cholerae eltor различного происхождения. Ранее сообщалось [8, 11, 13], что для формирования монослоя необходим жгутик и пили IV типа, а для развития трехмерной структуры биопленки структурные vpsA - vpsL и регуляторный hapR ген. Из 14 изученных штаммов, содержащих без исключения ген mshA+, отвечающий за синтез пилей IV типа, гены vps-кластера, детерминирующие продукцию ферментов, участвующих в биосинтезе ЭПС, и ген hapR+, участвующий в регуляции его синтеза, 13 штаммов Vibrio cholerae eltor обладали способно 38 Таблица 1 Интенсивность образования монослойной пленки V. cholerae eltor Генотипическая Фенотипическая харак- Пленкообразующая способность штаммов, ед. OTO40, инкубированных Штам- характеристика теристика в: мы Vibrio cholerae eltor Источник выделения ctx top vpsA-L, mshA, hapR Mot Hly морфо логия 1% пептонной воде среде М9 ругозных вариантов в среде М9 колоний 25°С 37°С 25°С 37°С 25°С 18895 Человек + + + + Типичная 1,104 ± 0,26 0,877 ± 0,2 1,208 ± 0,29 0,887 ± 0,2 2,700 ± 0,7 16214 + + + + - 0,590 ± 0,13 0,310 ± 0,06 0,422 ± 0,09 0,390 ± 0,08 н. о. 4696 + + + + - 0,815 ± 0,19 0,730 ± 0,16 0,915 ± 0,21 0,740 ± 0,17 2,400 ± 0,6 18826 + + + + - 0,550 ± 0,12 0,360 ± 0,07 0,458 ± 0,09 0,361 ± 0,07 н. о. 15301 + + + + - 0,598 ± 0,13 0,352 ± 0,07 0,437 ± 0,09 0,382 ± 0,08 н. о. 17391 - + + + + 0,200 ± 0,03 0,203 ± 0,03 0,302 ± 0,06 0,283 ± 0,05 н. о. 508 - + + + + 0,098 ± 0,01 0,049 ± 0,01 0,098 ± 0,01 0,079 ± 0,01 н. о. 18899 - + + + + 0,174 ± 0,03 0,177 ± 0,02 0,274 ± 0,05 0,272 ± 0,05 н. о. 16197/1 + - + + - Шерохо ватая 0,120 ± 0,01 0,133 ± 0,01 0,152 ± 0,02 0,120 ± 0,01 н.о . 18960 Окружающая среда - - + + + Типичная 0,731 ± 0,16 0,409 ± 0,08 0,816 ± 0,19 0,448 ± 0,09 1,195 ± 0,2 18843 - - + + + 0,981 ± 0,23 0,847 ± 0,19 0,994 ± 0,23 0,706 ± 0,16 1,729 ± 0,4 18803 - - + + + 0,150 ± 0,02 0,178 ± 0,02 0,252 ± 0,05 0,208 ± 0,03 н. о. 18802 - - + + + 0,168 ± 0,02 0,150 ± 0,01 0,269 ± 0,05 0,214 ± 0,04 н. о. 18896 - - + + + 0,181 ± 0,03 0,07 0,158 ± 0,01 0,08 0,281 ± 0,05 0,06 0,228 ± 0,04 0,05 н. о. 0,06 Примечание. К - контроль - среда без вибрионов: (н. о.) - исследования не проводились p < 0,05 стью адсорбироваться на стенках лунок и формировать кольцо на границе двух сред: полистирол-среда. У штамма Vibrio cholerae eltor 508 такая способность отсутствовала, и это требует отдельного изучения. В 1% пептонной воде традиционно используемой для культивирования и температурном оптимуме 37°С, обеспечивающем максимальную активность ферментов, способность формировать монослой у штаммов Vibrio cholerae eltor визуально и количественно различалась. При этом визуальная оценка толщины монослоя у Vibrio cholerae eltor кореллировала с результатами количества его биомассы. В результате количественного определения степени формирования биопленки, выраженность этого признака отмечалась только у двух токсигенных и двух атоксигенных штаммов Vibrio cholerae eltor. Применение модифицированной нами среды М9, способствующей увеличению частоты образования ругозных колоний, не привело к повышению интенсивности образования монослоя исследованных нами штаммов. Сравнение ОП540 исследуемых штаммов в 1% пептонной воде и среде М9 не позволило нам установить существенное влияния состава сред культивирования на способность Vibrio cholerae eltor формировать монослойную пленку и ее представленность на границе фаз полистирол-среда. Снижение температуры до 25°С, также не приводило к статистически достоверному усилению формирования монослоев в обоих средах. По данным А. Ali [7] способность синтезировать ЭПС свойственна в основном токсигенным штаммам. Сравнение монослоев с использованием иммуноферментного анализа показало, что только два токсигенных и два атоксигенных штамма способны продуцировать ЭПС, что не позволяет установить Свойства монослоев, формируемых на границе среда-полистирол с помощью ТИфА Таблица 2 раздела жидкая Штаммы V. Генотипическая характеристика Показатели ОП в реакции Показатели ОП в реакции cholerae eltor ctx tep vpsA-L, mshA, hapR с антителами к ЭПС с МКА к R-ЛПС (ДН) 18895 + + + 3,000 ± 0,7 0,238 ± 0,03 16214 + + + 0,157 ± 0,01 0,254 ± 0,03 4696 + + + 2,278 ± 0,5 0,256 ± 0,03 18826 + + + 0,175 ± 0,01 0,272 ± 0,04 15301 + + + 0,204 ± 0,02 0,278 ± 0,04 17391 - + + 0,202 ± 0,02 0,235 ± 0,03 508 - + + 0,205 ± 0,02 0,290 ± 0,04 18899 - + + 0,214 ± 0,02 0,287 ± 0,04 16197/1 + - + 0,123 ± 0,01 3,365 ± 0,8 18960 - - + 1,683 ± 0,3 0,266 ± 0,03 18843 - - + 2,000 ± 0,4 0,251 ± 0,03 18803 - - + 0,115 ± 0,01 0,271 ± 0,03 18802 - - + 0,207 ± 0,02 0,227 ± 0,02 18896 p < 0,05 + К (отрицательный) 0,134 ± 0,01 0,117 0,257 ± 0,03 0,114 39 ЭПИДЕМИОЛОГИЯ И ИНФЕКЦИОННЫЕ БОЛЕЗНИ, № 5, 2012 четкой корреляции наличия гена ctx у штаммов Vibrio cholerae eltor, образующих экзополисахарид. Наши исследования также показали, что ЭПС, продуцируемый клетками из биопленок, не имел общих эпитопов с R-ЛПС. A. Heydorn [9] с помощью конфокальной сканирующей лазерной микроскопии было показано, что средняя толщина биопленок, сформированных штаммами, продуцирующими ЭПС, несколько выше по сравнению с типичным и составляет 35 и 25 мкм соответственно. Сравнение нами способности типичных культур с их ругозными вариантами образовывать монослои в среде М9 при 25°С показало, что последние формируют более выраженные монослои. Таким образом, несмотря на наличие генов, детерминирующих образование биопленки, только два токсигенных и два атоксигенных штамма обладали способностью формировать толстый монослой и синтезировать ЭПС, что является предпосылкой для формирования зрелой биопленки при попадании их в стрессовые условия и обеспечивает им высокую конкурентоспособность по сравнению с остальными изученными штаммами.

About the authors

O. A. Tatarenko

Federal Treasury Institution of Healthcare "Rostov-on-Don Research Institute for Plague Control" of the Federal Service for Surveillance on Consumer Rights Protection and Human Well-being

117, Ul. M. Gor'kogo, Rostov-on-Don, Russian Federation, 344002

L. P. Alekseeva

Federal Treasury Institution of Healthcare "Rostov-on-Don Research Institute for Plague Control" of the Federal Service for Surveillance on Consumer Rights Protection and Human Well-being

117, Ul. M. Gor'kogo, Rostov-on-Don, Russian Federation, 344002

N. R. Telesmanich

Federal Treasury Institution of Healthcare "Rostov-on-Don Research Institute for Plague Control" of the Federal Service for Surveillance on Consumer Rights Protection and Human Well-being

117, Ul. M. Gor'kogo, Rostov-on-Don, Russian Federation, 344002

I. S. Shestialtynova

Federal Treasury Institution of Healthcare "Rostov-on-Don Research Institute for Plague Control" of the Federal Service for Surveillance on Consumer Rights Protection and Human Well-being

117, Ul. M. Gor'kogo, Rostov-on-Don, Russian Federation, 344002

O. C. Chemisova

Federal Treasury Institution of Healthcare "Rostov-on-Don Research Institute for Plague Control" of the Federal Service for Surveillance on Consumer Rights Protection and Human Well-being

117, Ul. M. Gor'kogo, Rostov-on-Don, Russian Federation, 344002

O. V. Markina

Federal Treasury Institution of Healthcare "Rostov-on-Don Research Institute for Plague Control" of the Federal Service for Surveillance on Consumer Rights Protection and Human Well-being

117, Ul. M. Gor'kogo, Rostov-on-Don, Russian Federation, 344002

N. B. Nepomnyashchaya

Federal Treasury Institution of Healthcare "Rostov-on-Don Research Institute for Plague Control" of the Federal Service for Surveillance on Consumer Rights Protection and Human Well-being

117, Ul. M. Gor'kogo, Rostov-on-Don, Russian Federation, 344002

N. N. Uskova

Federal Treasury Institution of Healthcare "Rostov-on-Don Research Institute for Plague Control" of the Federal Service for Surveillance on Consumer Rights Protection and Human Well-being

117, Ul. M. Gor'kogo, Rostov-on-Don, Russian Federation, 344002

References

Supplementary files