MALDI-ToF mass spectrometry analysis with molecular genetic identification of Vibrio spp. in the system of the monitoring of vibrio flora of surface water reservoirs

Full Text

Глобализация в современном мире оказывает существенное влияние на эпидемический процесс, способствуя ускорению темпов распространения инфекционных заболеваний как на внутриконти- нентальном, так и на межконтинентальном уровне, изменению биологических свойств возбудителей, трансформации среды обитания микроорганизмов, снижению резистентности макроорганизма [1]. Эти тенденции свойственны и для холеры, ситуация по которой в мире характеризуется высокими показателями заболеваемости за счет вовлечения в эпидемический процесс новых регионов, появлением измененных форм возбудителя с повышенным патогенным потенциалом, вероятностью завоза инфекции на свободные от холеры территории, в том числе невыявленными вибрионосителями, больными легкими и стертыми формами или больными в инкубационном периоде болезни, что определяет риск попадания возбудителя в поверхностные водоемы и накопления его в благоприятных экологических нишах [2-5]. С учетом этого важная роль в системе эпидемиологического надзора за холерой в РФ отводится мониторинговым исследованиям, направленным на своевременную индикацию и идентификацию возбудителя в объектах окружающей среды. Одной из актуальных задач совершенствования микробиологического мониторинга особо опасных инфекций является внедрение современных высокотехнологичных подходов к детекции генетических, белковых и антигенных детерминант патогена на основе геномного, протеомного, иммунохромато- графического и других видов анализа [6, 7]. В последние годы интенсивно развивается технология идентификации микроорганизмов на основе профиля референсных белков микробной клетки с использованием MALDI ToF (Matrix-Assisted Lazer Desorption/Ionization Time-of-Flight - матричноактивированная лазерная десорбция/ионизация с времяпролетным разделением) масс-спектрометрии. Принцип идентификации с применением MAL- DI-ToF заключается в сопоставлении белковых паттернов исследуемого микроорганизма с масс- спектрами базы данных и определении на основании этого его таксономической принадлежности [8]. MALDI-ToF масс-спектрометрический анализ характеризуется высокой специфичностью, скоростью и простотой постановки, успешно применяется в клинической лабораторной диагностике широкого круга инфекций [8-10]. Высокая эффективность масс-спектрометрии показана при идентификации и углубленной характеристике холерного вибриона, других микроорганизмов рода Vibrio и близкородственных таксономических групп [11-17], бактериологическом исследовании балластных вод морских судов [18]. Учитывая информативность и экс- прессность MALDI-ToF масс-спектрометрического анализа, существует необходимость исследования перспектив внедрения метода в схему лабораторной диагностики холеры для ускоренной идентификации культур, изолируемых из объектов окружающей среды. Цель исследования - оценка эффективности применения прямого белкового профилирования на основе MALDI-ToF масс-спектрометрии для идентификации микроорганизмов рода Vibrio в системе мониторинга вибриофлоры поверхностных водоемов. Материалы и методы В работе проведено исследование 583 морфологически сходных с холерным вибрионом колоний, отобранных с плотных питательных сред в ходе бактериологического исследования 1872 проб из объектов окружающей среды Иркутска в 2012-2013 гг. Бактериологически принадлежность исследуемых культур к роду Vibrio определялась в соответствии с МУК «Лабораторная диагностика холеры» [19] . Для предварительной идентификации использовались определение индофенолоксидазы, оценка типа расщепления глюкозы, подвижности и декар- боксилазной/дигидролазной активности в отношении аминокислот. Окончательная идентификация культур проводилась по комплексу культуральноморфологических, биохимических, серологических тестов. Масс-спектрометрическому исследованию подвергались колонии после предварительной постановки ориентировочной реакции агглютинации со специфическими холерными О1-, О139- и RO-сыворотками. Подготовка образцов для масс- спектрометрического анализа неагглютинирующих- ся холерными сыворотками культур осуществлялась прямым нанесением исследуемой культуры на MSP- чип (М8Р96, «Bruker Daltonics», Германия) с последующим наслаиванием 1 мкл насыщенного раствора матрицы (а-циано-4-гидроксикоричная кислота в 50 % ацетонитрила и 2,5 % трифторуксусной кислоты). Для агглютинирующихся культур проводилась предварительная экстракция белка посредством обработки микробной взвеси этиловым спиртом и 70% муравьиной кислотой с последующим добавлением ацетонитрила. По окончании экстракции по 1 мкл супернатанта анализируемых образцов переносилось в лунки MSP-чипа, образцы подсушивались на воздухе, сверху наносился 1 мкл матрицы. В качестве калибровочного стандарта и положительного контроля использовался белковый экстракт штамма E. coli DH5a (ref. № 255343; «Bruker Daltonics», Германия). Таблица 1 Последовательности праймеров и референсные штаммы для анализа генов rpoB и 16S rRNA Источник литературы Референсная нуклеотидная последовательность Ген Последовательность праймеров 5’-3’ наименование и номер штамма регистраци-онный номер в GenBank rpoB 1110F GTAGAAATCTACCGCATG ATG 23 V cholerae N16961 АЕ003852.1 (RNA polymerase beta subunit) CM32b CGGAACGGCCTGACGTTGCAT V metschnikovii LMG 11664 FN423806.1 V fluvialis 2403-00 EF064368 16S rRNA 519F CAGCMGCCGCGGTAATWC 22 V cholerae N16961 АЕ003852.1 (16S ribosomal RNA) 1406R ACGGGCGGTGTGTRC V metschnikovii NCTC 11170 X74712 V fluvialis ATCC 33809 NR_119053 Получение спектров осуществлялось в автоматическом режиме на масс-спектрометре Microflex™ LT MALDI-ToF («Bruker Daltonics», Германия) с использованием программы Flex Control (ver. 3.3, build 108). Белковые паттерны идентифицировались в программе MALDI Biotyper 3.0 («Bruker Daltonics», Германия), база данных которой была расширена нами ранее за счет внесения референсных спектров штаммов V. cholerae [14, 16]. Таксономическая принадлежность микроорганизма и достоверность идентификации определялись в соответствии со значением индекса совпадения (score value - SV). Выборочная геноидентификация культур осуществлялась на основании определения нуклеотидной последовательности таксономически информативных генов - rpoB и 16S rRNA [20, 21]. ДНК из исследуемых образцов экстрагировалась с использованием стандартных наборов РибоПреп (ФБУН «ЦНИИЭ» Роспотребнадзора, Москва), для амплификации использовалось 10 нг ДНК. Амплификация проводилась с использованием указанных в табл. 1 праймеров [22, 23] по программе: стартовая денатурация 95°С - 5 мин; 32 цикла: 95°С - 40 с, 60°С - 40 с, 72^ - 90 с; заключительная элонгация 72^ - 5 мин. Ампликоны очищались ферментной смесью (10 Ед экзонуклеазы I и 1 Ед щелочной фосфатазы). Секвенирование генов rpoB и 16S rRNA выполнялось с прямого и обратного праймеров с использованием ABI Prism BigDye v.1.1 Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit и ДНК-анализатора ABI Prism 3500 Genetic Analyzer («Applied Biosystems», США). Консенсусные последовательности секвени- рованных фрагментов ДНК определялись с применением программы VectorNTI v. 10.0 (Invitrogen Corp., США). Для идентификации на основании сопоставления нуклеотидных последовательностей генов rpoB и 16S rRNA исследуемых штаммов с последовательностями базы данных GenBank использовалась программа blastn пакета программ BLAST (Basic Local Alignment Search Tool, http://blast.ncbi. nlm.nih.gov/Blast.cgi). Последовательности гена 16S rRNA дополнительно анализировались с использованием базы данных проекта RDP версия 11,2 (Ri- bosomal Database Project, http://rdp.cme.msu.edu, содержит информацию о 2 922 433 аннотированных последовательностях гена 16S rRNA) и сетевого ресурса Ridom 16S rDNA (Ribosomal Differentiation of Microorganisms, http://www.ridom.de/rdna), позволяющих проводить on line идентификацию микроорганизмов по структуре указанного гена. При определении таксономической принадлежности оценивался уровень гомологии исследуемых локусов с соответствующими нуклеотидными последовательностями генов типовых штаммов из коллекций бактериальных культур (NCTC, ATCC) или последовательностями штаммов, принятых в качестве референсных при молекулярно-генетических исследованиях (в частности, штамм V. cholerae eltor N16961) (см. табл. 1). Кластерный анализ проводился с использованием инструментов программы Bionumerix 6.0 (Applied Maths, Бельгия) по алгоритму UPGMA. Нуклеотидные последовательности фрагментов генов 16S rRNA и rpoB депонированы в GenBank под инвентарными номерами KM209331-209333, KM262182- 262187, КМ364530-364536, КМ396324-396334. Чувствительность и специфичность методов идентификации оценивались в соответствии с рекомендациями, представленными в курсе доказательной медицины университета штата Мичиган, США (http://omerad.msu.edu/ebm/Diagnosis/Diagnosis4. html). Результаты и обсуждение Микробиологический мониторинг вибриофлоры поверхностных водоемов Иркутска проводится ежегодно в 16 стационарных эпидемиологически обоснованных точках. В летне-осенний период 20122013 гг. из водных объектов Иркутска исследовано 1872 пробы воды и иловых отложений. В процессе микробиологического анализа указанных проб с плотных питательных сред отобраны 583 колонии, морфологически сходные с холерным вибрионом. Предварительная бактериологическая идентификация показала принадлежность к Vibrio cholerae 170 колоний из 65 проб воды и ила, к V. fluvialis - 9 колоний из 4 проб и к V. metschnikovii - 6 колоний из 4 проб (табл. 2). Среди отнесенных к V. cholerae культур по результатам окончательной идентификации две охарактеризованы как V. cholerae eltor О1-серогруппы, остальные - как V. cholerae не О1/О139-серогрупп. Таблица 2 Результаты MALDI-ToF масс-спектрометрической и бактериологической идентификации Год Количество Идентифици- Результаты идентификации исследованных рованныи вид микроорганизма MALDI-ToF масс-спектрометрический анализ бактериологический анализ1 колоний количество идентифицированных колоний max score value количество идентифицированных культур количество идентифицированных колоний количество идентифицированных культур 2012 179 V cholerae 30 2,12-2,58 21 26 20 V fluvialis 2 2,25-2,31 2 1 1 2013 404 V cholerae 190 2,34-2,69 56 144 45 V. fluvialis 8 2,25-2,38 3 8 3 V metschnikovii 13 1,87-1,97 6 6 4 Примечание. 1 - предварительная идентификация по комплексу культурально-морфологических и биохимических тестов (индофенолоксидаза, окисление и ферментация глюкозы, декарбоксилазная и дигидралазная активность в отношении аминокислот). MALD^^F масс-спектрометрически идентифицировано как V. cholerae 220 колоний из 77 проб с индексом совпадения в диапазоне от 2,21 (достоверная идентификация до рода, вероятная - до вида) до 2,69 (достоверная идентификация до вида). При этом достоверная идентификация до вида (SV выше 2,30) установлена в 99,1 % случаев (218 колоний). Соответственно по результатам масс-спектрометрического анализа за период 2012-2013 гг. идентифицировано 77 культур холерного вибриона, тогда как при бактериологическом исследовании их количество составило 65. Отрицательный результат бактериологической идентификации группы масс- спектрометрически положительных культур V. cholerae (n=12) во всех случаях оказался обусловлен их активностью в отношении аминокислот, а именно наличием не только декарбоксилаз лизина и орни- тина, но и дигидролазы аргинина, что не позволяет отнести их к роду Vibrio виду cholerae. При этом повторный анализ декарбоксилазной/дигидролаз- ной активности с интервалом 7 дней у трех культур выявил типичную для V. cholerae характеристику, остальные сохранили исходные фенотипические свойства. Что касается других представителей рода Vibrio, то при прямом белковом профилировании 10 колоний (из 5 проб) идентифицировано как V. fluvialis и 13 (из 6 проб) - как V. metschnikovii. Необходимо отметить, что идентификация по белковому паттерну V. metschnikovii прошла лишь на уровне «вероятной до рода» с индексом совпадения, не превышающим 1,97. На основании полученных данных проведен расчет диагностической чувствительности и специфичности MALD^^F масс-спектрометрической идентификации в сравнении с бактериологической. В результате установлено, что чувствительность масс- спектрометрии составила 100 % (все отнесенные по данным бактериологического анализа к роду Vibrio колонии соответствовали указанному роду и по белковому профилю). Специфичность же метода определена на уровне 85,4 %, что обусловлено наличием колоний, белковые спектры которых соответствуют спектрам микроорганизмов рода Vibrio (V cholerae, V. fluvialis, V. metschnikovii) из базы данных MALDI Biotyper 3.0, не относящихся к указанным таксонам по бактериологическим тестам. Расхождение результатов идентификации ряда культур с использованием классического бактериологического метода и прямого белкового профилирования определяет необходимость их дальнейшего изучения. В настоящее время в качестве альтернативного высокоэффективного метода в таксономии и изучении филогении микроорганизмов используется геноидентификация, основанная на изучении таксономически информативных маркеров. Одним из широко применяемых с этой целью стандартных генетических маркеров является ген, кодирующий синтез 16S rRNA. Указанный ген присутствует в геноме практически всех микроорганизмов, часто в виде множественных копий, характеризуется достаточной для анализа протяженностью и в меньшей степени подвержен изменчивости во времени [20]. Для достоверной видовой идентификации микроорганизмов по структуре гена 16S rRNA единых требований не установлено, но рекомендован ряд критериев - в частности размер анализируемого участка гена должен составлять не менее 500-525 п.о.; при отнесении к тому или иному виду идентичность анализируемых нуклеотидных последовательностей должна быть не менее 99 % по сравнению с типовыми или референсными штаммами [20, 24]. Вместе с тем в ряде случаев видовая дифференциация микроорганизмов отдельных родов, в том числе и некоторых видов рода Vibrio, с использованием данного генетического маркера затруднена в связи с его высокой консервативностью [18, 20, 25]. Поэтому в бактериальной таксономии для идентификации предложено использовать анализ структуры другого универсального гена «домашнего хозяйства» - rpoB, кодирующего Р-субъединицу РНК-полимеразы. Более высокий уровень дивергенции нуклеотидных последовательностей гена rpoB в сравнении с геном 16S rRNA в отдельных таксономических группах дает основание рассматривать его в качестве эффективного инструмента микробной идентификации как на видовом, так и на внутривидовом уровне [21, 26]. Таблица 3 Результаты выборочной геноидентификации культур, отнесенных к роду Vibrio по данным MALDI ToF масс-спектрометрии Наименование исследуемого Принадлежность к Данные MALDI ToF масс-спектрометрии Результаты геноидентификации образца роду Vibrio по данным бактериологической идентификации1 идентифицироmax анализируеrpoB % 16SrRNA % иден ванный вид score value мый участок гена рефе- ренсного штамма2 идентифицированный вид идентичности анализируемый участок гена референс- ного штамма2 идентифицированный вид тичности Колония 1 Не относится V cholerae 2,53 1303-2102 V cholerae 99,75 566-1336 V cholerae 100,00 Колония 2 V cholerae 2,39 1303-2102 V cholerae 99,75 566-1336 V cholerae 100,00 Колония 3 V cholerae 2,47 1303-2102 V cholerae 99,88 566-1336 V cholerae 100,00 Колония 4 V cholerae 2,57 1303-2102 V cholerae 99,25 566-1336 V cholerae 100,00 V cholerae не О1/О139 1-13 V cholerae V cholerae 2,46 1303-2102 V cholerae 98,75 566-1336 V cholerae 99,74 V cholerae не О1/О139 10-13 V cholerae V cholerae 2,47 1303-2102 V cholerae 99,75 566-1336 V cholerae 100,00 V cholerae И-1300 V cholerae V cholerae 2,71 1303-2102 V cholerae 100,00 566-1336 V cholerae 100,00 V cholerae И-1501 V cholerae V cholerae 2,55 1303-2102 V cholerae 100,00 566-1336 V cholerae 100,00 V cholerae И-1447 V cholerae V cholerae 2,52 1303-2102 V cholerae 99,62 566-1336 V cholerae 99,74 Колония 5 Не относится V metschnikovii 1,97 1-871 V metschnikovii 100,00 576-1355 V metschnikovii 99,49 Колония 6 V metschnikovii 1,97 1-871 V metschnikovii 99,54 576-1355 V metschnikovii 99,49 V metschnikovii 1-13 V metschnikovii V metschnikovii 1,91 1-871 V metschnikovii 95,06 576-1355 V metschnikovii 99,23 Колония 7 Не относится V fluvialis 2,25 14-821 V fluvialis 99,75 563-1396 V fluvialis 100,00 Vfluvialis 2-12 V fluvialis V fluvialis 2,31 14-821 V fluvialis 99,75 563-1396 V fluvialis 100,00 V fluvialis 1-13 V fluvialis V fluvialis 2,38 14-821 V fluvialis 99,38 563-1396 V fluvialis 99,74 Примечание. 1 - предварительная идентификация по комплексу культурально-морфологических и биохимических тестов (индофенолоксидаза, окисление и ферментация глюкозы, декарбоксилазная и дегидралазная активность в отношении аминокислот); 2 - указаны нуклеотидные позиции гена референсного штамма. Штаммы, используемые в качестве референсных, представлены в табл. 1. Основываясь на этих данных, для уточнения диагностических параметров масс-спектрометрической идентификации изучаемых культур и подтверждения их таксономической принадлежности нами проведена выборочная геноидентифиция на основании секвенирования фрагментов двух генов: 16S rRNA и rpoB. Структура указанных локусов определялась в геноме 9 культур, идентифицированных по масс- спектрометрии как V. choleare (в том числе 2 культуры бактериологически охарактеризованы как V. cholerae не О1/О139 №1-13, 10-13, 1 - V. cholerae eltor О1 ctxA+ tcpA+ № И-1300, 1 - V. cholerae eltor О1 ctxA~ tcpA+ № И-1501, 1 - V. cholerae eltor О1 ctxA~ tcpA- № И-1447 и 4 - по комплексу бактериологических тестов к роду Vibrio не относятся, условно обозначенные как «колонии 1-4»); трех культур - V. metschnikovii («колонии 5, 6», отнесенные к указанному виду по масс-спетрометрии с низким SV и бактериологически подтвержденная культура с низким SV - V. metschnikovii 1-13); трех культур V. fluvialis («колония 7», идентифицированная по масс-спектрометрии и две культуры V. fluvialis, принадлежность к данному виду которых определена как бактериологически, так и по белковому профилю) (табл. 3). В результате при анализе гена 16S rRNA с использованием пакета программ BLAST все исследуемые культуры V. cholerae (n=9) продемонстрировали высокий процент идентичности (от 99,74 до 100 %) нуклеотидной последовательности данного гена с последовательностью референсного штамма V. cholerae N16961. При этом различия анализируемого участка гена по двум позициям выявлены у двух штаммов, отнесенных к V. cholerae как по масс-спектрометрическим, так и по бактериологическим данным. Установленный уровень гомологии нуклеотидных последовательностей гена 16S rRNA подтверждает принадлежность взятых в исследование культур к V. cholerae. Аналогичный результат идентификации получен и при анализе указанных культур с применением базы данных проекта RDP. Определение же таксономической принадлежности в проекте Ridom 16S rDNA оказалось невозможным в связи с отсутствием в базе данных информации о микроорганизмах рода Vibrio. Также по структуре гена 16S rRNA подтверждена принадлежность к виду трех тестируемых культур V. fluvialis как с использованием BLAST (идентичность с референсной последовательностью от 99,74 до 100 %), так и RDP. У культур, отнесенных по профилю константных белков к V. metschnikovii, при сопоставлении с базой данных GenBank установлена большая вариабельность последовательности гена 16S rRNA - выявлено от 3 до 7 замен на анализируем участке гена. При этом следует отметить, что у одной культуры («колония 6») обнаружен полиморфизм фрагмента 16S rRNA, проявляющийся в регистрации на хроматограмме двойных пиков в позициях 1133 (A/G), 1134 (A/C), 1141 (T/G) и 1142 (T/C) гена типового штамма V. metschnikovii NCTC 11170 (рис. 1, а). Учитывая интенсивность отдельных пиков на одной из хроматограмм, можно предположить, что доминирующей является аллель с нуклеотидами A, C, G, T в данных позициях, которая соответствует структуре гена типового штамма V. metschnikovii NCTC 11170. Другая аллель, по всей вероятности, содержит нуклеотиды G, C, G, C в вариабельных позициях и полностью соответствует структуре данного участка гена 16S rRNA другого типового штамма V. metschnikovii NBRC 103153 (NR_114220). Факт полиморфизма указанного участка гена подтвержден при повторном поколониальном исследовании ДНК культуры. Эти данные могут свидетельствовать о присутствии в геноме культуры различных копий гена, однако для подтверждения данного предположения требуется проведение дополнительных исследований. Известно, что для некоторых групп микроорганизмов внутригеномная гетерогенность гена 16S rRNA (наличие разных по структуре копий в геноме) препятствует достоверному определению их таксономического положения [20]. Однако в нашем исследовании при выравнивании нуклеотидных последовательностей гена 16S rRNA анализируемых культур по алгоритму blastn максимальное сходство установлено с депонированными в GenBank вибрионами Мечникова и расчет уровня гомологии позволяет идентифицировать эти культуры как V. metschnikovii (идентичность от 99,03 до 99,58%). Отношение к указанному таксону анализируемых культур определено и в RDP (рис. 1, б). а 1100 990 880 770 660 □ rootrank Root (0/20/1354916) (selected/match/total RDP sequences) □ domain Bacteria (0/20/1321669) Q phylum "Proteobacteria" (0/20/373333) В class Gammaproteobacteria (0/20/172958) В order "Vibrionales" (0/20/7294) В family Vibrionaceae (0/20/7294) В genus Vibrio (0/20/5070) □ S000013153 not_calculated 0.965 1364 Vibrio metschnikovii; NTCT 11170; X74712 □ S000425203 not_calculated 0.955 1332 Vibrio sp. M12-2C; AY730244 □ S000556981 not_calculated 0.957 1350 Vibrio metschnikovii; ATCC 7708; DQ068937 □ S000893208 not_calculated 0.958 1373 Vibrio metschnikovii; H050610-1; EF645831 □ S000927080 not_calculated 0.991 1274 Vibrio metschnikovii; KMK745; EU090728 б Рис. 1. Идентификация V. metschnikovii на основании структуры гена 16SrRNA: а - фрагмент хроматограммы, полученной при секвенировании гена 16S rRNA «колонии 6»; б - идентификация с использованием проекта RDP V metschnikovii 1-13. Уровень гомологии нуклеотидных последовательностей фрагмента гена rpoB всех анализируемых культур V. cholerae составил 98,75-100%, V. fluvialis - 99,3899,75%, V. metschnikovii - 95,06100% в сравнении с последовательностями референсных штаммов. Учитывая данные литературы, для установления таксономической принадлежности микроорганизмов по структуре гена rpoB необходимый уровень гомологии последовательностей зависит от размера анализируемого фрагмента гена: при размере фрагмента от 300 до 600 п.о. для отнесения к виду гомология с референсным штаммом должна составлять не менее 94-95%, при размере 600-825 п.о. - 96-97% [21]. Отнесение изучаемого микроорганизма к новому виду возможно при идентичности полной нуклеотидной последовательности гена rpoB с имеющимися в базах менее 97,7%, к подвиду одного вида - более 98,8% [21]. В соответствии с этими критериями идентификация исследуемых культур V. cholerae, V. fluvialis по rpoB полностью соответствует результатам определения таксономической принадлежности по профилю константных белков микробной клетки с использованием масс-спектрометрии (см. табл. 3). Две культуры, идентифицированные в MALD^^F как V. metschnikovii соответствуют указанному виду и по гену rpoB. В структуре анализируемого участка гена rpoB третьей культуры, отнесенной по бактериологическим тестам к V. metschnikovii, выявлены 43 однонуклеотидные замены в сравнении с референсным штаммом, 42 из которых локализованы в синонимичных сайтах. Гомология последовательности на уровне 95,06% не позволяет достоверно судить о принадлежности культуры к V. metschnikovii по структуре указанного локуса. При этом для данной культуры установлен достаточно низкий индекс совпадения белкового паттерна с референсными спектрами базы MALDI Biotyper при масс-спектрометрической идентификации (SV 1,91). Невозможность достоверной видовой масс-спектрометрической идентификации культуры, отнесенной по бактериологическим тестам и структуре гена 16S rRNA к V. metschnikovii, может быть обусловлена как особенностями ее биологических свойств, так и недостаточным количеством видоспецифических масс-спектров в базе MALDI Biotyper 3,0 (версия содержит масс-спектры Vibrio furnissii NCTC 11218 chromosome. CP002377.1 Vibrio furnissii strain L18 KC884610.1 Vibrio furnissii strain TS-19 KC849428.1 Vibrio fluvialis strain MBTD_CMFRI_Vf05 KF317830.1 Vibrio fluvialis strain MBTD_CMFRI_Vf04 KF317829.1 Vibrio fluvialis strain LCB1 KC210808.1 Vibrio fluvialis strain NCTC 11327 NR_118443.1 Vibrio fluvialis strain CSMCRI-1009 JQ613505.1 Vibrio fluvialis strain FSP561/08 JQ650110.1 Vibrio fluvialis strain NBRC 103150 NR_114218.1 Vibrio fluvialis partial strain CCMM B664 FR695475.1 Colony_7_16SrRNA V.fluvialis 2-12_16SrRNA V.fluvialis 1-13 16SrRNA colony_7_rpoB V.fluvialis_2-12_rpoB Vibrio fluvialis strain 2403-00 EF064368.1 Vibrio fluvialis strain F8106 EF064370.1 Vibrio fluvialis strain 2437-05 EF064369.1 Vibrio fluvialis strain F8033 EF064371.1 Vibrio fluvialis strain K2542 EF064367.1 V.fluvialis_1 -13_rpoB Vibrio fluvialis strain F8658 EF064372.1 Vibrio furnissii strain 2420-04 EF064374.1 Vibrio furnissii NCTC 11218 CP00237.1 Vibrio furnissii partial rpoB FN423807.1 Vibrio furnissii strain 2419-04 EF064373.1 Vibrio furnissii strain 2435-03 EF064375.1 H Рис. 2. Дендрограмма, построенная по алгоритму UPGMA на основании сопоставления таксономически информативных генов V. fluvialis и V. furnissii. а - ген rpoB (размер анализируемого фрагмента гена 808 п.о.). б - ген 16S rRNA (размер анализируемого фрагмента гена 834 п.о.). двух штаммов V. metschnikovii LMG 11664 и V47 IBS). В пользу последнего аргумента свидетельствуют и данные идентификации других культур V metschnikovii, индекс совпадения для которых установлен на уровне ниже достоверной идентификации до рода и вида (см. табл. 3). Следует отметить, что в ряде научных исследований обозначены проблемы дифференциации по профилю константных белков и структуре генов 16S rRNA, rpoB отдельных близкородственных видов рода Vibrio. Так, за счет высокого сходства нуклеотидной последовательности 16S rRNA затруднена дифференциация штаммов V. alginolyticus и V. parahaemo- lyticus по данному локусу [18, 25]. R. Dieckmann и соавт. [12] указывают на невозможность разделения по масс-спектрометрическим профилям и гену rpoB идентифицированных по биохимическим тестам как V. fluvialis- и V. furnissii штаммов, поскольку известно, что нуклеотидная последовательность гена Р-субъединицы РНК-полимеразы у данных видов характеризуется высокой гомологией. Анализируемый в настоящей работе участок гена rpoB включает 13 позиций, дифференцирующих типовые штаммы V. fluvialis и V. furnissii. При этом у всех включенных в исследование культур («колония 5», V. fluvialis 2-12, V. fluvialis 1-13) в данных позициях идентифицированы нуклеотиды, характерные для V. fluvialis. На дендрограмме, построенной по алгоритму UPG- MA, исследуемые культуры входят в группу, сформированную штаммами V. fluvialis из базы данных GenBank, дистанцированную от группы штаммов V. furnissii (рис. 2, а). Дифференциация исследуемых культур и V. furnissii установлена и по структуре гена 16S rRNA - на анализируемом участке обнаружено расхождение их последовательностей по двум позициям, что подтверждается и при кластерном анализе группы V. fluvialis и V. furnissii (рис. 2, б). При этом, как и в случае с другими таксонами, у V. fluvialis обнаруживается большая гетерогенность нуклеотидной последовательности гена rpoB в сравнении с геном 16S rRNA. Такая же закономерность установлена и для V. cholerae. Кластерный анализ нуклеотидной последовательности гена rpoB V. cholerae показал 100% идентичность с рефересной (штамм V. cholerae N16961) только у взятых в исследование в качестве группы сравнения эпидемически опасного (И-1300) и потенциально эпидемически опасного (И-1501) штаммов О1-серогруппы. Нетоксигенные же V. cholerae eltor О1-серогруппы и все вибрионы не О1/О139 оказались вариабельны по этому гену и дифференцируются на 5 генотипов с числом вариабельных позиций от 1 до 7 (рис. 3). Основываясь на этих данных, можно предположить наличие ассоци- Vibrio cholerae MS6 DNA chromosome 1 AP014524.1 Vibrio cholerae IEC224 chromosome I CP003330.1 Vibrio cholerae 01 str. 2010EL-1786 chromosome 1 CP003069.1 Vibrio cholerae 0395 chromosome I CP001235.1 Vibrio cholerae M66-2 chromosome I CP001233.1 Vibrio cholerae 0395 chromosome 2 CP000627.1 Vibrio cholerae 01 biovar eltor str. N16961 chromosome. AE003852.1 Рис. 3. Дендрограмма, построенная по алгоритму UPGMA на основании сопоставления фрагмента гена rpoB V. cholerae (размер анализируемого фрагмента гена 800 п.о.). ации между структурой гена rpoB и эпидемической опасностью холерного вибриона. Однако, в работе F. Schirmeister и соавт. [27] идентифицированы изолированные от пациентов нетоксигенные V. cholerae не О1/О139, характеризующиеся 100% гомологией нуклеотидной последовательности гена rpoB с токсигенными штаммами. Поэтому для уточнения вопроса о взаимосвязи эпидемической опасности и особенностей структурной организации данного генетического локуса необходимо проведение дальнейших исследований. В целом, анализируя полученные результаты, следует заключить, что установленная масс- спектрометрически принадлежность культур к V cholerae и V. fluvialis в 100% случаев подтверждена при геноидентификации на основании структуры генов 16S rRNA и rpoB. Выявленный низкий коэффициент совпадения масс-спектров трех анализируемых культур (определенных как V. metschnikovii с вероятной идентификацией до рода) с референсными спектрами базы данных, подтвержденный в одном случае (V metschnikovii 1-13) недостаточным для идентификации уровнем гомологии гена rpoB, требует дополнительного изучения данных культур. Для окончательного установления их таксономической принадлежности и решения вопроса о необходимости внесения дополнительных спектров V. metschnikovii в базу MALDI Biotyper целесообразны определение полной нуклеотидной последовательности генов 16S rRNA и rpoB, изучение внутригеномной вариабельности гена 16S rRNA, а также привлечение дополнительных методов идентификации этих культур на основании изучения биохимической активности. Сопоставление же данных протеомной и генетической идентификации с бактериологической свидетельствует о вероятности гиподиагностики на основании фенотипических культуральных тестов, в частности биохимической активности в отношении аминокислот, при мониторинговых исследованиях. Данный факт может быть обусловлен штаммо- выми особенностями происходящих в микробной клетке метаболических процессов в различных условиях ее существования (в данном случае в объектах окружающей среды и в условиях in vitro) и постепенной адаптацией к культивированию на питательных средах с восстановлением соответствующей роду Vibrio биохимической активности. Установленная высокая диагностическая чувствительность и специфичность масс-спектро- метрии при исследовании проб из объектов окружающей среды определяют целесообразность включения метода в схему микробиологического мониторинга вибриофлоры поверхностных водоемов. При этом применение масс- спектрометрической идентификации возможно на этапе как отбора колоний (при достаточном их количестве), так и их идентификации. С учетом требований биологической безопасности способ подготовки материала для исследования должен определяться после предварительной постановки ориентировочной реакции агглютинации с холерными О1-О139- и RQ-сыворотками [16]. В дальнейшем бактериологическая идентификация отнесенных при прямом белковом профилировании к V. cholerae не агглютинирующихся холерными сыворотками культур не требуется. Что касается идентифицированных масс- спектрометрически как V. cholerae агглютинирующихся культур, то они должны идентифицироваться дополнительно по комплексу бактериологических и молекулярно-генетических тестов для определения их принадлежности к серогруппе, биовару и оценке эпидемической значимости. Заключение Результаты комплексного исследования позволяют рассматривать MALDI-^F масс-спектрометрию как высокоэффективный метод ускоренной идентификации морфологически сходных с микроорганизмами рода Vibrio колоний в процессе мониторинга вибриофлоры объектов окружающей среды. Применение MALDI-^F масс-спектрометрии обеспечивает повышение качества диагностики, сокращение сроков определения таксономической принадлежности культур, существенное снижение трудозатрат, уменьшение необходимого для анализа количества расходных материалов, реактивов и питательных сред за счет исключения из схемы родовой и видовой идентификации ряда тестов. Вместе с тем следует отметить, что в качестве одного из перспективных направлений исследований c использованием данной технологии рассматривается разработка подходов к внутривидовой дифференциации на основании выявления специфических для определенной серо- группы, биовара, эпидемической значимости пиков масс-спектра идентифицируемых культур, что обеспечит дальнейшее совершенствование и оптимизацию схемы лабораторной диагностики в рамках эпидемиологического надзора за холерой.

About the authors

L. V Mironova

Irkutsk Research Institute of Plague Control of Siberia and the Far East of the Federal Service for the Oversight of Consumer Protection and Welfare

Email: mironova-lv@yandex.ru
78, Trilissera Str., Irkutsk, Russian Federation, 664047

E. A Basov

Irkutsk Research Institute of Plague Control of Siberia and the Far East of the Federal Service for the Oversight of Consumer Protection and Welfare

78, Trilissera Str., Irkutsk, Russian Federation, 664047

M. V Afanasev

Irkutsk Research Institute of Plague Control of Siberia and the Far East of the Federal Service for the Oversight of Consumer Protection and Welfare

78, Trilissera Str., Irkutsk, Russian Federation, 664047

Zh. Yu Khunkheeva

Irkutsk Research Institute of Plague Control of Siberia and the Far East of the Federal Service for the Oversight of Consumer Protection and Welfare

78, Trilissera Str., Irkutsk, Russian Federation, 664047

S. K Mitkeeva

Irkutsk Research Institute of Plague Control of Siberia and the Far East of the Federal Service for the Oversight of Consumer Protection and Welfare

78, Trilissera Str., Irkutsk, Russian Federation, 664047

V. S Ganin

Irkutsk Research Institute of Plague Control of Siberia and the Far East of the Federal Service for the Oversight of Consumer Protection and Welfare

78, Trilissera Str., Irkutsk, Russian Federation, 664047

L. Ya Urbanovich

Irkutsk Research Institute of Plague Control of Siberia and the Far East of the Federal Service for the Oversight of Consumer Protection and Welfare

78, Trilissera Str., Irkutsk, Russian Federation, 664047

E. S Kulikalova

Irkutsk Research Institute of Plague Control of Siberia and the Far East of the Federal Service for the Oversight of Consumer Protection and Welfare

78, Trilissera Str., Irkutsk, Russian Federation, 664047

E. G Goldapel

Irkutsk Research Institute of Plague Control of Siberia and the Far East of the Federal Service for the Oversight of Consumer Protection and Welfare

78, Trilissera Str., Irkutsk, Russian Federation, 664047

S. V Balakhonov

Irkutsk Research Institute of Plague Control of Siberia and the Far East of the Federal Service for the Oversight of Consumer Protection and Welfare

78, Trilissera Str., Irkutsk, Russian Federation, 664047

References

Supplementary files