SENSITIVITY OF PATHOGENIC AND OPPORTUNISTIC MICROORGANISMS TO PROBIOTIC STRAINS IN THE LIGHT OF PERSONALIZED PROBIOTIC THERAPY



Cite item

Full Text

Open Access Open Access
Restricted Access Access granted
Restricted Access Subscription or Fee Access

Abstract

The purpose of the study. To study the sensitivity of clinical strains of pathogenic and opportunistic bacteria and fungi to microorganisms that are part of probiotic preparations. Materials and methods. The sensitivity of 93 cultures of pathogenic and opportunistic microorganisms (UPM) isolated from the feces of patients with intestinal dysbiosis to strains of probiotic bacteria isolated from commercial probiotic preparations was studied: L. plantarum 8RA-3, E. coli M-17, B. subtilis strain VKPM B-10641, E. faecium SF-68, S. boulardii CNCM I-745 by delayed antagonism method. Results. It was found that pathogenic microorganisms showed low and moderate sensitivity to the probiotic strain of L. plantarum. Sensitivity to the probiotic strain of B. subtilis was detected in S. aureus strains, low or completely absent in P. aeruginosa, Klebsiella spp., S. marcescens. The most sensitive to the probiotic strain were clinical strains of E. coli. Conclusion. UPM and pathogenic microorganisms isolated from the gastrointestinal tract of patients with dysbiosis have different sensitivity to probiotic strains: from high to several probiotics to its complete absence. The empirical approach in prescribing a probiotic does not guarantee a therapeutic effect, which makes it expedient to personify the selection of a probiotic based on an assessment of its antimicrobial activity against isolated pathogens.

Full Text

Введение. Резистентность микроорганизмов к антимикробным препаратам (АМП) является одной из глобальных проблем современной медицины, что создает серьёзную угрозу для здоровья человека [1].

Формирование устойчивости патогенов к АМП вынуждает искать новые способы борьбы с ними [2]. Персонифицированная медицина перспективна, поскольку практикует системный подход к оценке состояния пациентов, в отличие от реактивной медицины, где врач реагирует на заболевание [15]. Реактивная медицина направлена на исправление ситуации, в которую попал пациент, персонифицированная медицина направлена на недопущения этой ситуации [16]. Одним из перспективных и безопасных методов лечения ряда инфекционных заболеваний является пробиотикотерапия – назначение иммунобиологических лекарственных препаратов, содержащих живые апатогенные микроорганизмы, обладающие антагонистической активностью в отношении патогенных и условно-патогенных микроорганизмов (УПМ), а также продукты их жизнедеятельности или факторы роста для микроорганизмов нормофлоры (пребиотики) и их рациональные комбинации друг с другом (синбиотики) [3, 4].

Несмотря на то, что назначение пробиотических препаратов с каждым годом неуклонно растёт, данные относительно их клинической эффективности противоречивы. Нередко назначаемые пробиотики оказывают слабый и непостоянный терапевтический эффект [5, 6]. Это подтверждают и пациенты, которые после приёма пробиотиков не всегда отмечают положительную динамику заболевания [7]. Отсутствие ожидаемого клинического эффекта от назначаемой пробиотикотерапии вынуждает искать ответы на возникающие вопросы.

Одна из возможных причин низкой эффективности пробиотиков заключается в том, что штаммы, входящие в их состав, не вступают в антагонистические отношения с УПМ и патогенной микрофлорой пациента. Другая причина - природная нечувствительность клинических изолятов микроорганизмов к пробиотическим штаммам, и, возможно, формирование у них приобретённой резистентности [8].

В связи с выше изложенным актуальным является определение чувствительности УПМ и патогенных микроорганизмов к микробным компонентам коммерческих пробиотических препаратов.

Цель исследования. Изучить чувствительность некоторых патогенных и условно-патогенных штаммов бактерий и грибов к микроорганизмам, входящим в состав коммерческих пробиотических препаратов: Lactobacillus plantarum 8RA-3, Escherichi coli M-17, Bacillus subtilis штамм ВКПМ В-10641, Enterococcus faecium SF-68, Saccharomyces boulardii CNCM I-745.

Материалы и методы. Исследования проведены на базе бактериологической лаборатории Федерального бюджетного учреждения здравоохранения «Центр гигиены и эпидемиологии в Новосибирской области» и кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии Новосибирского государственного медицинского университета.

Изучена чувствительность 93 культур УПМ и патогенных микроорганизмов, выделенных из образцов фекалий пациентов с дисбактериозом кишечника (табл. 1) к штаммам пробиотических бактерий, выделенных из коммерческих препаратов пробиотиков: L. plantarum 8RA-3 (Лактобактерин сухой, производитель Микроген НПО, Россия), E. coli M-17 (Биофлор, производитель Ферейн СОАО, РБ, Беларусь), B. subtilis штамм ВКПМ В-10641 (Ветом 1.1, производитель ООО НПФ «Исследовательский центр», Россия, Новосибирская область, р. п. Кольцово), E. faecium SF-68 (Бифиформ, производитель Пфайзер Консьюмер Мэнюфэкчуринг Италия С.Р.Л., Италия), S. boulardii CNCM I-745 (Энтерол, производитель Биокодекс, Франция).

Таблица 1

Микроорганизмы, выделенные из фекалий пациентов с дисбактериозом кишечника

Микроорганизм

Количество штаммов

Salmonella enteritidis

6

Shigella flexneri

1

Candida albicans

7

Сandida tropicalis

1

Escherichia coli

18

Staphylococcus aureus

6

Staphylococcus saprophyticus

1

Staphylococcus epidermidis

1

Staphylococcus kloosii

1

Citrobacter freundii

5

Citrobacter amalonaticus

1

Citrobacter diversus

2

Enterobacter cloacae

3

Enterococcus faecalis

5

Pantoea agglomerans

3

Serratia marcescens

3

Serratia odorifera

1

Proteus mirabilis

2

Edwardsiella tarda

1

Acinetobacter calcoaceticus

1

Corynebacterium vitarumen

1

Klebsiella pneumoniae

9

Klebsiella oxytoca

9

Pseudomonas aeruginosa

3

Kluyvera ascorbate

1

Enterobacter aerogenes

1

Пробиотические штаммы и штаммы тест-культур идентифицированы по культуральным, морфологическим и тинкториальным, ферментативным, антигенным свойствам, а также с использованием микробиологического анализатора «BactoSCREEN».

Чувствительность патогенных микроорганизмов и УПМ к пробиотическим штаммам определяли методом отсроченного антагонизма на агаризированных средах в соответствии ОФС.1.7.2.0009.15 «Определение специфической активности пробиотиков» [3].

Из суточной культуры пробиотических бактерий готовили суспензию, соответствующую 0,5 единицам по McFarland и высевали бактериологической петлей диаметром 3 мм на чашки Петри с мясо-пептонным агаром для оценки антагонистической активности E. coli, B. subtilis, E. faecium и сахарным агаром для оценки антагонистической активности L. plantarum, S. boulardii, проводя по 2 параллельных штриха. Культивирование L. plantarum, B. subtilis, E. faecium проводили при температуре 37±1 С, S. boulardii - при температуре 29±1° С в течение 48 час. Затем к выросшей культуре пробиотического штамма, не касаясь её, подсевали петлей диаметром 2 мм культуры испытуемых клинических тест-штаммов микроорганизмов в направлении, перпендикулярном зоне роста пробиотического штамма. Посевы инкубировали при температуре 37±1о С в течение 24 час.

Наличие зоны задержки роста тест-культуры, измеряемой в мм, свидетельствует об ингибировании роста исследуемой культуры штаммом пробиотика, а величина зоны подавления свидетельствует о силе его антимикробного воздействия (рис. 1).

Рис. 1. Оценка антимикробной активности пробиотического штамма к тест-культурам in vitro методом отсроченного антагонизма

Fig. 1. Evaluation of the antimicrobial activity of a probiotic strain to test cultures in vitro by the delayed antagonism method

Так, тест-микроорганизм обладает высокой чувствительностью к L. plantarum, если зона угнетения его роста не менее 20 мм, к E. coli - не менее 15 мм, к B. subtilis - не менее 10 мм [3]. Значения зоны угнетения роста для пробиотиков, содержащих сахаромицеты и энтерококки, в фармакопейной статье не описаны, поэтому в данном случае мы руководствовались мнением о том, что зоны угнетения роста тест-культур должны составлять не менее 20 мм [9].

Все эксперименты проводились не менее шести повторов для каждого клинического тест-микроорганизма. Результаты исследований обрабатаны методами вариационной статистики с использованием компьютерной программы «Microsoft Excel».

Результаты. Установлено, что Salmonella enteritidis (n=6) и Shigella flexneri (n=1) проявляли низкую и умеренную чувствительность к пробиотическому штамму L. plantarum. Зона подавления роста Salmonella enteritidis колебалась от 4,6±0,3 до 15,2±0,8 мм и равнялась 16,1±0,6 мм у Shigella flexneri. Высокая чувствительность к L. plantarum наблюдалась только у одного из трёх клинических штаммов Serratia marcescens с зоной задержки роста 20,0±1,3 мм. К остальным исследованным тест-культурам выявлена низкая чувствительность, либо чувствительность отсутствовала совсем.

К пробиотическому штамму B. subtilis (рис. 2) все тест-культуры Candida spp. (n=8) чувствительны (зона ингибирования роста варьировала от 3,0±0,6 до 14,6±1,8 мм), но только 25% культур Candida spp. обладали высокой чувствительностью. Наибольшая чувствительность к пробиотическому штамму B. subtilis выявлена у выделенных культур Staphylococcus aureus (n=6) - 83,3% с зоной ингибирования от 9,8±0,4 до 18,7±1,5 мм.

Высокая антагонистическая активность (более 10 мм)

 

Рис. 2. Антимикробная активность пробиотического штамма B. subtilis в отношении клинических штаммов in vitro

Fig. 2. Antimicrobial activity of the probiotic strain of B. subtilis against clinical strains in vitro

Величина зоны подавления роста B. subtilis клинических штаммов Escherichia coli варьировала от 3,6±0,7 до 11±0,2 мм. Из 18 штаммов Escherichia coli только два (11,1%) обладали высокой чувствительностью к пробиотическому штамму B. subtilis.

Из 6 культур Salmonella enteritidis (зона задержки роста от 0 до 21,5±0,3 мм) у одной культуры выявлена высокая чувствительность и у одной не выявлена чувствительность к B. subtilis. Аналогичный результат получен и в отношении 5 культур Citrobacter freundii (зона задержки роста от 0 до 11,0±0 мм).

Высокая чувствительность к B. subtilis выявлена лишь у тест-культур Staphylococcus epidermidis (n=1) с зоной задержки роста 11,3±0,8 мм, Corynebacterium vitarumen (n=1) с зоной задержки роста 16,3±0,6 мм, Acinerobacter calcoaceticus (n=1) с зоной задержки роста 16±1,0 мм и Сandida tropicalis (n=1) с зоной задержки роста 13±0,7 мм.

Низкая чувствительность к B. subtilis выявлена у тест-культур Shigella flexneri (n=1) с зоной задержки роста 6,2±0,4 мм, Enterobacter spp. (n=5) с зоной задержки роста от 0,5±0,5 до 7,2±0,9 мм.

У некоторых тест-культур чувствительность к пробиотическому штамму B. subtilis была низкой или полностью отсутствовала: Pseudomonas aeruginosa (n=3) - зона задержки роста от 0 до 9,8±0,5 мм, Klebsiella pneumoniae (n=9) - от 0 до 9,5±0,3 мм, Klebsiella oxytoca (n=9) - от 0 до 6,5±0,8 мм, Serratia marcescens (n=3) - от 0 до 5,5±0,4 мм, Enterococcus faecalis (n=5) - зона задержки роста от 0 до 3,8±0,4 мм. У тест-культур Proteus mirabilis (n=2), Edwardsiella tarda (n=1), Staphylococcus saprophyticus (n=1) чувствительность к пробиотическому штамму B. subtilis не выявлена.

Наиболее чувствительными исследованные клинические штаммы оказались к пробиотическому штамму E. coli (рис. 3). Так, высокую чувствительность к нему показали все тест-культуры Pantoea agglomerans (n=3) с зоной задержки роста от 16,8±1,8 до 19,5±1,9 мм, Serratia spp. (n=4) - от 16,1±1,0 до 18±1,5 мм, Corynebacterium vitarumen (n=1) - 24,7±1,4 мм, Shigella flexneri (n=1) с зоной задержки роста 18,25±0,5 мм.

Рис. 3. Антимикробная активность пробиотического штамма E. coli в отношении клинических штаммов in vitro

Fig. 3. Antimicrobial activity of probiotic strain of E. coli against clinical strains in vitro

Высокой чувствительностью к E. coli обладали 66,7% культур Salmonella enteritidis (n=6) с зоной задержки роста от 14,2±1,2 до 18±4,0 мм; 100% штаммов Pseudomonas aeruginosa (n=3) - от 14,2±1,5 до 24±1,2 мм; 50% культур Citrobacter spp. (n=8) - от 0 до 25,5±0,8 мм; 66,7% штаммов Klebsiella spp. (n=18) - от 2±1,0 до 22,5±2,6 мм; 55,6% культур Escherichia coli (n=18) с зоной задержки роста от 7,8±1,24 до 19,5±1,4 мм, 50% культур Enterobacter spp. (n=4) с зоной задержки роста от 7,8±2,0 до 22,0±3,0 мм (рис. 3).

У остальных исследованных культур чувствительность к пробиотическому штамму E. coli была слабой или полностью отсутствовала. Чувствительность отсутствовала у 3 из 6 тест-культур Staphylococcus aureus, у 4 из 5 культур Enterococcus faecalis, у всех выделенных штаммов грибов Candida spp. (n=8), Staphylococcus epidermidis (n=1), Citrobacter amalonaticus (n=1).

Крайне низка чувствительность всех исследованных тест-культур бактерий к пробиотическому штамму E. faecium, а у штаммов грибов Candida spp. чувствительность полностью отсутствовала.

К пробиотической культуре S. boulardii небольшую чувствительность проявили только Corynebacterium vitarumen с зоной задержки роста 8,6±0,9 мм и одна из трёх культур Serratia marcescens с зоной задержки роста 3,6±0,7 мм. Остальные тест-культуры исследованных УПМ и патогенных микроорганизмов не обладали чувствительностью к пробиотическому штамму S. boulardii.

Проведена сравнительная оценка чувствительности клинических штаммов E. coli, которых выделено наибольшее количество (n=18), к использованным пробиотикам. Ни один штамм E. coli не обладал чувствительностью ко всем исследуемым пробиотическим микроорганизмам. Только один штамм E. coli чувствителен к трём пробиотикам. Два клинических штамма - Е. coli 2650 и Е. coli 2652 - чувствительны к B. subtilis. 10 штаммов Е. coli высокочувствительны к пробиотическому штамму Е. coli М-17. Все исследованные штаммы Е. coli проявляли низкую чувствительность к пробиотическим культурам E. faecium и L .plantarum (рис. 4).

Рис. 4. Антимикробная активность пробиотических микроорганизмов в отношении клинических штаммов E. coli

Fig. 4. Antimicrobial activity of probiotic microorganisms against clinical strains of E. coli

Обсуждение. В основе антимикробного действия пробиотиков, в первую очередь, лежат механизмы конкурентного взаимодействия. Пробиотические культуры способны синтезировать большое количество антибактериальных веществ (бактериоцины разных классов, лактаты, протеины с фунгицидным действием, жирные кислоты и др.) [10]. При этом выраженность антимикробного действия может варьировать. Результаты воздействия пробиотических микроорганизмов на определённый штамм УПМ или патогенных микроорганизмов не может служить доказательством эффективности в отношении других штаммов этого же вида [11].

Клинические штаммы Candida spp., Staphylococcus spp. обладали наиболее выраженной чувствительностью к Bacillus subtilis, что обусловлено широким спектром механизмов антимикробного действия последнего Данные эффекты могут быть обусловлены синтезом субтилина, эрицина S, мерсацидина, бацитрацина, диффицидина, воздействующих на грамположительные бактерии, в том числе S. aureus, выработкой сурфактина, бацилизина, подавляющих C. albicans [12].

50% исследованных тест-культур микроорганизмов высокочувствительны к пробиотическому штамму E. coli M-17. Известно, что E. coli продуцирует два типа бактериоцинов (колицины и микроцины), воздействующие на ДНК-гиразу, ДНК-зависимую РНК-полимераза, изменяющие ионную проницаемость и деполяризующие цитоплазматическую мембрану и пр. [13].

Антагонистическое действие L. plantarum в отношении представителей семейства Enterobacteriaceae (Salmonella enteritidis, Shigella flexneri, Serratia marcescens) может быть обусловлено продукцией бактериоцинов, молочной кислоты, перекиси водорода [4].

Выраженная устойчивость штаммов P. aeruginosa к действию пробиотических штаммов B. subtilis, E. faecium, S. boulardii может быть обусловлена способностью псевдомонад синтезировать большое количество вторичных метаболитов, в частности: феназиновые пигменты, пиролы, производные индола, бактериоцины, органические кислоты, которые обладают выраженным антибактериальным действием. При этом считается, что грамположительные бактерии более подвержены антагонистическому действию P. aeruginosa, чем грамотрицательные микроорганизмы [14].

Заключение. Патогенные микроорганизмы и УПМ, выделенные из желудочно-кишечного тракта пациентов с дисбактериозом, обладают различной чувствительностью к пробиотическим штаммам: от высокой к нескольким пробиотикам до полного её отсутствия. Эмпирический подход в назначении пробиотика не может гарантировать терапевтический эффект, что обусловливает целесообразность персонифицированного подбора пробиотика на основе оценки антимикробной активности назначаемого препарата в отношении выделенного патогена.

×

About the authors

Tatyana Suranova

Federal Research and Clinical Center of Specialized Medical Care and Medical Technologies FMBA of Russia;
Sсiеntifiс Rеsеarсh Disinfесtology Institutе

Author for correspondence.
Email: suranovatatiana@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-3411-1027

MD, PhD, Professor of the Department of hygiene, epidemiology and infectious diseases, Academy of Postgraduate Education

Russian Federation

References

  1. Danilov A.I., Zharkova L.P. [Antibiotic resistance: arguments and facts]. Clin Pharmacol Ther 2017; 26(5): 6-9. (In Russ.).
  2. Satybayeva RТ. [Indications of application and evidence of selection of probiotics in practice pediatric doctor]. Meditsina (Almaty). 2018; 1(187): 28-34 (In Russ.)
  3. [General Pharmacopoeia Article 1.7.1.0008.15 Probiotics. In: State Pharmacopoeia of the Russian Federation]. XIV ed. Moscow, 2018; 2: 2596-2609. (In Russ.)
  4. Zabokritskiy N.A. [The biologically active substances produced probiotic microorganisms of the genera Bacillus and Lactobacillus]. Zdorovie i obrazovanie v XXI veke. Zhurnal nauchnyh statei 2015; 17(3): 80-90. (In Russ.).
  5. Zajnullina O.N., Khismatullina Z.R., Pechkurov D.V., Lyamin A.V. [Method for treating atopic dermatitis in children with probiotic preparations based on results of microbiological examination of feces]. Patent No. 2702229 C1 Russian Federation, IPC A61K 35/66, A61P 17/04. 07.10.2019.
  6. Ermolenko K.D., Boldyreva N.P., Martens E.A., Zhelezova L.I., Sidorenko S.V., Suvorov A.N., Ermolenko E.I. [The need for individual selection of probiotics containing lactobacilli and enterococci to increase the eff ectiveness of therapy for campylobacteriosis]. Eksp Klin Gastroenterol. 2021; 186(2): 88-93. (In Russ.)
  7. Chicherin I.Yu., Pogorelsky I.P., Lundovskih I.A., Darmov I.V., Gavrilov K.E., Pozolotina N.V. [Evolution of probiotics: historical assessment and prospects]. Dnevnik kazanskoi medicinskoi shkoly 2015; 1(7): 42-51. (In Russ.).
  8. Kryakvina E.V., Neborskaya Ju.A., Martirosyan E.A., Fatullaeva G.A., Shapoval O.G. [Antagonistic activity of probiotic strains of lactobacilli against Candida albicans fungi under conditions of joint cultivation]. Mezhdunarodnyi studencheskiy nauchnyi vestnik 2018; 6: 68. (In Russ.).
  9. Postnikova E.A., Efimov B.A., Volodin N.N., Kafarskaia L.I. [Search of promising strains of bifidobacteria and lactobacillus for the development of new biopreparations]. Zh Mikrobiol Epidemiol Immunobiol. 2004; 2: 64-9. (In Russ.).
  10. Pilipenko V.I. [Saccharomyces boulardii as a source of signalling molecules]. Voprosy dietologii 2014; 4(2): 30-7. (In Russ.).
  11. Kaibysheva V.O., Nikonov E.L. [Probiotics from the standpoint of evidence-based medicine]. Russian Journal of Evidence-Based Gastroenterology 2019; 8(3): 45-54. (In Russ.).
  12. Savustyanenko A.V. [Mechanisms of action of probiotics based on Bacillus subtilis]. Aktualnaya infektologiya 2016; 2(11): 35-44.
  13. Kuznetsova M.V., Maslennikova I.L., Žgur-Bertok D., Starčič E.M. [Conugative transfer of bacteriocin genes – new mechanism of antimicrobial action of probiotic preparations]. Perm Federal Research Centre Journal 2017; 4: 45-52. (In Russ.).
  14. Gritsenko V.A., Mrugova T.M., Kurlayev P.P., Belozertseva Y.P., Borisov S.D. [Antagonistic relationship Pseudomonas aeruginosa with gram-negative bacteria]. Bulleten Orenburgskogo nauchnogo centra UrO RAN 2016; 4: 1-11.
  15. Belushkina N.N., CHemezov A.N., Pal'cev M.A. Personalizirovannaya medicina: ot idei do vnedreniya v prakticheskoe zdravoohranenie. Molekulyarnaya medicina. 2018; 3: 9-15. doi.org/10.29296/24999490-2018-05-01
  16. Zatevalov A.M., Oganesyan A.S., Gudova N.V., Sel'kova E.P., Mironov A.YU. Prakticheskoe primenenie mikrobiom-associirovannoj metabolomiki dlya integral'noj ocenki sostoyaniya mikrobiocenoza respiratornogo trakta V sbornike: Perspektivy vnedreniya innovacionnyh tekhnologij v medicine i farmacii. Sbornik materialov VI Vserossijskoj nauchno-prakticheskoj konferencii s mezhdunarodnym uchastiem. 2019: 77-84.
  17. Medicinskaya mikrobiologiya, virusologiya i immunologiya: Uchebnik dlya studentov medicinskih vuzov / A. A. Vorob'yov, A. S. Bykov, M. N. Bojchenko [i dr.]. - 3-e izdanie, ispravlennoe. - M.: Izdatel'stvo «Medicinskoe informacionnoe agentstvo», 2022. - 704 s. ISBN 978-5-9986-0478-2.

Copyright (c) Eco-vector



СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).
Регистрационный номер и дата принятия решения о регистрации СМИ: 014448 от 08.02.1996
СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).
Регистрационный номер и дата принятия решения о регистрации СМИ: серия ЭЛ № ФС 77 - 80652 от 15.03.2021
.


This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies