Development of an INDEL typing system for ctx+ strains of Vibrio cholerae from the seventh pandemic

全文:

Седьмая пандемия холеры сопровождается формированием клонов холерного вибриона с новыми генетическими свойствами, в том числе обладающих способностью к пандемическому распространению и вызывающих заболевания с более тяжелым клиническим течением [1-3]. Повсеместное распространение подобных генетических вариантов V. cholerae и возможность их завоза на территорию Российской Федерации обусловливают необходимость постоянного комплексного мониторинга с применением современных молекулярно-генетических технологий, обеспечивающих ускоренную диагностику, своевременную идентификацию с определением эпидемической значимости возбудителя холеры для принятия оперативных управленческих решений [4, 5].

Молекулярно-генетический мониторинг V. cholerae основан на анализе ряда хорошо изученных генетических маркеров. Широкое распространение получили методы анализа VNTR- и INDEL-локусов. На основании определения кратности вариабельных тандемных повторов (VNTR) предложен и широко используется довольно сложный и трудоемкий метод VNTR-типирования токсигенных V. cholerae, изолированных в различных регионах мира [7-11]. Довольно высокая стабильность VNTR-локусов способствует получению достоверных результатов [12]. В последнее время VNTR-типирование успешно используется в сочетании с приемом полногеномного секвенирования [10, 13-15].

Метод INDEL-типирования более прост и доступен и основан на определении наличия «вставок-делеций» (INsertion-DELetion) в различных генах [16]. Каждый из методов INDEL- и VNTR-типирования имеет свои достоинства, но наиболее информативные результаты получены при сочетании двух приемов типирования [17].

Однако сравнительно простой в использовании прием INDEL-типирования V. cholerae хорошо подходит лишь для изучения нетоксигенных штаммов [17], но не позволяет проводить внутривидовое типирование токсигенных штаммов, поскольку все ctx+ культуры при используемом наборе INDEL-локусов формируют лишь один INDEL-генотип [16]. Цель работы: совершенствование INDEL-типирования ctx+ штаммов V. cholerae седьмой пандемии  путем использования дополнительных INDEL-локусов.

Материалы и методы

В работе использованы данные полногеномного секвенирования токсигенных (ctxAB+tcpA+) штаммов V. cholerae О1 El Tor, полученные на платформе Illumina MiSeq в ходе выполнения стратегической инициативы социально-экономического развития Российской Федерации до 2030 года «Санитарный щит страны – безопасность для здоровья (предупреждение, выявление, реагирование)» (40 штаммов), 1531 геномов из базы данных NCBI и 534 геном из базы ENA (European Nucleotide Archive), представленных в виде ридов, сборку которых проводили с использованием программы Spades [18]. Информацию о дате выделения и месте изоляции штамма получали из прилагаемого описания [19].

Для анализа использовали собственные скрипты, написанные на языках программирования Java и Python. Геокодирование мест выделения штаммов проводили с использованием API-сервиса Nominatum. Разработку онлайн ГИС осуществляли с использованием языков программирования HTML, JavaScript и PHP. В качестве ядра использовали свободно-распространяемую библиотеку Leaflet, написанную на языке JavaScript. В качестве картографических данных использовали карты, полученные от сообщества OpenStreetmap.

Результаты

В результате биоинформационного анализа было проверено свыше 40 перспективных INDEL-локусов для проведения внутривидового типирования токсигенных штаммов V. cholerae. Каждый INDEL-локус в хромосоме представлен двумя аллелями, поэтому размер аллеля должен быть легко определяем по результатам электрофореза после проведения ПЦР при наличии культуры in vitro или in silico по данным биоинформационного анализа нуклеотидной последовательности из баз данных. По итогам проверки для дальнейшей работы отобран набор из восьми INDEL-локусов. В их состав вошли как уже описанные локусы 1095 [20], 3186 [16], rtxA4 [21], так и идентифицированные в данном исследовании: 2566, 0667, 1446, 730 и 834. К идентифицированным локусам были сконструированы праймеры (Таблица 1), которые при проведении ПЦР формировали ампликоны размером в пределах 67 - 390 пар оснований, что позволило их уверенно идентифицировать при проведении электрофореза в геле. Распределение аллелей восьми INDEL-локусов среди 2105 изученных ctx+ геномов сформировало 11 уникальных INDEL-кластеров, обозначенных нами A-K (Таблица 2).

Таблица1. INDEL-локусы для типирования ctx+ Vibrio cholerae

Table 1. INDEL loci for typing of ctx+ Vibrio cholerae

Примечание:*- позиция указана по референсному геному V. cholerae El Tor N16961 (NCBI Accession Numbers CP028827, CP028828)

Таблица 2. INDEL-генотипы ctx+ Vibrio cholerae и размеры аллелей восьми INDEL-локусов.

Table 2. INDEL genotypes of ctx+ Vibrio cholerae and allele sizes of eight INDEL loci.

Таблица 3. Характеристика длительности циркуляции ctx+ штаммов Vibrio cholerae различных INDEL-кластеров

Table 3. Characteristics of the duration of circulation of ctx+ strains of Vibrio cholerae of various INDEL clusters

На основании количества штаммов в составе кластеров три кластера ̶ А, В и С относились к мажорным, и в сумме они составили 89 % от общего числа изученных последовательностей. Кластеры D, E, F, G и Н относились к промежуточному типу и включали 10,5 % изученных последовательностей. Три кластера I, J и K были представлены единичными штаммами (Таблица 3). INDEL-кластеры ctx+ V. cholerae различались по сроку формирования. Штаммы, входящие в состав первых четырех кластеров, были изолированы в ХХ веке (А - 1941, F - 1957, G - 1993, Е - 1999 годах соответственно), остальные штаммы, изолированные в XXI веке в период с 2003 по 2016, вошли в состав семи кластеров (среди которых присутствовали два мажорных - В и С).

Таблица 4. Характеристика географического распределения ctx+ штаммов Vibrio cholerae различных INDEL-кластеров

Table 4. Characteristics of the geographical distribution of ctx+ strains of Vibrio cholerae of various INDEL clusters

За последнее пятилетие (период с 2019 по 2023 годов) активность проявляли представители четырех INDEL-кластеров: А, В, D и E, причем за последние три года зарегистрировано выделение представителей только изолятов из кластеров А, В и D. Время циркуляции (период выделения) штаммов различалось и варьировало для представителей различных кластеров от 4 до 21 года. Кластеры F и G, на наш взгляд, можно рассматривать как «угасшие» поскольку в течение последних 20 лет штаммов с такими генотипами выделено не было (таблица 3).

Представители мажорных INDEL-кластеров A, B, C вызвали ряд серьезных вспышек на различных континентах, что позволяет предположить, что штаммы, образующие эти кластеры обладают высоким эпидемическим потенциалом. Так, эпидемические осложнения в Гаити и заносы в Африку в период 2009-2012 обусловлены представителями кластера В, вспышку в Йемене – вызвали штаммы кластера С (Таблица 4). Интересно, что в 2023 году на территории РФ были выделены три токсигенных штамма: один представитель кластера А (Ростов) и два - D (Тамбов, Москва).

Изучение сроков циркуляции ctx+ V. cholerae, входящих в состав INDEL-кластеров (Таблицы 3 и 4), позволило предположить, что представители различных кластеров обладают различной эпидемической значимостью. Так штаммы, циркулировавшие в Индонезии и Австралии до 1997 г, и отнесенные к кластеру F, были выделены в США в результате исследования трех единичных заносов. На наш взгляд, это может свидетельствовать об «угасании» этой ветви, обусловленном низким эпидемическим потенциалом входящих в ее состав ctx+ штаммов. В пользу низкого эпидемического потенциала штаммов, входящих в промежуточные и минорные INDEL-кластеры Е-К свидетельствует низкое число выносов возбудителя из очагов циркуляции. По этому критерию в данный период времени штаммы INDEL-кластеров A, B и D  характеризуются повышенным эпидемическим потенциалом и вероятно вытесняют ранее сформированные штаммы [2, 22].

Представлялось интересным оценить in silico эффективность предложенной схемы INDEL-типирования ctx+ V. cholerae с аналогичными инструментами эпидемиологического анализа, основанными на использовании SNP-анализа полногеномных сиквенсов.

На основании анализа 1757 SNP идентифицировано 3 волны и минимум 8 различных филогенетических линий V. cholerae, причем изоляты классического биотипа образовали отдельную сильно кластеризованную группу далекую от изолятов из Эль Тор седьмой пандемии [22, 23]. На первый взгляд штаммы мажорного INDEL-кластера А, описанные в данном исследовании, могут  соответствовать штаммам волны 1 для которых характерно отсутствие интегративного конъюгативного элемента ICE, что отличает их от штаммов волны 2 [22]. Однако INDEL-кластер А включает как ICE позитивные, так и ICE негативные изоляты. Вероятно, в дальнейшем в случае необходимости для дифференциации подгрупп в составе пандемического INDEL-кластера А целесообразно провести поиск дополнительных INDEL-маркеров.

Впоследствии другая группа авторов использовала этот же прием SNP-типирования для анализа штаммов 1070 холерных вибрионов O1 изолированных в 45 африканских странах за 49-летний период по 9300 однонуклеотидным заменам [24], в дальнейшем схема типирования была расширена при изучении 1203 геномов по 9986 SNP [25]. В последующей работе [26] авторы использовали 10679 SNР, что привело к идентификации уже 15 сублиний (AFR1 - AFR15). Возможно, расширение числа использованных SNP обусловлено стремлением повысить достоверность метода, поскольку описаны случаи существенного расхождения результатов SNP-типирования при использовании различного набора SNP [27].

Для сравнения двух различных способов молекулярного типирования было проведено сравнительное изучение вспышек холеры на Африканском континенте разработанным нами методом INDEL-типирования и приемом SNP-типирования [24, 25] (Таблица 5).

При SNP-типировании было показано, что эпидемические осложнения были связаны с одной расширенной линией, завезенной как минимум 11 раз начиная с 1970 года. Всего при SNP-типировании выявлено 12 сублиний V. cholerae (Т1-Т12) в последующей работе была выявлена 13 сублиния, обусловившая вспышку холеры в Йемене [24, 25].

Таблица 5. Сравнительное изучение ctx+ штаммов Vibrio cholerae, изолированных на Африканском континенте методом INDEL-типирования и SNP-анализом

Table 5. Comparative study of ctx+ strains of Vibrio cholerae isolated on the African continent by INDEL typing and SNP analysis

На основании результатов INDEL-типирования заносы в Африку вызвали штаммы, входящие в состав восьми кластеров A, B, C, E, J и K из 11 описанных, а не одной SNP-линии. Присутствия представителей INDEL-кластеров D, F, G и H в Африке не выявлено. В состав мажорного INDEL-кластера А входили представители всех 12 сублиний выявленных при SNP-анализе (Т1-Т12). Минорный INDEL-кластер J соответствовал сублинии Т7. Штаммы сублинии Т12 входили в состав INDEL-кластеров A, B и K (Таблица 5). Интересно, что в схему Weill, 2017 не входили штаммы INDEL-кластера Е, вызвавшие неоднократные заносы в Южную Африку 2018, 2019 и 2020 годах (Таблица 4).

Результат анализа штаммов изолированных на Африканском континенте свидетельствует, что предлагаемый способ INDEL-типирования ctx+ штаммов Vibrio cholerae по разрешающей способности не уступает приему SNP-типирования [24, 25]. Достоинством предлагаемого способа является простота и наглядность представления результатов.

На основании проведенной работы на основании распределения восьми выявленных INDEL-локусов создана Геоинформационная система «INDEL-генотипы штаммов V. cholerae О1» расположенная на Геоинформационном портале ФКУЗ Ростовского-на-Дону противочумного института Роспотребнадзора по адресу http://gis.antiplague.ru/s_Vcholerae_INDEL.php. Встроенная удобная система фильтров и поиска позволяет оперативно проводить молекулярный мониторинг ctx+ штаммов из доступных баз данных по различным запросам, отображать на карте места выделенияи число изолированных культур (Рис. 1).

Способ SNP-типирования крайне трудоемок, требует высокого качества секвенирования и значительного машинного времени для обработки данных полногеномного сиквенса. Часто его результат зависит от числа используемых SNP. Предлагаемый прием INDEL-типирования по восьми локусам при необходимости может быть оперативно проведен с помощью рутинной ПЦР, не прибегая к трудоемкому и дорогостоящему секвенированию. Преимуществом предлагаемого способа INDEL-типирования ctx+ Vibrio cholerae можно считать возможность проведение исследования как в формате in vitro при наличии культуры возбудителя, так и в формате in silico при анализе полногеномной нуклеотидной последовательности с целью молекулярного мониторинга холеры.

Полученные данные INDEL-типирования позволяют рассматривать популяцию ctx+ Vibrio cholerae как сложную биологическую систему, представленную несколькими, генетически отличающимися INDEL-кластерами. Причем на наших глазах происходит процесс формирования и угасания отдельных кластеров [22]. Активными в данный период времени можно считать кластеры А и D, обусловившие заносы в РФ в 2023. В дальнейшем целесообразно проведение поиска дополнительных локусов в перспективе позволившим проведение внутрикластерного типирования мажорных INDEL-кластеров. Перспективными мишенями для анализа могут являться ICE элементы или гены, обеспечивающие резистентность к токсическому действию тяжелых металлов. Кроме того,  на наш взгляд, усилия исследователей направленных на выявление новых факторов и детерминант патогенности следует сконцентрировать на представителях этих генетических групп. В этом случае в качестве «негативного контроля» при сравнительном изучении геномов можно рассматривать представителей неактивных INDEL-кластеров.

Рисунок 1 – Внешний вид ГИС «INDEL-генотипы штаммов V. cholerae О1» Представлен результат запроса по географическому распределению штаммов мажорного INDEL-кластера А. Кружки демонстрируют места выделения штаммов, цифра в кружке ̶ соответствует числу выделенных штаммов. Цвет маркера и его форма отражает количество выделенных культур: единичные штаммы – звездочкой, от 2 до 10 – зеленый круг, от 10 до 100 – желтый, свыше 100 – оранжевый.

Figure 1 – Appearance of the GIS “INDEL genotypes of V. cholerae O1 strains” The result of a query on the geographical distribution of strains of the major INDEL cluster A is presented. The circles show the places where the strains were isolated, the number in the circle corresponds to the number of isolated strains. The color of the marker and its shape reflect the number of isolated cultures: single strains - with an asterisk, from 2 to 10 - green circle, from 10 to 100 - yellow, over 100 - orange

作者简介

Sergey Vodopyanov

编辑信件的主要联系方式.
Email: serge100v@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-4336-0439
SPIN 代码: 4672-9310
Scopus 作者 ID: 6701686549

Doctor of Medical Sciences, Chief Scientific Officer

参考

补充文件