Analysis of the gut microbiome of HIV-infected patients using 16s rRNA sequencing



Cite item

Full Text

Open Access Open Access
Restricted Access Access granted
Restricted Access Subscription or Fee Access

Abstract

Background: the microbiota of the gastrointestinal tract is one of the important factors that ensure the normal functioning of the human body. Patients with HIV infection are most susceptible to intestinal infections and changes in the composition of the microbiota, both due to exposure to the virus itself and as a result of reduced immunity. This article describes changes in the composition of the intestinal microflora of patients with HIV infection at the stage of secondary diseases, receiving antiretroviral therapy and not.

Aims: to determine the composition of the gut microbiome in patients with HIV infection on and off antiretroviral therapy using DNA sequencing of the hypervariable regions of the 16S rRNA gene.

Materials and methods: the object of the study was a group of patients in the amount of 10 people with a documented confirmed diagnosis of HIV infection and diarrheal syndrome. In order to clarify a possible etiological factor and determine the characteristics of the microbiocenosis of the gastrointestinal tract, stool analysis was performed using the 16s rRNA sequencing method.

Results: the study revealed significant changes in the composition of the microbiome: depletion of the Bacteroidetes type, increased number of the Proteobacteria type. A statically significant difference was found in the composition of the types of microbiota in healthy people and patients with HIV infection (p<0.05). The normal flora was represented by only two microorganisms: Bifidobacterium breve and Lactobacillus rhamnosus. Conditionally pathogenic microorganisms were identified: Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Citrobacter freundii, Enterococcus durans, Klebsiella sp., Pantoea agglomerans, Klebsiella variicola, Enterococcus hirae, Escherichia coli TOP550-1, Clostridioides difficile, Staphylococcus aureus. These bacteria may be the cause of diarrheal syndrome in patients with HIV infection.

Conclusions: HIV infection leads to a decrease in bacterial diversity, impoverishment of the normal flora, and the formation of a specific microbial profile. A number of conditionally pathogenic microorganisms can cause diarrhea in patients with HIV infection. Analysis of 16s rRNA sequencing can be used as a non-invasive method for diagnosing changes in the composition of the intestinal microflora and in order to clarify the etiological factor of diarrheal syndrome.

Full Text

Обоснование

Человеческий организм является не только совокупностью систем и органов, но целым царством микроорганизмов, которые объединяются в микробиом и микробиоценоз. Микробиом – совокупность всех генов микроорганизмов, которые находятся в теле человека, как в норме, так и при патологических состояниях. Это могут быть бактерии, грибы, вирусы, археи, простейшие. Микробиоценоз (микробиота) – микробное сообщество разных видов микроорганизмов в определенном биотопе. Считается, что около 40% представителей микробиоты обитает в кишечнике [1]. Микробиоценоз пищеварительного тракта – один из важнейших факторов, обеспечивающих нормальную жизнедеятельность человека. Метагеном фекальной микробиоты включает 9.9х106 микробных генов, что почти в 200 раз больше, чем геном человека [2]. В 2012 году опубликовано полное описание состава и разнообразия микробиомов пяти локализаций человеческого организма (кишечник, кожа, носовая полость, полость рта, влагалище) в дополнение к быстро увеличивающемуся числу статей, посвященных более специфическим микробиом-ассоциированным проектам (Human Microbiome Project Consortium, 2012). Было выявлено, что микробиом желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) и его метаболиты могут способствовать воспалению и иммунной активации у пациентов с ВИЧ-инфекцией, что может приводить к персистенции вируса, его активации и к повторному угнетению иммунной системы, даже у пациентов, получающих антиретровирусную терапию (АРТ) [3]. Это связано с нарушением целостности слизистой оболочки кишечника на фоне репликации ВИЧ в лимфоидной ткани пищеварительного тракта, которая сохраняется даже на фоне отсутствия либо низкой вирусной нагрузки РНК ВИЧ при приеме АРТ [4]. Пациенты из группы элитных контроллеров, у которых РНК ВИЧ не определяется без приема АРТ и сохраняется нормальный уровень CD4 + клеток в слизистой оболочке кишечника, отличаются более низкой иммунной активацией и меньшим резервуаром ВИЧ [5]. Было обнаружено, что элитные контроллеры имеют более разнообразный кишечный микробиом, в отличие от пациентов с ВИЧ на АРТ [6]. ВИЧ-инфекция уменьшает бактериальное разнообразие ЖКТ, что приводит к характерному микробному профилю. Различные схемы АРТ связаны с различными профилями микробиоты кишечника, и не все они способны восстановить ВИЧ-ассоциированное изменение состава микробиоценоза пищеварительного тракта. Точный механизм взаимодействия ВИЧ и микробиома не ясен. Восстановление состава, структуры и функции микробиома у пациентов с ВИЧ будет способствовать уменьшению количества вируса в организме и воспаления в кишечнике, тем самым улучшая прогноз лечения пациентов с ВИЧ-инфекцией. Использование последовательностей генов 16S рРНК для изучения филогении и таксономии бактерий является наиболее распространенным генетическим маркером, т. к. он присутствует почти во всех бактериях [7]. Совокупные результаты ограниченного числа исследований на сегодняшний день показывают, что секвенирование гена 16S рРНК обеспечивает идентификацию рода в большинстве случаев (>90%), но в меньшей степени в отношении видов (от 65 до 83%) [8, 9].  В результате данного анализа возможно: выявить тип микробиоты, определить дисбаланс нормофлоры, выявить патогенные и условно-патогенные микроорганизмы, ответственные за патологический процесс ЖКТ, основные различия в микробиоте в зависимости от статуса АРТ.

Цель исследования: определить состав микробиома кишечника у пациентов с ВИЧ-инфекцией на АРТ и вне АРТ с помощью секвенирования ДНК гипервариабельных регионов гена 16S рРНК.

Методы

Дизайн исследования

Объектом исследования была группа пациентов в количестве 10 человек, с документировано подтвержденным диагнозом ВИЧ-инфекции и диарейным синдромом, находившаяся на лечении в отделении интенсивной терапии (ОИТ) инфекционного стационара. Данная группа была разделена на 2 равные подгруппы: 1-я подгруппа – пациенты, получающие АРТ, 2-я подгруппа – пациенты, не получающие АРТ.

Критерии соответствия

Критерии включения в исследуемую группу: документировано подтвержденная ВИЧ-инфекция, стадия 4В, диарейный синдром, отрицательные результаты бактериологического исследования кала на кишечную группу, отрицательные результаты ПЦР тест-панели на возбудителей вторичных заболеваний и расширенной тест-панели на возбудителей острых кишечных инфекций (ОКИ). Критерии исключения: острая ВИЧ-инфекция, стадия 3, субклиническая, отсутствие диарейного синдрома, положительные результаты бактериологического исследования кала, положительные результаты молекулярно-биологического исследования, позволившие идентифицировать этиологию воспалительных изменений в ЖКТ.

Условия проведения

Набор пациентов проводился на базе ОИТ «Инфекционной клинической больницы №2 Департамента здравоохранения города Москвы». Лабораторное исследование кала методом 16s рРНК секвенирования осуществлялось ООО «БиоСпарк» г. Троицк.

Продолжительность исследования

Сбор биологического материала осуществлялся в 2020 году с последующей заморозкой. В 2021 году проведено 16s рРНК секвенирование с последующей обработкой полученных данных.

Описание медицинского вмешательства

Дизайн исследования не предусматривал дополнительных медицинских вмешательств помимо мероприятий, предусмотренных клиническими рекомендациями по ведению взрослых больных с ВИЧ-инфекцией. Лабораторный этап исследования предполагал углубленный поиск этиологического агента диарейного синдрома и описание микробного разнообразия ЖКТ ВИЧ-инфицированных больных. С этой целью был проведен анализ кала методом 16s рРНК секвенирования.

Исходы исследования

Основной исход исследования: определение микробного разнообразия ЖКТ у ВИЧ-инфицированных больных с диарейным синдромом с представлением полученных результатов в градации по типам, классам, порядкам, семействам, родам и видам персистировавших микроорганизмов, а также возможные различия в структуре микроорганизмов в зависимости от статуса антиретровирусной терапии (АРТ).

Дополнительные исходы исследования: выявление различий энтеротипа микробиоты ЖКТ ВИЧ-инфицированных больных с диарейным синдромом от здоровых лиц.

Анализ в подгруппах

Единственным критерием для формирования двух подгрупп являлось наличие или отсутствие АРТ.

Методы регистрации исходов

Методика основана на определении консервативного гена каждого микроорганизма. Основные этапы исследования: подготовка образцов с помощью двухстадийной полимеразной цепной реакции (ПЦР), очистка ампликонов на магнитных частицах, измерение концентрации флуориметрическим методом, мультиплексное сканирование на платформе Illumina, анализ ДНК на секвенаторе Illumina MiSeq. Обработка данных секвенирования проведена с использованием автоматизированного алгоритма QIIME 1.9.1. Использован алгоритм классификации операционных таксономических единиц (ОТЕ) с открытым референсом (Open-reference OTU). Порог классификации 97%.

Этическая экспертиза

Проверки протокола исследования этическим комитетом не проводилось, так как дизайн работы предполагал исключительно лабораторный анализ полученного биологического материала, взятого в соответствии с алгоритмом диагностики больного с диарейным синдромом.

Статистический анализ

Принципы расчета размера выборки: размер выборки предварительно не рассчитывался.

Методы статистического анализа данных: Статистический анализ проводился с использованием программы StatTech v. 2.6.7 (разработчик - ООО "Статтех", Россия).

Результаты

Объекты (участники) исследования

В 1-й подгруппе было 4 мужчины и 1 женщина. Медиана возраста – 47. Всем пациентам из первой группы АРТ была назначена до госпитализации и был отмечен длительный прием терапии (более 1 года). Препараты АРТ, которые были назначены: ингибиторы протеазы (ИП), нуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы (НИОТ). Во второй группе все пациенты не получали АРТ. Среди них было 3 мужчины, 2 женщины. Медиана возраста – 44. В первой группе выжило 3 пациента, у двух пациентов был летальный исход. Все пациенты из второй группы были с летальным исходом.

Основные результаты исследования

В 1-й подгруппе было 4 мужчины и 1 женщина. Медиана возраста – 47. Всем пациентам из первой группы АРТ была назначена до госпитализации и был отмечен длительный прием терапии (более 1 года). Препараты АРТ, которые были назначены: ингибиторы протеазы (ИП), нуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы (НИОТ). Во второй группе все пациенты не получали АРТ. Среди них было 3 мужчины, 2 женщины. Медиана возраста – 44. В первой группе выжило 3 пациента, у двух пациентов был летальный исход. Все пациенты из второй группы были с летальным исходом.

В 1-й группе классифицировано от 9355 до 11086 последовательностей, из них уникальных последовательностей 236. Во 2-й группе было классифицировано от 7832 до 14843, из них уникальных – 360. Полученные данные позволяют сделать выводы, что во 2-й группе вариабельность и разнообразие кишечной микрофлоры были больше, чем в группе на АРТ.  Оценка микробиома включает следующие основополагающие понятия: плотность микробиома, разнообразие микробиома, альфа-разнообразие и токсономию выявленного разнообразия (типы, классы, порядки, семейства, роды и виды микроорганизмов).

Показатель «плотность микробиома» оценивает общее количество бактерий в биологическом образце. У пациентов на АРТ плотность микробиома была выше, чем у пациентов вне АРТ (1-я группа – 53223, 2-я группа – 52051). Однако разница статистически не значима (p=0,884). Разнообразие микробиома – это количество различных видов/ОТЕ бактерий в образце. Разнообразие микробиома было выше у пациентов 2-й группы (количество уникальных бактерий у пациентов на АРТ – 1070, у пациентов вне АРТ – 1245). Разница статистически не значима (p=0,285). Альфа-разнообразие – это разнообразие видов в пределах биологического образца. Альфа-разнообразие рассчитывалось при помощи индекса разнообразия Симпсона. Индекс разнообразия был высоким в 2-х подгруппах. С небольшим преимуществом в первой подгруппе. В первой подгруппе составил 0,7987. Во второй подгруппе 0,7894.

В нашем исследовании кишечный микробиом был представлен следующими типами микроорганизмов: Proteobacteria (90,34%), Firmicutes (61,86%), Actinobacteria (5,59%), Cyanobacteria (0,18%), Verrucomicrobia (37,95%), Bacteroidetes (3,87%), Fusobacteria (0,016%), Tenericutes (0,016%), Patescibacteria (0,006%), Spirochaetes (0,004%). По данным исследования американской программы Human Microbiome Project (HMP) в норме у взрослых кишечная микрофлора представлена двумя преобладающими типами: Bacteroidetes (75,7%) и Firmicutes (20,5%), остальные типы составляют 3,8% [10]. При сравнении с полученными данными мы обнаружили выраженный дисбаланс в составе микробиоты и значительное снижение типа Bacteroidetes у ВИЧ-инфицированных больных. Установлена статически значимая разница в составе типов микробиоты здоровых людей и пациентов из 1-й и 2-й подгрупп (p<0,05) – рисунок 1.

Получены результаты сравнения по классам, порядкам, семействам, родам и видам микроорганизмов, далее представлены различия, имеющие практическое значение. Количество типа было Proteobacteria выше у пациентов вне АРТ: 55,22% во второй подгруппе, 35,12% в первой подгруппе, однако выявленная зависимость статистически не значима (p=0,094; p>0,05). В то время, как представители типа Firmicutes в большем количестве находились в образцах первой подгруппы: 34,1% и 27,76% соответственно (однако разница статистически не значима, p=0,716). Тип Actinobacteria превалировал во второй подгруппе (вне АРТ): 4,03% и 1,56% (p=0,3). Cyanobacteria были в небольшом количестве в обеих подгруппах и более выражены в первой подгруппе (у пациентов на АРТ): 0,14% и 0,04% (p=0,151). Такой тип микроорганизмов, как Verrucomicrobia в значительном количестве были выявлены в образцах кала пациентов на АРТ: 25,23% и 12,72% (p=0,622). Bacteroidetes также в большем количестве находились в образцах первой подгруппы: 3,7% и 0,17% соответственно (p=0,383). Fusobacteria были выделены в равном количестве (0,008% в 1-й и во 2-й группе). В группе пациентов, получающих АРТ были обнаружены Tenericutes (0,016%). Patescibacteria и Spirochaetes были выявлены только во 2-й подгруппе (у пациентов вне АРТ): 0,006% и 0,004% соответственно.

Из биоматериала в ходе исследования были выявлены следующие классы микроорганизмов: Gammaproteobacteria, Bacilli, Erysipelotrichia, Clostridia, Coriobacteriia, Actinobacteria, Negativicutes, Oxyphotobacteria, Verrucomicrobiae, Alphaproteobacteria, Bacteroidia, Fusobacteriia, Mollicutes, Saccharimonadia, Spirochaetia.

Класс Gammaproteobacteria преобладал в материалах пациентов вне АРТ: 55,15% и 35,1% (p=0,094). К ним относятся патогенные микроорганизмы: Salmonella spp., Yersinia pestis, Vibrio cholerae, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli. Класс Bacilli также превалировал у подгруппы пациентов вне АРТ: 18,4% и 14,89% соответственно (p=0,76). Класс Erysipelotrichia преобладал в подгруппе на АРТ: 0,83% и 0,598% (p=0,747). Класс Clostridia был выявлен в большем количестве у пациентов, получающих АРТ – 18,49%, у пациентов вне АРТ – 8,77% (p=0,594). Такие классы, как Coriobacteriia, Negativicutes, Oxyphotobacteria, Verrucomicrobiae, Bacteroidia преобладали в материале пациентов, получающих АРТ (p>0,05). Actinobacteria, Alphaproteobacteria – в группе вне АРТ (p>0,05). Класс Mollicutes был выявлен только в группе на АРТ – 0,016%. А классы Saccharimonadia (0,006%), Spirochaetia (0,004%) были обнаружены у пациентов, не получающих АРТ. Была выявлена корреляционная связь между количеством Actinobacteria и исходом заболевания (p = 0,017).

Нами были исследованы также порядки микроорганизмов. Были обнаружены: Enterobacteriales, Lactobacillales, Erysipelotrichales, Clostridiales, Coriobacteriales, Bifidobacteriales, Selenomonadales, Chloroplast, Betaproteobacteriales, Verrucomicrobiales, Bacillales, Sphingomonadales, Bacteroidales, Micrococcales, Corynebacteriales, Rickettsiales, Propionibacteriales, Fusobacteriales, Pseudomonadales, Mollicutes RF39, Xanthomonadales, Rhizobiales, Saccharimonadales, Spirochaetales. Порядок Enterobacteriales преобладал у пациентов вне АРТ: 54,75% и 34,89% (p=0,0094). Lactobacillales также в большем количестве были выявлены у пациентов вне АРТ: 18,32% и 14,86% (p=0,763). Была выявлена значительная разница в соотношении порядка Clostridiales в данных подгруппах: на АРТ – 18,32%, вне АРТ – 8,76% (p=0,602). Следует отметить значительное снижение порядка Bifidobacteriales в двух подгруппах: в 1-й группе (на АРТ) – 0,23%, во 2-й группе (вне АРТ) – 0,08% (p=0,478). Большое содержание Verrucomicrobiales было выявлено в двух подгруппах в сравнении с другими порядками, преобладали они в 1-й группе: 25,24% и 12,71% (p=0,622).

В ходе исследования были установлены следующие семейства микроорганизмов ЖКТ: Enterobacteriaceae, Enterococcaceae, Streptococcaceae, Lactobacillaceae, Erysipelotrichaceae, Lachnospiraceae, Eggerthellaceae, Clostridiaceae 1, Bifidobacteriaceae, Peptostreptococcaceae, Ruminococcaceae, Veillonellaceae, Burkholderiaceae, Akkermansiaceae, Paenibacillaceae, Sphingomonadaceae, Prevotellaceae, Carnobacteriaceae, Family XI, Family XIII, Micrococcaceae, Corynebacteriaceae, Prevotellaceae, Staphylococcaceae, Carnobacteriaceae, Propionibacteriaceae, Atopobiaceae, Fusobacteriaceae, Leptotrichiaceae,  Moraxellaceae, Pseudomonadaceae, Rikenellaceae, Mitochondria, Tannerellaceae, Bacteroidaceae, Christensenellaceae, Barnesiellaceae, Marinifilaceae, Acidaminococcaceae, Coriobacteriales Incertae Sedis, Xanthomonadaceae, Rhizobiaceae, Neisseriaceae, Spirochaetaceae, Barnesiellaceae. Семейство Enterobacteriaceae преобладало у пациентов вне АРТ – 54,74%, у пациентов на АРТ составляло 34,9% (p=0,088). Семейство Enterococcaceae были выявлены в равном количестве в двух подгруппах: 11,94% в первой подгруппе и 11,36% во второй подгруппе (p=0,944). Семейство Streptococcaceae было выявлено в небольшом количестве, с преимуществом во второй подгруппе: 6,53% - у пациентов вне АРТ, 2,48% - у пациентов на АРТ (p=0,263). В составе кишечной микробиоты ВИЧ-инфицированных пациентов было выявлено одно из важных семейств резидентной микрофлоры кишечника - Lachnospiraceae. Микроорганизмы данного семейства содержались в низком одинаковом количестве в двух подгруппах: 3,49% у пациентов на АРТ и 3,006% у пациентов вне АРТ (p=0,895). Семейство Ruminococcaceae также относится к резидентной микрофлоре толстого кишечника. В нашем исследовании данное семейство превалировало у пациентов, получающих АРТ (12,38%) и значительно было снижено в группе пациентов вне АРТ (3,38%) (p=0,536). Семейство Akkermansiaceae превалировало у пациентов на АРТ – 25,24%, во второй подгруппе (вне АРТ) – 12,71% (p=0,622).

В нашем исследовании было выявлено 112 родов микроорганизмов ЖКТ. Род Escherichia-Shigella встречался чаще у пациентов вне АРТ: 41,38% и 19,86% (p=0,157). В данный род входят как патогенные штаммы шигелл, энтероинвазивные штаммы E. coli, так и условно-патогенные штаммы E. coli. Род Enterococcus чаще встречался у пациентов 1-й подгруппы (на АРТ): 19,94% и 11,36% (p=0,944). В данный род входит условно-патогенная грамположительная флора кишечника, способная при избыточном росте вызывать воспалительные заболевания различных органов и систем. Таким образом пациенты на АРТ более подвержены бактериальной транслокации энтерококков и как следствие развитию клинически значимых инфекций.  Был выявлен один из наиболее значимых для наших пациентов родов микроорганизмов ЖКТ, род Klebsiella. В 1-й подгруппе его количество составило 14,18%; во 2-й – 12,14% (p=0,794). Из чего следует, что этиологией диарейного синдрома у пациентов с ВИЧ-инфекцией могли послужить бактерии рода Klebsiella. В биоматериале наших пациентов были выявлены и представители нормофлоры – Lactobacillus и Bifidobacterium. У пациентов на АРТ род Lactobacillus был в большем количестве – 0,43%, у пациентов вне АРТ – 0,036% (p=0,366). Род Bifidobacterium в 1-й подгруппе был выявлен в 0,23%, во 2-й подгруппе в 0,078% (p=0,48). Принимая во внимание полученные данные о количестве нормофлоры, можно сделать вывод, что длительная ВИЧ-инфекция более пагубно влияет на микробиом, чем прием АРТ. У пациентов с ВИЧ-инфекцией на стадии вторичных заболеваний 4В в материале был выявлен род Clostridioides практически в равном количестве в двух подгруппах: в 1-й - 1,096%, во 2-й - 1,02% (p=0,96). В данный род входит Clostridioides difficile, что позволяет предположить возможность развития клостридиального колита у наших пациентов. Род Akkermansia превалировал в первой подгруппе – 25,24%, во второй фиксировался в 12,71% (p=0,622). Данный род описан недавно, в 2004г. Главный представитель данного рода - Akkermansia muciniphila. Поедая муцин, она, уменьшает защитный слой, но в то же время стимулирует в слизистой его выработку, а продукты переработки муцина служат пищей для других «полезных» бактерий [13]. Род Prevotella был выделен в небольшом количестве в двух подгруппах: во второй подгруппе – 0,002%; в первой подгруппе определялся в 0,0018% (p=0,647). Род Prevotella 2 также был выделен в большем проценте во второй подгруппе – 0,006%; в первой подгруппе – 0,0018% (p=0,564). Как и род Prevotella 7: 0,01% в первой подгруппе, 0,002% во второй подгруппе (p=0,273). Род Prevotella 9 был в большем количестве выделен в первой подгруппе – 0,69%; 0,022% во второй подгруппе (p=0,382). Данный род относится к нормальной микрофлоре ротовой полости, верхних дыхательных путей и желудка, однако при избыточной росте и низком иммунитете могут вызывать анаэробные инфекции различных органов и систем [14]. Во второй группе в большей степени был выявлен род Streptococcus – 5,82%, в первой – 2,24% (p=0,242). Среди данного рода есть представители нормальной микрофлоры кишечника и возбудители инфекционных процессов. Род Lactococcus преобладал во второй подгруппе, у пациентов вне АРТ: 1,046% и 0,238% (p=0,266). Бактерии данного рода продуцируют один продукт – молочную кислоту. Род Staphylococcus определялся в небольшом количестве в двух группах: 0,024% и 0,07% (p=0,178). Род Roseburia был выявлен только у пациентов на АРТ – 0,93%. Данные бактерии являются одними из основных продуцентов масляной кислоты в толстой кишке [15]. Род Alistipes, являющийся нормальной пристеночной микробиотой кишечника (продуцируют янтарную и уксусную кислоту), преобладал в первой подгруппе - 1,456%, во второй подгруппе 0,064% (p=0,364). Род Family XIII AD3011 group преобладал во второй группе: 1,338% и 0,036% (p=0,388). Бактерии данного рода влияют на липидный обмен [16]. Были выявлены «полезные» бактерии рода [Eubacterium] hallii group, которые продуцируют важную для физиологии человека масляную кислоту, являются лактат-утилизирующими бактерией, предотвращающей накопление лактата в толстой кишке [17]. Они преобладали в первой подгруппе - 0,208%, во второй подгруппе составили 0,054% (p=0,53). Отмечается выраженное обеднение рода Bacteroides: в первой группе данный род составил 1,164%, а во второй группе – 0,05% (p=0,397). Бактерии данного рода – это наиболее типичные нормальные обитатели кишечника.

В ходе нашего исследования были выявлены следующие виды микроорганизмов: Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis, Bifidobacterium breve, Escherichia coli, Lactobacillus rhamnosus, Klebsiella pneumoniae, Citrobacter freundii, Enterococcus durans, Klebsiella sp., Pantoea agglomerans, Klebsiella variicola, Enterococcus hirae, Escherichia coli TOP550-1, Clostridioides difficile, Staphylococcus aureus. Условно патогенные виды преобладали над нормофлорой. Условно-патогенные: Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Citrobacter freundii, Enterococcus durans, Klebsiella sp., Pantoea agglomerans, Klebsiella variicola, Enterococcus hirae, Escherichia coli TOP550-1, Clostridioides difficile, Staphylococcus aureus. Нормофлора: Bifidobacterium breve, Lactobacillus rhamnosus. Выявленные условно-патогенные микроорганизмы могут служить этиологическим фактором диареи у ВИЧ-инфицированных пациентов. Значительное обеднение нормофлоры ухудшает прогноз заболевания, так как уменьшается резистентность колонизации, снижается местный иммунитет, нарушается кишечный гомеостаз. 

Был проведен корреляционный анализ зависимости состава микробиоты и уровнем иммунодефицита, количеством оппортунистов, количеством сопутствующих заболеваний, уровнем вирусной нагрузки и исходом. Была выявлена одна корреляционная связь между количеством Actinobacteria и исходом заболевания (p = 0,017). Остальные зависимости статически не были значимы.

Дополнительные результаты исследования

Согласно Human Microbiome Project (открытие 2011г по данным Science) выделяют 3 ведущих энтеротипа микробиоты ЖКТ человека (в зависимости от преобладающего рода микроорганизмов): 1-й энтеротип с преобладанием Bacteroides, 2-й энтеротип с преобладанием Prevotella, 3-й энтеротип с преобладанием Ruminococcus. Энтеротип каждого человека уникален.  Представители различных энтеротипов характеризуются определенными функциональными особенностями. Считается, что энтеротип индивидуален и не зависит от места жительства, питания и др. факторов. Энтеротип Bacteroides отличается активностью в отношении гидролиза углеводов и белков. Можно предположить, что лица, относящиеся к первому энтеротипу, реже страдают атеросклерозом. Условно-патогенные бактерии рода Prevotella в процессе жизнедеятельности разрушают защитный слизистый покров, что скорее всего приводит к дефектам слизистой оболочки кишечника. Ruminococcus, наоборот, улучшают всасывание углеводов и повышают уровень сахара в крови. Они синтезируют фолиевую кислоту и витамин B11. Таким образом, знание энтеротипа позволит прогнозировать особенности обмена веществ, предрасположенность к конкретным заболеваниям, метаболизм лекарственных препаратов. Согласно проведенному исследованию, в США (Human Microbiome Project, в 2011г) у здоровых лиц был выявлен 1-й энтеротип с преобладанием Bacteroides. В Европе также был выполнен анализ энтеротипов (Metagenomics of human intestinal tract), в результате которого также определялся 1-й энтеротип. Согласно среднестатистическим данным холдинга «Атлас», в РФ также преобладает 1-й энтеротип. Различия по энтеротипам у здоровых лиц и анализируемых группах представлены в таблице 1.  Из полученных данных следует, что пациенты 2-х исследуемых подгрупп относятся к 3-му энтеротипу с преобладанием рода Ruminococcus.

Нежелательные явления

Наличие или отсутствие нежелательных явлений в нашем исследовании отсутствует, так как не подразумевалось воздействия на пациента.

Обсуждение

Обсудить не только достоинства, но и возможные недостатки, в том числе систематические смещения и ограничения исследования.

Резюме основного результата исследования

Результатом исследования микробиома ВИЧ-инфицированных больных с диарейным синдромом стало получение данных о значительном снижении его разнообразия по сравнению со здоровыми лицами. Выявлены различия микробиоценоза в зависимости от наличия АРТ. Получены данные о наличии условно патогенной флоры, которая может являться этиологическим фактором патологических процессов в ЖКТ у иммунодефицитных больных. Также получены данные о снижении нормофлоры ЖКТ, что стало прогностически неблагоприятным фактором.

Обсуждение основного результата исследования

Согласно данным мировой литературы у пациентов с длительно протекающей ВИЧ-инфекцией, не получающих АРТ, в составе микробиома протекают следующие изменения: снижение разнообразия микробиома, низкое содержание Firmicutes и повышенное содержание Fusobacteria, в сравнении с неинфицированными людьми, а также обилие Prevotellaceae, Erysipelotrichaceae и Veillonellaceae, повышенное содержание Proteobacteriae и Prevotella, со снижением обилия Bacteroidetes [18]. В нашем исследовании также выявлено снижение разнообразия микробиома. Однако содержание Firmicutes было высоким, с преимуществом у пациентов на АРТ. Fusobacteria также определялись, но в небольшом титре и в равном количестве в двух группах. Prevotellaceae, Erysipelotrichaceae и Veillonellaceae у наших пациентов определялись в небольшом количестве. А вот Proteobacteriae преобладали, особенно в группе вне АРТ, и выявлялись в большом количестве. Род Prevotella преобладал во второй группе и выявлялся в небольшом титре. Обращало на себя внимание значительное снижение обилия типа Bacteroidetes, особенно во второй группе. Диллон С.М. с соавторами [19] также исследовали изменения в микробиоте слизистой оболочки толстого кишечника между ВИЧ-позитивными людьми и здоровыми. В десяти наиболее распространенных семействах бактерий они обнаружили значительное увеличение семейств Prevotellaceae и Ruminococcaceae и значительное снижение семейств Bacteroidaceae и Lachnospiraceae у ВИЧ-позитивных людей по сравнению со здоровыми. В нашем исследовании также наблюдается увеличение Ruminococcaceae и значительное снижение семейств Bacteroidaceae и Lachnospiraceae. В описанных исследованиях, изучавших влияние длительного приема АРТ на микробиом ВИЧ-инфицированных пациентов, отмечается снижение альфа-разнообразия, увеличение содержания рода Prevotella, значительное снижение типа Bacteroidetes [20]. Проанализировав результаты нашего исследования, не было выявлено обилия рода Prevotella, но также обращало на себя внимание истощение типа Bacteroidetes. Все различия в составе типов, классов, порядков, семейств, родов и видов в двух подгруппах статистически были не значимы (p>0,05), вероятнее всего это связано с малой выборкой исследования (n=10), сопряженной с высокой стоимостью на данный момент. В результате анализа зависимости между составом микробиоты и исходом заболевания была выявлена корреляционная связь между количеством Actinobacteria и исходом заболевания (p = 0,017), что доказывает роль данного типа в улучшении прогноза заболевания. К данному типу относятся бифидумбактерии. Из чего можно выдвинуть гипотезу, что, повышая уровень данных бактерий в составе кишечной микрофлоры, мы можем улучшить прогноз заболевания.

Ограничения исследования

Для подтверждения результатов нашего исследования и экстраполяции полученных выводов на всю популяцию ВИЧ-инфицированных больных с диарейным синдромом необходимо продолжение работы с использованием метода 16s рРНК секвенирования на большей выборке с учетом формирования подгрупп различных по возрасту, географии, схемам АРТ и сопутствующей патологии.

Заключение

В ходе нашего исследования выявлены значительные изменения в составе микробиома ВИЧ-инфицированных больных: обеднение типа Bacteroidetes, повышенное число типа Proteobacteria. Установлена статически значимая разница в составе типов микробиоты здоровых людей и пациентов c ВИЧ-инфекцией (p<0,05). Количество типа Proteobacteria было выше у пациентов вне АРТ. В то время как Firmicutes в большем количестве находились в образцах первой подгруппы. Actinobacteria превалировали во второй группе (вне АРТ). Cyanobacteria были в небольшом количестве в обеих группах и более выражены в первой группе. Была выявлена значительная разница в соотношении порядка Clostridiales: данный порядок в большем количестве был выявлен у пациентов на АРТ.

Нормофлора была представлена всего лишь двумя микроорганизмами: Bifidobacterium breve и Lactobacillus rhamnosus, последний преобладал у пациентов, получавших АРТ. Из этого можно высказать предположение, что у пациентов с ВИЧ-инфекцией наблюдается значительное снижение представителей «полезной микрофлоры». И как само заболевание вызывает истощение данного звена микробиома, так и АРТ приводит к схожему процессу.

В результате нашего исследования получены новые данные о составе кишечного микробиома пациентов с ВИЧ-инфекцией, что вносит существенный вклад в понимание патогенеза развития диарейного синдрома. Были выявлены условно-патогенные виды микроорганизмов: Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Citrobacter freundii, Enterococcus durans, Klebsiella sp., Pantoea agglomerans, Klebsiella variicola, Enterococcus hirae, Escherichia coli TOP550-1, Clostridioides difficile, Staphylococcus aureus. Данные бактерии могут быть причиной диарейного синдрома у пациентов с ВИЧ-инфекцией.

В результате проведенного анализа микробиоты ЖКТ установлен энтеротип ВИЧ-инфицированных пациентов – 3-й энтеротип с преобладанием рода Ruminococcus. Показана возможность неинвазивной оценки состояния микробиоты желудочно-кишечного тракта с использованием анализа 16s РНК секвенирования.  Применение данного анализа возможно у пациентов с неустановленным этиологическим фактором диареи. Полученные нами результаты доказывают истощение нормальной микрофлоры кишечника, повышение числа условно-патогенной микрофлоры, которое требует коррекции пробиотическими препаратами. Применение пре-, про- и симбиотиков может улучшить исход заболевания.

Таблицы

Таблица 1. Сравнительная характеристика энтеротипов здоровых лиц РФ, США, Европы и анализируемых подгрупп [11, 12]. Comparative characteristics of enterotypes of healthy individuals of the Russian Federation, USA, Europe and analyzed subgroups [11, 12].

Типы

РФ (средняя статистика биомедицинского холдинга «Атлас», 2017)

США (Human Microbiome Project, HMP, 2011)

Европа (Metagenomics of human intestinal tract, MetHIT, 2011)

ВИЧ-инфекция на АРТ

ВИЧ-инфекция, вне АРТ

Bacteroides

11,83%

51,1%

21,8%

1,16%

0,05%

Prevotella

10,99%

5,7%

11,8%

0,76%

0,05%

Ruminococcus

4,01%

3,7%

6%

4,82%

0,15%

 

Рисунки

Рисунок 1. Основные типы микроорганизмов ЖКТ здоровых людей, пациентов с ВИЧ-инфекцией на АРТ и вне АРТ. The main types of gastrointestinal microorganisms of healthy people, patients with HIV infection on ART and outside ART.

×

About the authors

Darya Popova

Infectious Diseases Clinical Hospital No 2 Moscow; Peoples Friendship University of Russia (RUDN University), Moscow, Russia

Email: popova-d@rudn.ru
ORCID iD: 0000-0002-4056-9192

врач-инфекционист

Russian Federation, 8 - Sokolinaya Gora St., 1052754 Moscow Russia

Sergey Voznesenskiy

Peoples Friendship University of Russia (RUDN University), Moscow, Russia

Author for correspondence.
Email: voznesenskiy-sl@rudn.ru
ORCID iD: 0000-0001-5669-1910
SPIN-code: 4487-6744

Associate professor, RUDN University, Medical Institute, Department of infectious diseases with the courses of Epidemiology and Tuberculosis.

Russian Federation, 6 Miklukho-Maklaya street, 117198 Moscow, Russia

Elena Petrova

Infectious Diseases Clinical Hospital No 2 Moscow

Email: evi1963@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-6896-6851

Заведующий отделением интенсивной терапии

Russian Federation, 8 - Sokolinaya Gora St., 1052754 Moscow Russia

Polina Klimkova

Infectious Diseases Clinical Hospital No 2 Moscow

Email: pvk20@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-6046-7815

врач-инфекционист

Russian Federation, 8 - Sokolinaya Gora St., 1052754 Moscow Russia

References

  1. [Stoma I.O. Microbiome in medicine: a guide for medical doctors / Moskva: GEOTAR-Media, 2020, p. 14 – doi: 10.33029/9704-5844-0-MIM-2020-1-320. (In Russ.).]
  2. Qin J, Li R, Raes J et al. A human gut microbial gene catalogue established by metagenomic sequencing. Nature. 2010 Mar 4;464(7285):59-65. doi: 10.1038/nature08821. PMID: 20203603; PMCID: PMC3779803.
  3. Massanella M, Fromentin R, Chomont N. Residual inflammation and viral reservoirs: alliance against an HIV cure. Curr Opin HIV AIDS. 2016 Mar;11(2):234-41. doi: 10.1097/COH.0000000000000230. PMID: 26575148; PMCID: PMC4743501.
  4. Chun TW, Nickle DC, Justement JS et al. Persistence of HIV in gut-associated lymphoid tissue despite long-term antiretroviral therapy. J Infect Dis. 2008 Mar 1;197(5):714-20. doi: 10.1086/527324. PMID: 18260759.
  5. Buckheit RW 3rd, Salgado M, Martins KO, Blankson JN. The implications of viral reservoirs on the elite control of HIV-1 infection. Cell Mol Life Sci. 2013 Mar;70(6):1009-19. doi: 10.1007/s00018-012-1101-7. Epub 2012 Aug 4. PMID: 22864624.
  6. Vesterbacka J, Rivera J, Noyan K et al. Richer gut microbiota with distinct metabolic profile in HIV infected Elite Controllers. Sci Rep. 2017 Jul 24;7(1):6269. doi: 10.1038/s41598-017-06675-1. PMID: 28740260; PMCID: PMC5524949.
  7. Patel JB. 16S rRNA gene sequencing for bacterial pathogen identification in the clinical laboratory. Mol Diagn. 2001 Dec;6(4):313-21. doi: 10.1054/modi.2001.29158. PMID: 11774196.
  8. Drancourt M, Bollet C, Carlioz A et al. 16S ribosomal DNA sequence analysis of a large collection of environmental and clinical unidentifiable bacterial isolates. J Clin Microbiol. 2000 Oct;38(10):3623-30. doi: 10.1128/JCM.38.10.3623-3630.2000. PMID: 11015374; PMCID: PMC87447.
  9. Mignard S, Flandrois JP. 16S rRNA sequencing in routine bacterial identification: a 30-month experiment. J Microbiol Methods. 2006 Dec;67(3):574-81. doi: 10.1016/j.mimet.2006.05.009. Epub 2006 Jul 21. PMID: 16859787.
  10. https://www.rmj.ru/articles/gastroenterologiya/Kishechnaya_mikrobiota_sovremennye_predstavleniya_o_vidovom_sostave_funkciyah_i_metodah_issledovaniya/.
  11. https://www.rmj.ru/articles/gastroenterologiya/Kishechnaya_mikrobiota_sovremennye_predstavleniya_o_vidovom_sostave_funkciyah_i_metodah_issledovaniya/.
  12. http://propionix.ru/metagenomika-i-mikrobiom.
  13. https://atlas.ru/blog/baktierii-akkermansia-chto-eto-i-kak-povysit-ikh-sodierzhaniie-v-kishiechnikie/.
  14. https://www.gastroscan.ru/handbook/118/7105.
  15. https://www.gastroscan.ru/handbook/118/7643.
  16. https://translated.turbopages.org/proxy_u/en-ru.ru.16eb2eb4-625d5fda-b4817cc0-74722d776562/https/www.frontiersin.org/articles/10.3389/fmicb.2021.805827/ful.
  17. https://www.gastroscan.ru/handbook/118/8843.
  18. https://translated.turbopages.org/proxy_u/en-ru.ru.241b1e95-6272e9d6-99b850b9-74722d776562/https/www.frontiersin.org/articles/10.3389/fmicb.2019.01104/full.
  19. Dillon SM, Lee EJ, Kotter CV et al. An altered intestinal mucosal microbiome in HIV-1 infection is associated with mucosal and systemic immune activation and endotoxemia. Mucosal Immunol. 2014 Jul;7(4):983-94. doi: 10.1038/mi.2013.116. Epub 2014 Jan 8. PMID: 24399150; PMCID: PMC4062575.
  20. https://www.nature.com/articles/s41598-020-80247-8?error=cookies_not_supported&code=6c59aeed-cf0c-4b0b-9cf3-219e613df521.

Copyright (c) Eco-vector



СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).
Регистрационный номер и дата принятия решения о регистрации СМИ: 014448 от 08.02.1996
СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).
Регистрационный номер и дата принятия решения о регистрации СМИ: серия ЭЛ № ФС 77 - 80652 от 15.03.2021
.


This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies