Role of microbiome in development of systemic inflammatory response syndrome and sepsis (review)

Full Text

Список сокращений

ССВО ― синдром системного воспалительного ответа

ЛПВП ― липопротеины высокой плотности

ЛПНП ― липопротеины низкой плотности

ЛПОНП ― липопротеины очень низкой плотности

DAMPs (damage-associated molecular patterns) ― молекулярные паттерны, ассоциированные с повреждением

LBP (lipopolysaccharide binding protein) ― липополисахаридсвязывающий белок

LPS (lipopolysaccharides) ― липополисахариды

LTA (lipoteichoic acid) ― липотейхоевая кислота

MAPK (mitogen-activated protein kinase) ― митогенактивируемая протеинкиназа

PAMPs (pathogen-associated molecular patterns) ― молекулярные паттерны, ассоциированные с патогенами

NLR (NOD-like receptors) ― NOD-подобные рецепторы

PG (peptidoglycan) ― пептидогликан

PRRs (pattern recognition receptor) ― рецепторы распознавания образов

TLR (toll-like receptor) ― toll-подобный рецептор

TNF-α (tumor necrosis factor-alpha) ― фактор некроза опухоли-альфа

WTA (wall teichoic acid) ― тейхоевая кислота клеточной стенки

ВВЕДЕНИЕ

Сепсис считается одной из ведущих причин смертности во всём мире [1]. Согласно эпидемиологическим исследованиям, проведённым в последнее время в США и странах Европы, случаи сепсиса регистрируются чаще, чем инфаркты и инсульты, составляя в среднем 370–500 случаев на 100 000 человек. Тяжёлый сепсис является одной из основных причин госпитализации в отделение интенсивной терапии и летального исхода [2]. Летальность от сепсиса достигает 25–50%. В Российской Федерации, по данным Росстата, смертность от сепсиса составляет 1499 случаев в год [3]. Согласно Третьему международному консенсусному определению сепсиса и септического шока (Sepsis-3), данному на конгрессе ассоциаций Общества интенсивной терапии и Европейского общества интенсивной терапии (Society Critical Care Medicine /European Society Intensive Care Medicine, SCCM/ESICM) в Орландо (США) 23 февраля 2016 года [4], сепсис ― это опасная для жизни органная дисфункция, вызванная нарушенной реакцией организма на инфекцию.

Тяжёлый сепсис рассматривается как прогрессирование инфекции в сепсис, тяжёлый сепсис и септический шок в порядке усиления степени тяжести состояния. Сепсис характеризуется системной воспалительной реакцией в ответ на инфекцию в условиях изменённой реактивности организма (преимущественно иммуносупрессии) с развитием полиорганной недостаточности и/или шока [5]. Понятие тяжёлого сепсиса включает в себя наличие предполагаемой или подтверждённой инфекции, органной недостаточности и признаков, которые удовлетворяют двум или более критериям синдрома системного воспалительного ответа (ССВО): наличие гипертермии (гипотермии), тахикардии, тахипноэ, лейкоцитоза (лейкопении). Доказательства инфекционной этиологии сепсиса были получены в отношении Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogens, Escherichia coli, Klebshiella spp. и Pseudomonas aeruginosa [6].

Для исследования роли микробиома в развитии сепсиса широко применяют экспериментальные модели. Методы, используемые для создания моделей сепсиса путём нарушения барьерной функции кишечника хозяина, включают перевязку/пункцию слепой кишки, установку стента восходящей кишки и внутрибрюшинную инъекцию фекалий. Токсемию воспроизводят путём инъекций липополисахаридов (lipopolysaccharides, LPS), пептидогликанов, липотейхоевой кислоты, ДНК CpG (5’-C-phosphate-G-3’), зимозана и синтетических липопептидов [7]. Согласно Международному консенсусу экспертов по доклиническим исследованиям сепсиса [8], введение LPS не является релевантной моделью для воспроизведения сепсиса у человека, однако для проведения экспериментальных исследований ССВО этот метод широко используется, поскольку внутрибрюшинное или внутривенное введение LPS мышам приводит к системной активации реакций врождённого иммунитета. Если доза LPS достаточно велика, то у животных проявляются физиологические и биохимические изменения, напоминающие молниеносные формы грамотрицательной бактериальной инфекции у человека [9]. Некоторые из проявлений острой эндотоксемии у мышей включают артериальную гипотензию, лактоацидоз, нарушение сократимости миокарда, кратковременное повышение фактора некроза опухоли-альфа (tumor necrosis factor-alpha, TNF-α), более продолжительное повышение уровня интерлейкина-6 (Interleukin, IL) и отсроченное повышение ядерного белка амфотерина, т.е. все признаки сепсиса или септического шока у людей, хотя кинетика и степень этих изменений отличается от таковых при экспериментальной эндотоксемии [10].Большое значение имеет также выбор линии животных, на которой проводится исследование. Показана примерно 40-кратная разница между LD50¹ у LPS-чувствительных и резистентных линий. Мыши C3H/HeJ гипочувствительны, но не полностью невосприимчивы к токсическим эффектам LPS: доза, необходимая для того, чтобы вызвать потерю веса у мышей C3H/HeJ, примерно в 40 раз больше, чем доза, необходимая для получения аналогичной потери веса у LPS-чувствительных мышей C3H/HeN [11].

Участие микробиома кишечника в патогенезе ССВО и сепсиса считается доказанным фактом, описанным в многочисленных литературных источниках. Наибольшее количество публикаций посвящено действию LPS грамотрицательных бактерий, однако исследователи уделяют также внимание грамположительным бактериям и их компонентам.

Цель обзора ― анализ и систематизация данных, касающихся роли компонентов клеточной стенки или мембран грамположительных и грамотрицательных бактерий ― представителей кишечного микробиома в патогенезе ССВО и сепсиса.

КИШЕЧНЫЙ МИКРОБИОМ В ПАТОГЕНЕЗЕ СИНДРОМА СИСТЕМНОГО ВОСПАЛИТЕЛЬНОГО ОТВЕТА И СЕПСИСА

Патобиом как источник повышения уровня PAMPs в системном кровотоке

Исходя из концепции нормобиома/патобиома [12], наличие нормобиома (нормального/здорового микробиома) является основой для стабильных и взаимовыгодных отношений микроорганизмов-симбионтов и хозяина. Основная часть нормобиома помогает поддерживать и регулировать стабильное состояние макроорганизма. Метаболиты микроорганизмов-компонентов нормобиома обладают бактерицидными свойствами, что обеспечивает относительно низкую долю условно-патогенных и патогенных бактерий в его структуре. Патобиом, также стабильное сообщество микроорганизмов с повышенной долей в нём патогенных микроорганизмов, не обеспечивая базовых потребностей хозяина, сам становится причиной повреждения слизистого барьера кишечника и распространения инфекционных агентов и их компонентов в кровеносное русло, лимфатическую систему и внекишечные локусы.

В последнее время в литературе значительное внимание уделяется микробным ассоциациям различных биотопов человека, которые взаимодействуют между собой, облегчая распространение и обеспечивая повышенную возможность выживаемости, распространения и колонизации. Такие ассоциации могут определять возникновение полимикробных инфекций, а также длительно сосуществовать в виде патобиома [13]. Кишечные комменсальные бактерии Ruminococcus gnavus нарушают структуру муцинов, обеспечивая возможность адгезии другим микроорганизмам, включая более вирулентные Klebsiella pneumoniae. Bacteroides thetaiotaomicron способны производить из гликанов муцина сиаловую кислоту, необходимую Clostridium difficile и Salmonella typhimurium, которые сами не способны к её образованию [14].

При развитии таких заболеваний, как сахарный диабет 2-го типа [15], атеросклероз [16], неалкогольная жировая дистрофия печени [17] и другие, описаны относительно специфические для этих патологий значительные изменения структуры микробиома. В этом случае можно говорить о формировании в кишечнике стабильного микробного сообщества с выраженной степенью доминирования в нём условно-патогенных микроорганизмов. Изменения микробного гомеостаза, характеризующие такое сообщество, обычно слабо поддаются коррекции путём введения пробиотических бактерий и их продуктов, что является признаком сформированного патобиома.

Радикальные изменения качественного и количественного состава микроорганизмов обусловлены, прежде всего, применением антибиотиков и использованием препаратов, изменяющих условия окружения для бактерий-комменсалов. К этим препаратам можно отнести средства, угнетающие секрецию желудочного сока, вазоактивные агенты, препараты, подавляющие или усиливающие моторику желудочно-кишечного тракта [18]. Кроме того, острые нарушения структуры микробиома ассоциированы с недостатком нутриентов в кишечнике, а также с гипоксией и гиперкапнией [19]. Показано, что у пациентов в критическом состоянии нарушение состава микробиоты в проксимальных отделах толстой кишки служит предиктором развития вторичных инфекций, которые часто ошибочно рассматривают как нозокомиальные либо связанные с оказанием медицинской помощи [20]. Однако в их этиологии в значительной мере преобладают компоненты микробиома толстой кишки, что подтверждает участие патобиома как источника формирования внекишечных очагов инфекции и роль несостоятельности кишечного барьера.

Наличие сохранного слизистого барьера необходимо для поддержания микробного гомеостаза и низкого уровня транслокации бактерий в лимфатическое и кровеносное русло. Разрушение этого барьера может быть вызвано рядом факторов, в том числе употреблением фармакологических препаратов, нарушениями диеты и кишечной инфекцией [21]. Кишечные комменсальные бактерии, обладающие способностью проникать через кишечный барьер, и их компоненты способствуют развитию различных воспалительных [22] и иммуноопосредованных [23] заболеваний.

Известно, что микробиом кишечника человека обладает высоким адаптивным и компенсаторным потенциалом [24], сохраняя стабильность микробного ядра в течение десятилетий [25]. Адаптивные мутации могут быть обнаружены в отдельных микробиомах, они должны обеспечивать долгосрочную персистенцию бактерий в организме человека [26] и стабильность как «нормальных», так и патологических, с точки зрения организма хозяина, микробных сообществ [27]. В результате адаптационной изменчивости внутри одного штамма бактерий может происходить формирование независимых линий патогенов, которые приобретают или утрачивают способность к адгезии и колонизации конкретных биотопов. Так, спонтанно образовавшиеся адаптированные к слизистой оболочке линии штамма Enterococcus gallinarum обнаруживали повышенную способность к адгезии, транслокации в брыжеечные лимфатические узлы и печень, а также к индукции воспаления в кишечнике и печени по сравнению с исходным штаммом и выделенными из просвета кишки энтерококками этого вида. «Пристеночные» штаммы E. gallinarum избегали взаимодействия с клетками иммунной системы, более длительно персистировали в брыжеечных лимфатических узлах по сравнению с «просветными» штаммами [27]. При изучении генетических изменений были обнаружены несинонимичные мутации или вставки/делеции в регуляторных генах E. gallinarum, а также изменение уровня экспрессии ряда генов. С учётом того, что энтерококки являются причиной неонатальной бактериемии и сепсиса у детей в 10% случаев, а у взрослых случаи энтерококкового эндокардита составляют примерно 15% причин септического эндокардита [28], понимание механизмов адаптационной изменчивости этих микробов указывает на актуальность разработки методов коррекции патобиома.

Аналогичные способности к адаптивной мутации показаны для других постоянных компонентов нормобиома, доля которых повышается при снижении иммунной реактивности кишечника. Так, у здоровых пациентов незначительное количество P. aeruginosa в толстой кишке обычно рассматривается как норма [29], вместе с тем у пациентов в критическом состоянии присутствие синегнойной палочки в проксимальном отделе толстой кишки связано с повышенной смертностью — до 70%, что в 3 раза выше, чем у пациентов того же возраста в критическом состоянии, но с отрицательным посевом кала на этот микроорганизм [20]. Это, вероятно, связано не только с недостаточно эффективным ответом иммунной системы, но и со способностью P. aeruginosa к адаптивной мутации [26, 30], также повышающей её способность к адгезии и разрушению плотных контактов эпителиальных клеток [31].

Обнаруживаемые в составе микробиома одного человека субпопуляции Bacteroides fragilis содержат значительное разнообразие мобильных генетических элементов и нуклеотидов de novo, а также изменения экспрессии и модификации 16 генов, многие из которых участвуют в биосинтезе клеточной оболочки и утилизации полисахаридов. Полученные результаты иллюстрируют общие механизмы долгосрочной колонизации кишечника B. fragilis и её адаптации к другим составляющим микробиома [32].

Пробиотические штаммы, такие как бактерии Lactobacillus reuteri, также способны к уклонению от распознавания и воздействия иммунной системы хозяина [27], при этом показана возможность развития сепсиса при транслокации этой бактерии в кровь при её приёме для коррекции нарушений микрофлоры [33].

Таким образом, наряду с повышением микробной транслокации, количественными и качественными изменениями микробиома, адаптивная эволюция бактерий может рассматриваться как один из механизмов развития и прогрессирования патобиом-ассоцированных заболеваний [27], в том числе ССВО и сепсиса.

Механизмы участия липополисахаридов в развитии синдрома системного воспалительного ответа и сепсиса

В ходе длительных дискуссий и согласительных конференций было принято, что ССВО и сепсис вызываются не столько прямым повреждением патогенами и их токсинами, сколько тяжёлой иммунной и метаболической дисфункцией макроорганизма. В течение последних десятилетий XX века была разработана теория ведущей роли молекулярных паттернов, ассоциированных с повреждением (damage-associated molecular patterns, DAMPs), и молекулярных паттернов, ассоциированных с патогенами (pathogen-associated molecular patterns, PAMPs), с участием метаболических провоспалительных факторов. Молекулярные паттерны, ассоциированные с DAMPs, представляют собой группу различных типов молекул, полученных либо из различных компонентов клетки, либо из экзосом. В ситуации метаболических нарушений уровень образования DAMPs значительно увеличивается, они активируют рецепторы врождённой иммунной системы, в том числе рецепторы распознавания образов (pattern recognition receptor, PRRs). После взаимодействия с PRRs и различными неиммунными рецепторами DAMPs определяют следующий молекулярный сигнал, приводящий к сепсису [34].

Липополисахариды грамотрицательных бактерий (LPS) считаются наиболее иммуногенными PAMPs, способными вызывать ССВО и сепсис. LPS преимущественно распознаются toll-подобным рецептором-4 (toll-like receptor, TLR) и связываются с несколькими белками, присутствующими в клетках эукариот. Взаимодействие TLR4 с LPS через транскрипционный фактор NF-κB (nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells) индуцирует экспрессию провоспалительных цитокинов. Другие PAMP включают бактериальный флагеллин (распознаваемый TLR5), пептидогликан (распознаваемый TLR2), которые обнаруживаются как у грамположительных, так и грамотрицательных бактерий, а также липотейхоевые кислоты грамположительных бактерий (распознаваемые TLR2) [35].

LPS структурно состоит из трёх частей: липида A, основного олигосахарида и боковой цепи O. Липид А ― наиболее консервативная часть молекулы LPS, представляющая собой фосфорилированный гликолипид. Наиболее часто используемый LPS E. coli O176 хорошо изучен как по структуре, так и по функциональным свойствам. Обнаружено, что вирулентные свойства грамотрицательных бактерий в значительной степени определяются характеристиками LPS, находящихся в составе их внешней мембраны. Так, исследование образцов LPS, полученных из изолятов Enterobacter cloacae, выделенных от больных детей после вспышки фульминантного неонатального септического шока, показало структурную гетерогенность LPS, характеризовавшуюся различиями в строении липида А: было обнаружено 15 различных молекулярных его видов. Вирулентность E. cloacae коррелировала со структурными особенностями, обнаруженными при помощи масс-спектрометрии с лазерной десорбцией и других методов, позволивших установить наличие 2-гидроксимиристиновой кислоты в качестве заместителя в липиде А. По мнению авторов, 2-гидроксимиристиновая кислота может быть использована в качестве предиктивного маркера высокого риска развития ССВО и сепсиса [36].

Стимуляция клеток млекопитающих при введении LPS происходит через ряд взаимодействий с TLR4 и несколькими белками, включая LPS-связывающий белок, CD14 и MD-2. Липополисахаридсвязывающий белок LBP (lipopolysaccharide binding protein) представляет собой растворимый челночный белок, который непосредственно связывается с LPS и облегчает связь между LPS и CD14. LBP был предложен в качестве маркера острой фазы в 1999 году [37]. Сам по себе LBP не относится к PAMPs, но его уровень в сыворотке крови больных СВВО может использоваться для оценки тяжести течения воспалительной реакции. В сыворотке пациентов с тяжёлым сепсисом/септическим шоком была показана пониженная активность переноса LPS и повышение LPS-индуцированной секреции TNF-α по сравнению с сыворотками здоровых людей. LBP обеспечивает связь с LPS и его перенос на клеточный рецептор, состоящий из CD14 и TLR4. Недавно было показано, что высокие концентрации рекомбинантного LBP могут защитить мышей в модели перитонита от летального действия LPS. У пациентов, отвечающих критериям тяжёлого сепсиса или септического шока, в сыворотке крови была выявлена пониженная активность связывания LPS с LBP и более выраженная LPS-индуцированная секреция TNF-α по сравнению с сыворотками здоровых людей. Связывание LBP путём добавления к нему антител и последующее добавление рекомбинантного rhLBP подтвердили роль LBP как основного компонента сыворотки, ответственного за выраженность LPS-индуцированного воспаления при ССВО и сепсисе. Таким образом, ингибирование эффектов LPS высокими концентрациями LBP в острой фазе воспаления может представлять собой новый механизм фармакологического воздействия при тяжёлом сепсисе и во время бактериальных инфекций [38].

CD14 представляет собой гликозилфосфатидилинозитол-связанный белок, который существует в растворимой и связанной формах. CD14 облегчает перенос LPS на TLR4/MD-2 рецепторный комплекс и модулирует распознавание LPS. Комплекс LPS–LPBP–sCD14 в кровеносном русле расщепляется катепсином D и другими протеазами плазмы с высвобождением N-терминального фрагмента с молекулярной массой 13 кДа ― молекулы sCD14-subtype (sCD14-ST), которая получила название пресепсина (P-SEP) [39].

Среди других PAMP, изучение которых в связи с разработкой критериев прогнозирования сепсиса продолжается достаточно активно, следует упомянуть прежде всего тейхоевые кислоты и пептидогликаны.

Тейхоевые кислоты

Бактерии окружены сложной клеточной оболочкой, которая выполняет множество функций. Клеточные оболочки различаются по структуре, но все они содержат слои пептидогликана (peptidoglycan, PG) ― сшитого матрикса линейных углеводных (гликановых) цепей, связанных друг с другом ковалентными связями между присоединёнными пептидами (рис. 1).

 

Рис. 1. Схематическое изображение клеточной стенки грамположительной бактерии (цит. по [40]). / Fig. 1. Schematic representation of the cell wall of a Gram-positive bacterium (according to [40]).

 

Пептидогликановый матрикс необходим для выживания, и у грамположительных организмов он плотно «сшит» с другими полимерами. Тейхоевые кислоты представляют собой анионные альдитол-фосфатные полимеры, которые в большом количестве обнаруживаются в клеточной оболочке грамположительных бактерий. Они важны для физиологии и вирулентных свойств бактериальных клеток и могут быть подразделены на тейхоевые кислоты клеточной стенки (wall teichoic acid, WTA) [40] и липотейхоевые кислоты (lipoteichoic acid, LTA) [41]. WTA ковалентно связаны с пептидогликаном, а липотейхоевые кислоты связаны с мембраной. Оба полимера клеточной стенки участвуют во множестве биологических функций, таких как поддержание ионного гомеостаза, деление клеток, уклонение от иммунитета хозяина и устойчивость к таким катионным антимикробным пептидам,как полимиксин В [42]. WTA являются наиболее распространёнными PG-связанными полимерами у грамположительных бактерий. Они участвуют в процессах клеточного деления и необходимы для поддержания палочковидной формы клеток. WTA необходимы для устойчивости к β-лактамам у метициллинрезистентного S. aureus и модулируют чувствительность к катионным антибиотикам. WTA благодаря своей важной роли в патогенезе являются возможными мишенями для новых терапевтических средств для преодоления резистентности бактериальных инфекций. Хотя WTA не является обязательным условием для роста и жизнеспособности клеток, мутанты WTA-null проявляют ослабленную вирулентность и колонизацию хозяина во время инфекции. Их роль в качестве PAMPs не столь велика, как LTA, которая, напротив, чрезвычайно важна для выживания бактерий. LTA по характеристикам близка к периплазматическим гликанам [41] и является регулятором аутолитических ферментов стенки (мурамидаз). В зависимости от химической структуры высвобождаемых из бактериальных клеток LTA, в настоящее время выделяют 4 типа [41]. Бактериолиз может быть вызван лизоцимом, катионными пептидами или бета-лактамными антибиотиками. LTA неспецифически связывается с мембранными фосфолипидами клеток-мишеней, либо специфически взаимодействует с CD14 и TLR. LTA, связанная с фосфолипидами, может взаимодействовать с циркулирующими антителами и активировать каскад комплемента, вызывая реакции врождённого иммунного ответа. Она также вызывает высвобождение из нейтрофилов и макрофагов активных форм кислорода и оксида азота, кислых гидролаз, протеиназ, бактерицидных катионных пептидов, факторов роста и цитотоксических цитокинов, которые могут действовать синергически, усиливая повреждение клеток.

Таким образом, механизм действия LTA аналогичен действию LPS. В исследованиях на животных LTA вызывала артрит, нефрит, увеит, энцефаломиелит, менингит и пародонтит, а также запускала сигнальные пути, приводящие к септическому шоку и полиорганной недостаточности [43]. Связывание LTA с мишенями может сдерживаться антителами, фосфолипидами и специфическими антителами к CD14 и TLR, а in vitro её высвобождение может быть блокировано небактериолитическими антибиотиками и полисульфатами, такими как гепарин, которые, вероятно, препятствуют активации аутолиза [44]. LTA, выделенная из S. aureus, состоит из 1,3-полиглицеролфосфата, прикреплённого к грамположительной мембране с помощью гликолипидного якоря [45]. Структура LTA различна у разных видов бактерий: значительную вариабельность имеет длина глицериновой цепи, в том числе её гликолипидной части, и прикреплённые боковые группы [46]. Видимо, эти структурные различия ассоциированы с эффектом LTA. В эксперименте внутрибрюшинное введение 10 мкг LTA B. subtilis вызывало у крыс монофазное повышение температуры тела, в то время как дозы 100 и 250 мкг вызывали первоначальную гипотермию с последующей лихорадкой. Введение 250 мкг LTA S. aureus вызывало монофазную гипотермию, а введение 300 мкг/кг LTA S. aureus непосредственно в воротную вену не влияло на температуру тела. Роль LTA в передаче сигналов грамположительными бактериями в организме хозяина аналогична роли LPS/эндотоксина в передаче сигналов грамотрицательными микробами [47].

Исходя из всех этих данных, LTA можно считать фактором вирулентности, который играет важную роль в инфекционно-воспалительных процессах и постинфекционных осложнениях, вызванных грамположительными бактериями [41, 48].

Пептидогликаны

Пептидогликаны (peptidoglycans, PG) также являются PAMPs, составляют значительную долю сухой массы грамположительных бактерий и образуют лишь небольшой слой под внешней мембраной у грамотрицательных бактерий. PG могут перемещаться в системный кровоток после лизиса бактерий [43]. PG состоят из чередующихся остатков N-ацетилглюкозамина (N-acetylglucosamine, NAG) и N-ацетилмураминовой кислоты (N-acetylmuramic acid, NAM), которые связаны в β-конфигурации с нитями, сшитыми между тетрапептидными цепями на молекулах NAM. Большая часть различий в PG у разных видов бактерий связана с различиями в пептидной цепи. У грамотрицательных бактерий связь образуется непосредственно, а у грамположительных бактерий ― через аминокислотный мостик. Третий аминокислотный остаток в этих цепях также варьирует. Грамположительные бактерии содержат L-лизин, в то время как грамотрицательные бактерии обладают остатком мезо-диаминопимелиновой кислоты (мезо-DAP). Модификации распространены в концевых остатках тетрапептидной цепи, что приводит к устойчивости к антибиотикам. Замена D-ala на D-lac в терминальном дипептиде предотвращает активность ванкомицина [43]. Как показано, эффект действия LTA и пептидогликана является синергичным, в связи с чем механизм развития грамположительного сепсиса, вызванного введением этих компонентов, отличен от механизма LPS-индуцированного сепсиса [49].

Передача сигналов LTA и PG

Грамположительные и грамотрицательные патогены продуцируют PG разного строения и в разном количестве. Вероятно, TLR2 обладает большей аффинностью к грамположительному пептидогликану, который имеет более высокое содержание лизина, чем грамотрицательный PG, что может обеспечить эволюционное преимущество, предотвращая гиперактивацию иммунной системы [50]. Грамположительные PAMPs передают сигналы по различным путям, преимущественно через NOD-подобные рецепторы (NOD-like receptors, NLR), которые представляют собой высококонсервативные рецепторы распознавания цитозольных паттернов DAMPs. NLR выполняют основные функции мониторинга внутриклеточной среды организма на наличие инфекции, вредных веществ и метаболических нарушений. Связывание«сигналов опасности» с NLR приводит к олигомеризации в большие макромолекулярные структуры с последующим развитием эффекторных сигнальных каскадов. В то время как некоторые NLR действуют путём рекрутирования и активации воспалительных каспаз в инфламмасомах, другие запускают воспаление альтернативными путями, включая ядерный фактор-κB, митогенактивируемую протеинкиназу (mitogen-activated protein kinase, MAPK) и пути регуляторных факторов. Доказана роль NLRs в патогенезе ряда заболеваний, включая аллергический ринит, рассеянный склероз, воспалительное заболевание кишечника, астму, мультибациллярную проказу, витилиго, раннюю менопаузу и др. [51]. Нуклеотид связывающий домен олигомеризации (NOD) действует как PRR для распознавания врождённого иммунитета в цитозоле хозяина и является основным рецептором, через который происходит распознавание пептидогликанов. NOD представляет собой центральную часть NLR, в котором также различают N-концевой гомотипический домен белок-белкового взаимодействия и C-концевую серию богатых лейцином повторов (LRR), участвующих в восприятии агонистов или связывании лиганда. После связывания лиганда LRR претерпевает конформационные изменения, которые обнажают N-концевой домен, позволяя взаимодействовать с нижестоящими сигнальными адаптерами или эффекторами и формировать олигомерный комплекс [52].

NLR, как и TLR, распознают PAMPs по богатым лейцином повторам (LRR). Основное различие между TLR и NLR заключается в их расположении: TLR обычно связаны с мембраной, в то время как NLR являются цитозольным рецептором. NOD1 и NOD2 принадлежат к подсемейству NLRC NLR, поскольку они содержат N-концевой домен CARD, они также обозначаются как NLRC1 и NLRC2 соответственно. NOD1 и NOD2 имеют аналогичную архитектуру доменов, но отличаются количеством доменов CARD. NOD1 содержит один домен, тогда как в NOD2 обнаружены два тандемных домена CARD. NOD1 распознаёт κ-D-глутамил-мезо-диаминопимелиновую кислоту, в то время как NOD2 ― мурамилдипептидный компонент PG. RIP2/RICK рекрутируются в домен CARD NOD, который впоследствии активирует NF-κB ― общую конечную точку многих сигнальных путей PRR [53].

Интернализация и деградация патогенов клетками врождённого иммунитета высвобождает основной компонент PG ― N-ацетилглюкозамин (NAG) ― в цитозоль иммунной клетки. Гексокиназа, гликолитический фермент, присутствующий в цитозоле, конкурентно ингибируется NAG и связывается с митохондриальной мембраной, активируя инфламмасому NLRP3, что является отличительной чертой грамположительных инфекций [43]. Таким образом, гексокиназа опосредует NLRP3-зависимую от инфламмасомы секрецию IL-1β ― путь, отличный от классических активаторов инфламмасомы [54]. Гексогиназный путь активации инфламмасом был показан при действии пептидогликана Bacillus anthracis. Деацетилирование пептидогликана коррелирует со снижением активации инфламмасом [53]. Ингибирование гликолитического фермента и активация инфламмасомы также наблюдались при ведении S. typhimurium [43].

Сигнальные пути, активируемые при воздействии липотейхоевой кислоты, зависят от их исходного источника. Известно, что LTA, выделенная из различных видов лактобацилл, различается по структуре и уровню выработки цитокинов через путь MAPK [55]. Специфическим рецептором для LTA служит TLR2, после активации которого включается нисходящий сигнальный путь аналогично описанному выше LPS-индуцируемому TLR4-сигналу. Адаптер MyD88 рекрутируется в TLR для индуцирования продукции провоспалительных цитокинов. Внутриклеточный TRAM может служить адаптерным белком как для передачи сигналов LPS, так и LTA в некоторых клеточных линиях, обеспечивая альтернативный адаптерный белок [56]. Токсичность LTA может быть усилена за счёт синергизма с гемоглобином для активации TLR2 и TLR4-зависимых ответов в макрофагах [43]. LTA Lactobacillus plantarum может ингибировать иммунные эффекты LPS, в частности снижая выработку TNF-α [57]. LTA также может индуцировать выработку оксида азота. Структурные изменения, такие как замены D-аланина и длина глицериновой цепи, модулируют выработку оксида азота у различных видов бацилл [43]. В некоторых первоначальных исследованиях некоторая активность LTA, продуцирующая оксид азота, была результатом загрязнения эндотоксина в коммерческом препарате [43].

Хотя о роли грамположительных токсинов в механизмах развития сепсиса известно значительно меньше, в нескольких исследованиях предпринимались попытки провести сравнение с грамотрицательным сепсисом. Основываясь на различиях в передаче сигналов, можно ожидать некоторых различий в иммунном ответе и изменениях микроциркуляции, но степень этого в значительной степени не изучена. B.G. Yipp и соавт. [58] сравнили лейкоцитарно-эндотелиальные взаимодействия с использованием прижизненной микроскопии при системном введении LPS или LTA. Очищенный LTA приводил к гораздо более слабому ответу, чем очищенный LPS, но ответ на введение живого S. aureus был похож на реакцию на введение LPS [58]. Это позволяет предположить, что PG может быть ответственным за большую часть иммунного ответа на грамположительные патогены. В дополнение к этим известным различиям существует некоторая перекрёстная реактивность между грамположительными и грамотрицательными PAMPs. Белки распознавания пептидогликанов (PGRPs), секретируемые клетками-хозяевами, связываются с пептидогликаном на поверхности патогенов. Эти белки также обладают переменным сродством к другим PAMP, включая LPS, LTA и миколевую кислоту [59]. Уничтожение бактерий этими белками опосредуется несколькими способами, включая прямое разрушение связей PG и усиление иммунного распознавания фагоцитами. Дефицит PGRP не вызывал фенотипических изменений в иммунном ответе мыши, что позволяет предположить, что эти белки служат дополнительным защитным иммунным механизмом [43]. Эта перекрёстная реактивность также наблюдалась в LPS-связывающих белках (LBPs). Было показано, что LBP распознают гликановую основу клеточной стенки пневмококка, что указывает на дополнительную роль в грамположительных инфекциях [43] (рис. 2). Эти резервные механизмы обеспечивают дополнительный уровень защиты для хозяина в случае проблемы с первичными механизмами реагирования. Знание как различий в реакции, так и возможной перекрёстной реактивности имеет важное значение для проведения прямых сравнений между грамположительными и грамотрицательными токсинами.

 

Рис. 2. Грамположительные и грамотрицательные бактериальные патогенассоциированные молекулярные паттерны (PAMPs) взаимодействуют с различными мембраносвязанными и цитозольными рецепторами в клетке-хозяине. LPS ― липополисахарид; PG ― пептидогликан; LTA ― липотейхоевая кислота; TLR ― toll-подобный рецептор; NOD ― нуклеотидсвязывающий домен олигомеризации, содержащий белок; NAIP ― белок, ингибирующий апоптоз NOD-подобного рецептора; HBP ― гептозо-1,7-бисфосфат; ALPK1 ― альфа-киназа-1 (цит. по [43]). / Fig. 2. Gram-positive and Gram-negative bacterial pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) interact with various membrane-bound and cytosolic receptors in the host cell. LPS ― lipopolysaccharide; PG ― peptidoglycan; LTA ― lipoteichoic acid; TLR ― toll-like receptor; NOD ― nucleotide-binding oligomerization domain containing protein; NAIP ― protein that inhibits NOD-like receptor apoptosis; HBP ― heptose-1,7-bisphosphate; ALPK1 ― alpha kinase-1 (quoted from [43]).

 

Подобно высвобождению эндотоксина грамотрицательными патогенами, биодоступность PG и LTA из S. aureus может быть увеличена введением β-лактамных антибиотиков, что способствует развитию воспалительной патологии за счёт усиления высвобождения провоспалительных цитокинов [60]. Введение антибиотиков-ингибиторов синтеза белка не оказывало влияния на высвобождение PG, но высвобождение LTA было снижено [60]. Эти данные свидетельствуют о том, что при лечении инфекции, независимо от грамположительного статуса организма, необходимо тщательно подбирать антибиотики, поскольку выделение токсина зависит от механизма действия антибиотика. Это даёт дополнительные доказательства того, что в борьбе с инфекциями роль терапии может быть важна, и её можно предварительно оценить с использованием моделей эндотоксемии.

Другие бактериальные PAMPs

Лизис бактериальных клеток часто высвобождает ряд других молекул, которые могут действовать как PAMP, вызывая активацию иммунного ответа. К таким молекулам относят флагеллин, порины, липопротеины и гептозо-1,7-бисфосфат. Хотя они и не являются строго токсинами, они способны активировать врождённые иммунные реакции.

Бактериальный флагеллин представляет собой консервативную структуру, которая может действовать как бактериальный PAMP, являясь основным белковым компонентом жгутиков подвижных бактерий. Как и в случае ранее обсуждаемых PAMP грамотрицательных и грамположительных бактерий, распознавание флагеллина опосредуется TLR5, связывающимися с компонентами бактериальной мембраны. TLR5 распознает флагеллин как грамотрицательных, так и грамположительных патогенов и передаёт сигналы через цитозольный адаптерный белок MyD88 [61]. Флагеллин может также влиять на микроциркуляцию, усиливая миграцию лейкоцитов, опосредованную TLR5, экспрессируемых на эндотелиальных клетках микроциркуляторного русла [43]. Показано, что бактерия Helicobacter pylori является заметным исключением, поскольку изменённая аминокислотная последовательность его флагеллина препятствует иммунному распознаванию TLR5, обеспечивая таким образом персистирование возбудителя в организме хозяина [43].

Различные NAIP (белок, ингибирующий апоптоз NOD-подобного рецептора), которые являются NOD-LRR в инфламмасоме, обнаруживают цитоплазматический флагеллин и компоненты бактериальных систем секреции 3-го типа, ответственных за инъекцию белков вирулентности, для опосредования каспазазависимых иммунных ответов. Множественные изоформы NAIP человека позволяют обнаруживать внутренние стержневые и игольчатые белки, флагеллин у различных видов бактерий, опосредуя таким образом иммунный ответ путём формирования инфламмасомы NLRC4 [62].

Инфламмасома NAIP-NLRC4 реагирует на цитозольный флагеллин и внутренние стержневые и игольчатые белки системы секреции бактерий 3-го типа. Этот комплекс индуцирует каспаза-1-зависимое протеолитическое расщепление провоспалительных цитокинов IL-1β и IL-18 и порообразующего белка Gasdermin D, что приводит к воспалению и пироптозу соответственно. Локализованные реакции, вызванные инфламмасомой NAIP-NLRC4, в значительной степени защищают от бактериальных патогенов благодаря нескольким механизмам, включая высвобождение медиаторов воспаления, освобождение скрытых внутриклеточных патогенов для их последующего уничтожения другими иммунными механизмами, активацию апоптотических каспаз (каспазы-7 и каспазы-8) и удаление всех инфицированных клеток из организма хозяина. Напротив, нарушение активации инфламмасомы NAIP-NLRC4 вследствие возникновения мутаций в гене, кодирующем NLRC4, может привести к активации макрофагов, энтероколиту новорождённых, тромботической васкулопатии плода, семейному аутовоспалительному синдрому и даже смерти. Некоторые из этих клинических проявлений можно лечить с помощью таргетных препаратов, направленных на продукцию цитокинов, вызванную инфламмасомой NAIP-NLRC4 [63].

Различные бактериальные порины могут активировать передачу сигналов через TLR2. Они могут действовать как PAMP самостоятельно или совместно с LPS. TLR2 распознаёт порины Shigella flexneri и запускает активацию NF-κB, аналогично действию LPS, но с разной продукцией цитокинов [64]. Передача сигнала отпоринов Neisseria sрp. также осуществляется через TLR2 [43].

Уровень продукции cпецифических аквапоринов может повышаться или понижаться в ответ на введение LPS, что позволяет предположить, что они могут играть роль в патогенезе сепсиса. Так, порин холерного вибриона OmpU является провоспалительным, но он подавляет провоспалительный ответ TLR4 на LPS [65]. LPS, шига-токсин и холерный токсин изменяют уровень экспрессии аквапорина [66]. Аквапорины могут усиливать миграцию иммунных клеток через приток воды, способствуя ремоделированию актина, подобно AQP9, действующему в нейтрофилах [43]. Известно также, что экспрессия AQP1 повышается при сепсисе у человека, вероятно, из-за активации, вызванной LPS [67]. Порины могут выступать в роли индукции ССВО и сепсиса как самостоятельно, так и совместно с LPS [66].

Некоторые грамотрицательные бактерии экспрессируют гептозо-1,7-бисфосфат (HBP), который является основным промежуточным продуктом для синтеза LPS и компонентом грамотрицательных клеточных стенок. Известно, что HBP переносится в клетку-хозяина через систему секреции IV типа у H. pylori, активируемую межклеточным контрактом, где он затем может активировать NF-κB из цитозоля. Показано также, что HBP, выделенный из Shigella и Neisseria, действует как агонист врождённого иммунитета посредством взаимодействия с рецепторной альфа-киназой 1 (ALPK1) [68]. Затем ALPK1, взаимодействуя с Traf-взаимодействующим белком хозяина через специфический сигнальный путь, приводит к NF-κB-зависимому иммунитету против грамотрицательных бактерий [69].

Взаимодействие PAMP с липопротеинами

Бактериальные липопротеины действуют как мост между PG и наружной мембраной у грамотрицательных бактерий. У грамположительных бактерий липопротеины находятся в узком периплазматическом пространстве между слоем пептидогликанов и клеточной мембраной. Эти относительно консервативные белковые структуры могут действовать как бактериальные PAMPs, передавая сигналы через TLR. Липопротеины распознаются главным образом TLR2, но TLR1, 6 и 10 также участвуют в образовании гетеродимеров с TLR2 для различения специфических липопротеинов [69].

LPS и липопротеины могут действовать синергически, продуцируя цитокины отдельными путями, что позволяет предположить, что липопротеины могут играть важную роль в механизме развития сепсиса [70]. Кроме того, введение мышам липопротеина индуцировало перекрёстную толерантность к последующему воздействию как липопротеина, так и LPS, и даже целых бактерий в моделях эндотоксемии и перевязки слепой кишки и пункции [71]. Перекрёстная толерантность может опосредоваться через TLR2 и через TLR6 мышиных макрофагов [43]. Частичная перекрёстная толерантность к грамположительному сепсису может быть вызвана введением LPS, что предполагает некоторые общие элементы в путях активации других грамположительных PAMPs [43].

По химической природе как LPS грамотрицательных патогенов, так и LTA грамположительных бактерий являются амфифильными молекулами, содержащими как гидрофобные, так и гидрофильные фрагменты, и закреплёнными в клеточной мембране липидной частью с открытой гидрофильной частью. Это биохимическое свойство делает PAMPs нестабильными в водной среде крови и облегчает их взаимодействие с белками сыворотки, липопротеинами высокой и низкой плотности [72, 73], а также LPS-связывающим белком [74]. Эта особенность липопротеинов, входящих в структуры бактерий, обусловливает способность бактериальных PAMP взаимодействовать с липопротеинами сыворотки крови хозяина. Было показано, что при введении LTA золотистого стафилококка (S. aureus) в цельной крови здоровых людей более 95% было связано с общими липопротеинами плазмы в следующих пропорциях: липопротеины высокой плотности (ЛПВП) ― 68±10%; липопротеины низкой плотности (ЛПНП) ― 28±8%; липопротеины очень низкой плотности (ЛПОНП) ― 4±5%. Насыщающая способность липопротеинов для LTA превышала 150 мкг/мл. Распределение LTA зависело от температуры с оптимальным связыванием между 22°С и 37°C. Связывание LTA липопротеинами завершалось в течение 10 минут и сопровождалось последующим перераспределением из ЛПВП и ЛПОНП в ЛПНП [72].

LPB циркулирует в системном кровотоке в сочетании с apoB-содержащими липопротеинами и усиливает взаимодействие LPS-ЛПНП/ЛПОНП. При сепсисе в сыворотке крови, содержащей высокие уровни LBP и изменённый спектр липопротеинов, большая часть LBP была связана с ЛПНП и ЛПОНП, хотя некоторые LBP, по-видимому, циркулируют в несвязанном состоянии. При этом LPS связывается преимущественно с ЛПНП и ЛПОНП [74]. Показано также, что клиренс LTA проходит по тому же пути, что и LPS, и зависит от уровня экспрессии рецепторов ЛПНП в гепатоцитах [75].

Таким образом, определение содержания липопротеидов всех классов ввиду их особой роли в транспорте амфифильных компонентов бактериальной стенки является значимым критерием при оценке тяжести воспалительного ответа при сепсисе. Будущая разработка эффективных антибактериальных препаратов и стратегий комбинированного применения для ослабления LTA-индуцированной секреции провоспалительных агонистов имеет большое значение для борьбы с шоком и полиорганной недостаточностью, вызванной грамположительными бактериями, включая сепсис. В недавних экспериментах с S. aureus с использованием высокоэффективных хроматографических методов и масс-спектрометрии было обнаружено массовое образование липидных медиаторов с отчётливо выраженными особенностями их профилей в острой и хронической фазах остеомиелита, вызванного введением этого возбудителя.

Подводя итоги, можно сказать, что значительная часть известного на сегодняшний день микробиома человека относится к малоизученным и некультивируемым микроорганизмам [76]. Предсказать возможные сценарии развития воспалительных процессов достаточно сложно. Выход из сложившейся ситуации видится в предварительной оценке уровня PAMPs в крови и персонификации терапии, проводимой с целью его снижения. Это позволит снизить тяжесть течения ССВО и предупредить развитие сепсиса.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, развитие системного воспалительного ответа и сепсиса сопровождается выраженной иммунной и метаболической дисфункцией организма после контакта с инфекционным агентом. В понимании патогенеза ССВО и сепсиса, помимо иммунологических механизмов, генетически и фенотипически обусловленных индивидуальных реакций макроорганизма, необходимо учитывать влияние преформированного микробиома/патобиома, который в совокупности с нарушениями механизмов адаптации, иммунной защиты и регенерации способен стать источником продукции патоген ассоциированных молекулярных паттернов взаимодействия: липополисахаридов, пептидогликанов, липотейхоевых кислот, флагеллина и некоторых других, ассоциированных с микроорганизмами, соединений. Вместе с тем нормальный микробиом призван стабилизировать состояние организма пациента вследствие нормализации процессов, происходящих в барьерных тканях, на которых находятся компоненты микробиома. При остром и хроническом стрессорном воздействии происходит переформатирование состава микробиома в патобиом, компоненты которого уже могут активно вмешаться в развитие ССВО и сепсиса в организме пациента, модулируя его. При этом следует учитывать, что лечебные мероприятия при сепсисе, способствуя выходу организма больного из критического состояния, отнюдь не способствуют нормализации микробиома и в лучшем случае способны привести к некоему неустойчивому и поддерживаемому постоянным введением пробиотиков состоянию микробиома или возврату к устойчивому микробному гомеостазу (патобиому), наличие которого, в частности, приводит к тяжёлым воспалительным осложнениям.

ДОПОЛНИТЕЛЬНО

Источник финансирования. Авторы заявляют об отсутствии внешнего финансирования при проведении поисково-аналитической работы.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Вклад авторов. Все авторы подтверждают соответствие своего авторства международным критериям ICMJE (все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции, проведение поисково-аналитической работы и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией). Наибольший вклад распределён следующим образом: Хомякова Т.И., Хомяков Ю.Н. — сбор и анализ литературных данных, написание текста статьи; Макарова О.В. — сбор и анализ литературных данных, написание текста статьи, общее редактирование.

ADDITIONAL INFORMATION

Funding source. This article was not supported by any external sources of funding.

Competing interests. The authors declare that they have no competing interests.

Authors’ contribution. All authors made a substantial contribution to the conception of the work, acquisition, analysis, interpretation of data for the work, drafting and revising the work, final approval of the version to be published and agree to be accountable for all aspects of the work. Khomyakova T.I., Khomyakov Yu.N. — collection and analysis of literature data, writing the text of the article; Makarova O.V. — collection and analysis of literature data, writing and editing the article.

 

¹ LD50 ― средняя доза вещества, вызывающая гибель половины членов испытуемой группы.

About the authors

Tatyana I. Khomyakova

Avtsyn Research Institute of Human Morphology

Author for correspondence.
Email: tatkhom@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-3451-1952

MD, Cand. Sci. (Med.)

Russian Federation, 3 Tsyurupa street, 117418 Moscow

Yuri N. Khomyakov

Avtsyn Research Institute of Human Morphology

Email: khomyakovyuri@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-0540-252X
Scopus Author ID: 6602074139
ResearcherId: ACY-0748-2022

MD, Cand. Sci. (Med.), Dr. Sci. (Biol.)

Russian Federation, 3 Tsyurupa street, 117418 Moscow

Olga V. Makarova

Avtsyn Research Institute of Human Morphology

Email: makarov.olga2013@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-8581-107X

MD, Dr. Sci. (Med.), Professor

Russian Federation, 3 Tsyurupa street, 117418 Moscow

References

Supplementary files