The use of human placenta for purification of normal and immune animal sera

Full Text

Нормальные и специфические сыворотки млекопитающих широко применяются в лечебнопрофилактических и диагностических целях, а также являются неотъемлемой частью различных исследовательских проектов. Недостатком многих сывороточных препаратов, существенно ухудшающих их эксплуатационные характеристики, является токсичность. В частности, токсичность, проявляемая кроличьими поликлональными энтеровирусными сыворотками (ЭДС) отечественного производства в отношении индикаторных клеток, используемых в регламентированной ВОЗ диагностической реакции нейтрализации, способствует ложноотрицательной интерпретации получаемых результатов [1]. Необходимость снижения или устранения токсичности ЭДС вызвана тем, что эти препараты является диагностическим ресурсом, широко применяемым при выполнении на территории Российской Федерации программы ВОЗ по эпидемиологическому надзору за энтеровирусами [2]. Очистке ЭДС длительное время препятствовали представления о «видовом» характере цитотоксичности кроличьих сывороток и связи этого эффекта с иммуноглобулинами [3-5]. Так как эти точки зрения не получили экспериментального подтверждения [1], нами были предприняты поиски эффективных методов очистки, приемлемых для малообъемного серийного производства энтеровирусных сывороток. Большинство существующих промышленных и лабораторных методов удаления токсичных примесей рассчитаны на обработку значительных количеств сывороток и обычно сопровождаются потерей 10-50% объема целевых продуктов. Кроме того. многоэтапные схемы очистки требовали использования специального оборудования и реагентов, существенно увеличивающих операционные затраты. Более рациональной представлялась очистка энте- ровирусных сывороток с применением упрощенных технологий, не приводящих к денатурации белков. В наших предварительных экспериментах были получены удовлетворительные показатели остаточной токсичности отдельных ЭДС, обработанных тканями человеческой плаценты [6]. В настоящем сообщении приводятся данные об оптимальных режимах обработки тканями человеческой плаценты пригодных для очистки всех токсичных ЭДС, а также токсичных нормальных сывороток животных некоторых видов. Материалы и методы Плаценты получали от доноров с неотягощенным анамнезом и без патологии беременности. Препараты цельных плацент сохраняли от момента изъятия до обработки («10-12 ч) в фосфатно-солевом буфере, рН 7,4 (ФСБ) при 40С. Первичную обработку плацент (удаление оболочки и сосудистых сплетений, разделение паренхимы на фрагменты площадью « 1,5 см2) проводили с соблюдением правил асептики и антисептики. Фрагменты паренхимы индивидуальных плацент размельчали в течение 0,5-3 мин в гомогенизаторе (Waring 8010S, «17 000 об/мин) с целью увеличения площади контакта с очищаемыми сыворотками. Размельченные ткани отмывали до обесцвечивания в повторных циклах центрифугирования (15 мин при 1000 g), используя в каждом цикле новые порции ФСБ. Обесцвеченный гомогенат сохраняли при -200С в виде 20% суспензии в ФСБ. Продуцентами ЭДС были кролики породы русская шиншилла (питомник «Электрогорский» ФГБУН НЦБМТ ФМБА России) и овцы романовской породы (данных о поставщике не имеется). Нормальные сыворотки были получены от африканских зеленых мартышек, предназначаемых для оценки нейровирулентности пероральной полио- миелитной вакцины, и от крупного рогатого скота (фирма «Фуро»). Кроликов, овец и крупный рогатый скот разводили и содержали в открытых (конвенциональных) системах. Обезьяны были отловлены в местах естественного обитания (Танзания). Очистке были подвергнуты смеси токсичных кроличьих сывороток, специфичных к полиовирусу 1, 2, 3-го типов, к вирусам Коксаки А 2, 4, 7, 9, 10 типов, Коксаки В 1-6 типов, ЕСНО 2-9, 11-13, 16, 20, 21, 25, 27, 29, 30, 33-го типов, к энтеровирусам 68-71 (каждая смесь включала 5 - 7 однотипных индивидуальных сывороток), 3 токсичные овечьи сыворотки, специфичные к полиовирусу 1, 2, 3-го типов, а также токсичные нормальные сыворотки трех обезьян и образцы пяти серий токсичных нормальных сывороток крупного рогатого скота. Образцы сывороточных смесей и индивидуальных сывороток объемом 10 мл каждая термоинакти- вировали (30’ при 560С), смешивали по отдельности с тканями плацент различной дисперстности в объемных соотношениях 1,0»0,5; 1,0*1,0; 1,0»2,0 и инкубировали при 360С в течение 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5 ч с перемешиванием через каждые 15 мин. После этого ткани плацент осаждали в рефрижераторной центрифуге (15 мин при 6000g). Полученные сыворотки фильтровали (фильтры Millipore AAwP 0,8 мкм, DAwP 0,65 мкм, HAwP 0,45 мкм, GSwP 0,22 мкм) и измеряли уровни их токсического воздействия на клетки RD и НЕр-2-С в условиях микрометода реакции нейтрализации. скрс 5 скрс 4 скрс 3 скрс 2 скрс 1 сзм - сзм Результаты и обсуждение На основании анализа профилей токсичности очищенных сывороток были определены режимы получения максимально активных тканей плацент и оптимальные условия их применения. Наибольшей адсорбционной емкостью обладали ткани плацент, размельчаемые в течение 1,5-2,0 мин. Контакт с таких тканей с эквивалентными объемами нормальных и иммунных сывороток (2 ч при 360С и 18-20 ч при 40С) приводил к максимальному снижению токсичности. Было отмечено, что показатели остаточной токсичности сывороток, обработанных тканями индивидуальных плацент, незначительно различаются. Стабильные результаты очистки сывороток были получены после их обработки смесями тканей нескольких плацент. На диаграмме представлены результаты однократной обработки образцов токсичных иммунных и нормальных сывороток тканями плацент в оптимальных условиях. Можно видеть, что токсичность большей части иммунных сывороток и всех нормальных сывороток была ниже определяемого уровня (разведение 1:5). Остаточная токсичность определялась в диапазоне разведений сывороток 1:5-1:30, что было в 4-8 раз ниже их рабочих разведений, используемых в реакции нейтрализации. Полная очистка таких сывороток достигалась путем их повторной обработки тканями плаценты. Помимо высокой эффективности очистки иммунных и нормальных сывороток тканями плаценты преимуществами метода было сохранение целевыми продуктами своего первоначального объема, проведение очистки на стандартном лабораторном оборудовании, отсутствие значительных операционных затрат. Возможность длительной консервации тканей плацент (не менее трех лет при -200С) позволяла проводить предварительно оценку их функциональной активности и, следовательно, прогнозировать результаты очистки сывороток. Сохранение очищенными иммунными сыворотками начальной специфической активности подтвердили данные об иммунонезависимости цитотоксичности, но оставили нерешенным вопрос о детерминантах этого свойства. Ранее было показано, что цитотоксичность является характерной особенностью большинства ЭДС, полученных в результате внутривенных иммунизаций кроликов, и практически отсутствует в сыворотках кроликов, иммунизированных внутримышечно [7]. Известно, что массивное поступление антигенов в кровеносное 91' 63 17' ПЗ со П2 со П1 Э71 Э70 Э69 Э68 ЕЗЗ ЕЗО Е29 Е27 Е25 Е20 Е16 Е13 Е12 Е11 Е9 Е8 Е7 Е6 Е5 Е4 ЕЗ' Е2 КВ6 КВ5 КВ4 КВЗ КВ2 КВ1 КВ10 КВ9 КВ7 КВ4 КВ2 ПЗ П2 П1' сзм со I жофтсоооос 0 40 Начальная токсичность 80 120 140 I Остаточноя токсичность Показатели токсичности сывороток животных до и после обработки тканями плаценты. По оси ординат - кроличьи сыворотки полиомиелитные (П), Коксаки А (КА), Коксаки В (КВ), ЕСНО (Е), энтеровирусные (Э), сыворотки овец (со); цифрами обозначены серотипы сывороток. Нормальные сыворотки зеленых мартышек (сзм); цифрами обозначены номера обезьян. Нормальные сыворотки крупного рогатого скота (скрс), цифрами обозначены их порядковые номера. русло при многократных внутривенных инъекциях приводит наряду с выработкой антител к формированию комплексов антиген-антитело, нарушающих целостность стенок кровеносных сосудов [8]. Развивающиеся в результате этого местные и общие ответные реакции воздействуют на гуморальноклеточную реактивность организма, изменяют гематологические и биохимические показатели и являются причиной патологических изменений внутренних органов [9]. Возможно, что подобные эффекты могут быть причинами сывороточного токсикоза. Следует отметить, что сдвиг физиологических констант наблюдается также при несоблюдении правил зоогигиены в питомниках и в вивариях, а также в результате различных стрессовых ситуаций, нарушающих симбиоз организма с аутофлорой и активирующих факультативные микроорганизмы. Подобные ситуации нередки при содержании животных в конвенциональных системах. Результаты проведенных экспериментов свидетельствуют о распространении природных защитных свойств человеческой плаценты на цитотоксич- ные субстанции, присутствующие в нормальных и иммунных сыворотках животных. Кроме этого они подтверждают селективность барьерной функции плаценты, являющейся не только мощным фактором врожденного иммунитета, но и источником различных неспецифических защитных реакций, активирующихся при беременности. В физиологических условиях тканеспецифическая функция плаценты, проявляющаяся в инактивации чужеродных белков, обеспечивается протеолитическими свойствами трофобласта. Его элементы активно экспрессируют антимикробные субстанции HBD 1-3 и элафин, препятствующие проникновению патогенных продуктов из крови матери к плоду [10, 11]. Возможно, что указанные структуры и субстанции предохраняют плод от токсичных антител, циркулирующих в материнской крови во II-III триместрах беременности, в частности от природных иммуноглобулинов класса М [12, 13]. имеются сведения о рецепторном механизме проницаемости биологического барьера плаценты иммуноглобулинами класса G [14]. Полученные нами данные предполагают участие аналогичных механизмов в обеспечении защитного ресурса плаценты в отношении токсинов сывороток животных.

About the authors

V. G Kozlov

Email: vgkozlov@mail.ru

Yu. Yu Ivin

Chumakov Institute of Poliomyelitis and Viral Encephalitides

27 km of Kievskoye shosse, village of the Institute of Poliomyelitis, settlement Moskovsky, Moscow, Russian Federation, 142782

V. P Grachev

Chumakov Institute of Poliomyelitis and Viral Encephalitides

27 km of Kievskoye shosse, village of the Institute of Poliomyelitis, settlement Moskovsky, Moscow, Russian Federation, 142782

References

Supplementary files