Analysis of the fragmented and full genome sequencing of atypical Vibrio Cholerae strains of the classical biovar, which brought about to the outbreak of the Asian cholera in Russia

Full Text

Холера как особо опасная инфекционная болезнь известна с незапамятных времен, когда эпидемии и пандемии, вызванные Vibrio cholerae d-серогруппы классического биовара, ежегодно уносили тысячи жизней. Всего насчитывается 6 пандемий холеры, вызванных V. cholerae d-серогруппы классического биовара. Заболевание характеризовалось тяжелым течением, широким распространением, выраженной дегидратацией, большим количеством алгидных форм и летальных случаев (более 40%) [1]. В середине прошлого столетия холерные вибрионы классического биовара были практически полностью вытеснены V. cholerae биовара Эль-Тор, вызвавших седьмую пандемию холеры, продолжающуюся до настоящего времени. Тем не менее штаммы V. cholerae классического биовара до сих пор выделяются из объектов внешней среды на эндемичных по холере территориях, вызывая отдельные локальные вспышки холеры, в том числе совместно с холерными вибрионами био- вара Эль-Тор. Так, вспышки и единичные случаи холеры, вызванной штаммами классического биовара, наблюдались в южных регионах Бангладеш в 1982, 1988-1989 гг., в Мексике в 1991-1997 гг., в Иране и Непале в 2012 г. [2-6]. Имеются также сообщения о выявлении в речной и морской воде (1996-1999 и 2006-2009), а также от больных и носителей (19862004) как классических, так и гибридных штаммов V. cholerae, несущих фено- и генотипические признаки и классического, и Эль-Тор биоваров [7-12]. Все это говорит о том, что классические вибрионы продолжают циркулировать во внешней среде, вызывая угрозу возникновения вспышек холеры и новых штаммов с необычными свойствами. На территории России последняя вспышка азиатской холеры наблюдалась в 1942-1943 гг. в нескольких городах Поволжья, Прикаспия и Приуралья. В отличие от предыдущих эпидемий данная вспышка характеризовалась атипичностью инфекционного и эпидемического процессов. Так, несмотря на условия военного времени, для вспышки 1942-1943 гг. были характерны сравнительно низкие показатели заболеваемости (среднегодовой показатель заболеваемости на 100 тыс. населения составил 23,1, что на порядок ниже, чем при эпидемиях 1892-1894 и 1918-1923 гг.), значительный уровень длительного вибрионосительства и легких клинических форм (34-52%) на фоне высокой летальности (42,2%), особенно среди заключенных (57,2%) [13]. Интересен и тот факт, что основным путем передачи инфекции служил контактно-бытовой, а не водный путь, характерный для Поволжского региона. Проведенное ранее исследование фенотипических свойств штаммов, вызвавших подобное своеобразие вспышки, выявило наличие у них следующих особенностей: суперпродукции основных факторов вирулентности холерного вибриона - холерного токсина (СТ - от cholera toxin) и токсинкорегулируе- мых пилей адгезии (ТСР - от toxin coregulatedpilus), высокой вирулентности, практически полного отсутствия продукции растворимой гемагглютинин/ протеазы (MAP - от haemagglutinin/protease) и аук- сотрофности (в основном по аденину) [13]. Ответственность за синтез СТ несут гены ctxAB, расположенные на мобильном генетическом элементе (МГЭ) - профаге СТХф. Синтез ТСР осуществляет оперон tcpA-F, также расположенный на МГЭ - острове патогенности VPI-I. Экспрессия указанных генов вирулентности находится под контролем регуляторного каскада (tcpPH, toxRS и toxT), генов регуляторной системы «quorum sensing» (luxO-P, rpoN, rpoS, hapR), а также генов арhAB, crp, vieABC, h-ns и др. [8, 14-18]. За продукцию НАР отвечает ген hapA, контролируемый регуляторной системой «quorum sensing» [19, 20]. Ауксотрофность штамма может быть вызвана мутациями в одном из генов, ответственных за обмен соответствующей аминокислоты или азотистого основания. В частности, причиной ауксотрофности по аденину может быть мутация в одном из генов pur (purA, purB, purE, purK и др.) [21]. Проведенный нами ранее ПЦР-анализ основных структурных и регуляторных генов, ответственных за вирулентность и жизнеобеспечение у штаммов, выделенных в 1942-1943 гг., не выявил каких-либо особенностей [13], в связи с чем было решено провести более глубокое изучения генома данной группы штаммов с помощью секвенирования. Цель данной работы состояла в изучении генетических изменений в геноме атипичных классических штаммов холерного вибриона, вызвавших вспышку азиатской холеры в России в 1942 - 1943 гг., на основе анализа их фрагментарного и полногеномного сиквенса. Материалы и методы В работе было использовано 12 клинических штаммов V. cholerae классического биовара, выделенных от больных в 1942-1943 гг. на территории Саратовской (5 штаммов), Волгоградской (1 штамм), Астраханской областей (3 штамма) и в Уфе (3 штамма), а также 1 штамм, изолированный из воды в Астрахани. Указанные штаммы были получены из Государственной коллекции патогенных бактерий РосНИПЧИ «Микроб», где они хранились в лиофилизированном состоянии. Культивирование бактерий производили на бульоне и агаре Luria-Ber- tani (LB). Бактериальную ДНК выделяли с помощью коммерческого набора ДНК-сорб (AmpliSens, Россия) по прилагающейся к нему инструкции. Амплификацию фрагментов генома проводили на программируемом термоциклере с горячей крышкой «БИС М112» с помощью олигонуклеотидных праймеров, представленных в таблице. Фрагментарное секвенирование ДНК исследуемых штаммов проводили на генетическом анализаторе модели ABI 3500xl. Полученную нуклеотидную последовательность генов анализировали с помощью программы BioEdit 7.1.3 и сравнивали с таковой у референс-штаммов, представленных в базе данных GenBank. Полногеномное секвенирование ДНК штамма V cholerae М-29 осуществляли на приборе для высокопроизводительного секвенирования «РGМ» Ion Torrent. Первичный анализ последовательностей ДНК осуществляли с использованием программы Data Collection v 1.0 и Sequencing Analysis Software v. 5.4. Анализ и сравнение полученной полногеномной последовательности с нуклеотидной последовательностью референс-штамма Vibrio cholerae O395 классического биовара, полученной из GenBank, осуществляли с помощью программного обеспечения DNASTAR lasergene Version 11.2.1.25 и BioEdit 7.1.3. Результаты и обсуждение На первом этапе исследования мы провели полногеномное секвенирование одного атипичного штамма V. cholerae M-29, выделенного в августе 1942 г. на территории Астрахани из испражнений больного (NCBI GenBank: JFGR00000000). Выбранный штамм отличался высокой продукцией СТ и ТСР, был ауксотрофом по аденину и не продуцировал НАР. vieS-2 Примечание: * Последовательности праймеров, использованных в работе Название праймера Последовательность праймера (5^3') Длина амплифи- цируемого фрагмента, п.н. Авторы ctxA-1 CGGGCAGATTCTAGACCTCCTG 740 Fields P. I. et al., ctxA-2 CCTGGTACTTCTACTTGAAACG 1992. ctxB-1 ATGATTAAATTAAAATTTGG 354 Смирнова Н.И., ctxB-2 TTAATTTGCCATACTAATTG 2013 prctxAB-1 ATGGGCGACAGGTCATCACATTTAC 557 « prctxAB-2 GAACTCAGACGGGATTTGTTAGGCA tcpA-fl1 CTTTGTGTGGTTAAATGTGCG 880 « tcpA-fl2 AATAATCCGACACCTTGTTGG zot1-1 TACCATCTATCCGCTTATCC 653 Рассчитаны zot1-2 TCGTGGGTGGTCAGGGTAA авторами zot2-1s AACCACGCCTAACATTGCC 718 « zot2-2s ACCCCGTTTCACTTCTACCC ог^1-Н TCCGCATTTGCTAACCAAG 688 « orfU1-2s GACCTGATTGAACGCAGAC orfU2-1s CCGATGTGCGACTTGTCCG 629 « orfU2-2s CAGCGAGCAGGGTTACTACA orfU-ace-1s AACCCAATCCCACACCACC 649 « orfU-ace-2s AGCCTGAAGCAAGATAGCC cep-1 ATGACCAGAAAACTCGAAC 510 « cep-2 CACGGTAACAATCAGAACA prtcpAF-1 TTTCTCGCCTTCCCTTACA 673 « prtcpAF-2 CATACCCTCTTGACCGGTTT prtoxR-1 GGCTTTCGTTGCTGCCTA 636 « prtoxR-2 GTCATACCGATCCCGTTATCC prtoxT-1 AAGGAGATGGAAGTGGTGTG 708 « prtoxT-2 CTTTCGAGAAGAACCCTGAA hapR-1 CAAGGATATACCCCTATGGAC 907 « hapR-2 TGAAAAAAGCTGCTGCCTTAG hapA-1 GTGTTTTTCATTGACTT 682 « hapA-2 ATCCCATTGGTCTAGC hapA2-1 TGGAAAACGAAAGTGTGCAA 620 « hapA2-2 GCTGACCTCATGGGCACTAAC hapA3-1 TACTCACCGCTTAACGAC 724 « hapA3-2 CTCAAGCACTTTGCCGACA hapA4-1 ACGTGATGGCCGCTCGATA 898 « hapA4-2 AACTGGCTTCTCGCACC vieA-1* CAGTTGAGCCAGTTGACCTA 573 « vieA-2 GCCTACCTAAGCCCTACGAA vieS-1* TTATTCGCTCTGATACTGATG 1984 « TTACGCAGCTCCGAACAAG праймеры, использованные для ПЦР-анализа. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей всех генов (кроме гена hapR) штамма М-29 проводился с геномом референс-штамма V. cholerae O395 классического биовара (NCBI GenBank: CP000627.1). Что касается гена hapR, то в связи с тем, что у референс-штамма О395 отмечается делеция аденина в позиции 200, приводящая к сдвигу рамки считывания [22], сравнительный анализ нуклеотидной последовательности гена hapR атипичных штаммов проводился с интактной нуклеотидной последовательностью данного гена у штамма V. cholerae C6706 (NCBI GenBank: EU523710.1). Сопоставление геномов штамма М-29 и О395 методом Blast N выявило наличие у штамма М-29 624 одиночных нуклеотидных полиморфизмов. В первую очередь нас интересовали причины повышенной продукции штаммами СТ и ТСР. Увеличение продукции указанных факторов вирулентности могло быть вызвано мутациями в структурных генах, ответственных за синтез СТ (ctxAB) и ТСР (tcpA-F), а также изменениями в промоторных областях оперонов ctxAB и tcpA-F. Для проверки этого предположения мы провели анализ нуклеотидной последовательности профага CTX9 штамма М-29, который показал 100% идентичность с профагом референс-штамма О395. Нам не удалось обнаружить никаких отличий ни в генах ctxAB, ни в других генах коровой области профага СТХф и RS2- последовательности. Фага RS1 выявлено не было, что характерно для классических вибрионов. Фрагментарное секвенирование структурных генов профага СТХф (ctxAB, асе, zot, сер, orfU и psh) у остальных 12 атипичных штаммов также не выявило никаких изменений. Анализ промоторной области оперона ctxAB штамма М-29 показал наличие 4 гептаповторов (TTTTGAT), которые являются сайтами связывания для регуляторных белков ToxR и ToxT [16, 23]. Подобное количество гептаповторов в промоторной области ctxAB характерно для Эль-Тор вибрионов и нехарактерно для классических вибрионов, несущих обычно 6-8 гептаповторов. Увеличенное вдвое количество гептаповторов в геноме классических вибрионов, по мнению некоторых авторов [16, 23], может быть одной из причин повышенной продукции ими СТ. Фрагментарное секвенирование про- моторной области ctxAB у 11 из 12 исследованных нами атипичных штаммов также выявило наличие лишь 4 гептаповторов. Только один штамм М-9, выделенный из речной воды в Астраханской области, содержал 7 гептаповторов, как и референс-штамм O395. Таким образом, увеличение продукции СТ у атипичных классических штаммов не было связано с изменениями в генах ctxAB или в промоторной области данного оперона. Сравнительный анализ оперона tcpA-F показал наличие у штамма М-29 трех однонуклеотидных несинонимичных замен в генах tcpC (А/G в позиции 610 п.н. от начала гена и соответственно Lys/ Glu), tcpF (А/G в позиции 707 п.н. от начала гена и соответственно Asn/Ser), tcpS (Т/С в позиции 428 п.н. от начала гена и соответственно Phe/ Ser). Продукт гена tcpF, белок TcpF, участвует в колонизации и стабилизации биопленки [24]. Белки ТсрС и TcpS, кодируемые соответственно генами tcpC и tcpS, формируют поры, необходимые для транспорта белков TcpF и TcpA на внешнюю мембрану [24, 25]. Можно предположить, что наличие указанных мутаций способствовало более эффективному выходу белков TcpF и TcpA на поверхность клеточной мембраны холерного вибриона. Однако для подтверждения этого предположения необходимо проведение дополнительных исследований. В промоторной области оперона tcpA-F ни у одного из атипичных штаммов изменений выявлено не было. Следующим этапом нашей работы явилось изучение нуклеотидных последовательностей регуляторных генов, контролирующих продукцию СТ и ТСР, а также промоторных областей некоторых регуляторных генов. Из 20 исследованных нами регуляторных генов (vieAS, aphAB, tcpPH, toxR, toxT, toxS, hapR, h-ns, rpoN, rpoS, ihfAB, relA, luxO, luxU, luxP и crp) только 6 генов (vieA, vieS, toxR, hapR, rpoS, crp) отличались по своему нуклеотидному составу от референс-штамма О395. Три из шести указанных генов (vieA, vieS, toxR) оказывают позитивное влияние на гены ctxAB и tcpA, в то время как гены hapR, rpoS и crp являются негативными регуляторами указанных генов. Ни в одной из 4 промоторных областей (PtoxT PtoxR, PaphAB и PtcpPH) изменений обнаружено не было. Первое, на что мы обратили внимание, было наличие протяженной делеции, захватывающей сразу 2 гена vieA (1560 п.н.) и vieS (557 п.н.), составляющих трехкомпонентную систему vieSAB. По данным A. Tischler и соавт., [18] данная система снижает концентрацию в клетке c-di-GMP, ингибирующего связывание белка ТохТ с промоторами ctxAB и tcpA-F оперонов. Наличие указанной мутации в генах vieA и vieS было подтверждено с помощью ПЦР-анализа еще у 9 атипичных штаммов. Однако протяженная делеция в регуляторных генах vieA и vieS, позитивно регулирующих гены ctxAB и tcpA, с большей вероятностью привела бы к снижению продукции CT и ТСР, чем к их повышению. Однонуклеотидная несинонимичная замена (А/G в позиции 668 п.н. от начала гена, приводящая к замене His/Arg) обнаруженная нами в глобальном гене-регуляторе toxR, не затрагивала ДНК-связывающий домен белка ToxR и вследствие этого вероятно не оказала существенного влияния на экспрессию генов СТ и ТСР. Таким образом, мутации в генах, ответственных за позитивную регуляцию генов вирулентности холерного вибриона, видимо не могли привести к повышению экспрессии СТ и ТСР. В связи с этим большой интерес вызвало у нас обнаружение 5 SNP в трех негативных регуляторах генов вирулентности: hapR, rpoS и с/p. Два из этих генов - hapR и rpoS - входят в единую регуляторную систему и тормозят экспрессию гена aphA, а через него гены вирулентного каскада (tcpPH и toxT) и соответственно гены ctxAB и tcpA [8, 17-20]. Ген crp кодирует синтез белка-рецептора CRP, который в комплексе с циклическим аденозинмонофосфатом на поздней стадии инфекционного процесса блокирует связь белков AphA и AphВ с tcpPH-промотором, в результате чего синтез факторов вирулентности подавляется [8]. Особого внимания, на наш взгляд, заслуживают 2 однонуклеотидные несинонимичные замены: С/Т в позиции 337 от начала гена rpoS, ведущая к образованию стоп-кодона «Опал», или TGA (рис. 1, а и б) и G/А в позиции 53 гена hapR, приводящая к замене аргинина (Arg18) на гистидин (His18). Наличие последней мутации подтверждено фрагментарным секвенированием у 11 из 12 оставшихся штаммов (рис. 2, а и б). Рис. 1. Фрагменты нуклеотидных последовательностей гена rpoS (а) и аминокислотных последовательностей белка RpoS (б) референс-штамма О395 и штамма V. cholerae классического биовара М-29, выделенного в 1942 г в Астрахани. Идентичные нуклеотиды и аминокислоты обозначены точками. Буквами выделены триплеты, содержащие однонуклеотидные замены в позициях 337 и 989, а также аминокислота, не соответствующая таковой, белка RpoS референс-штамма V cholerae О395 в позиции 330. Звездочками обозначены позиции белка RpoS, соответствующие стоп-кодонам. Наличие в гене rpoS стоп-кодона в первой трети транслируемой мРНК приводит к образованию дефектного белка RpoS, который не способен к полноценному выполнению своей регуляторной функции по прекращению экспрессии СТ и ТСР при достижении высокой клеточной плотности. Что касается гена hapR, то по данным R. Silva и со- авт. [17], Arg18 входит в состав ДНК-связывающего домена белка HapR и принимает непосредственное участие во взаимодействии с фосфатными группами нуклеотидов промоторной области гена aphA. Замена аргинина, обладающего достаточно сильными основными свойствами, обусловливающими его способность образовывать ионные связи с фосфатными группами нуклеотидов промоторной области, на гистидин, обладающий слабыми основными свойствами, вероятно, и обусловило снижение, а возможно, и полное отсутствие репрессивных свойств белка HapR в штамме V. cholerae М-29. Косвенным подтверждением влияния указанных мутаций на продукцию rpoS и эффективность свя- Рис. 2. Фрагменты нуклеотидных последовательностей гена hapR (а) и аминокислотных последовательностей белка HapR (б) референс-штамма V. cholerae C6706 и атипичных штаммов V. cholerae М-8, М-9, М-14, М-16, М-18, М-19, М-22, М-24, М-29, М-30, М-34, М-35, М-40, выделенных в 1942-1943 гг. в Поволжье и Приуралье. Идентичные нуклеотиды и аминокислоты обозначены точками. Буквами выделены триплеты, содержащие однонуклеотидные замены в положениях 53 и 85, а также аминокислоты, не соответствующие таковым, белка HapR референс-штамма V cholerae C6706, в позициях 18 и 29. 0335 М-29 I • I * I I I I I • I t I * • | 10 20 ATGACAGTCGGTATTATCATGGGTT I I .... | .... | .... | . . . . | , 200 210 CGCTGCGCATC-TTCCCGGAAT CAT I I ... i ) i . 470 480 AACCCAAATCCGGCTGAGGAGTAA ..................................... I ' ' ' I " 10 20 70 80 0395 MTVGIIMGSKSDWPTMKHAAEMLDQF GAAHLPGMTAAFTSLPVLGVPV M_29 HSRNDRRIH*.ASVKHAK I • I .... I .... I .... I .... {. . 140 150 160 SKVEAFRAKQTCSVLDNPNPAEE* E*SGS.PR*ADSICVG*.KSG*GV Рис. 3. Фрагменты нуклеотидных последовательностей гена purE (а) и аминокислотных последовательностей белка PurE (б) референс-штамма О395 и штамма V. cholerae классического биовара М-29, выделенного в 1942 г. в Астрахани. Идентичные нуклеотиды и аминокислоты обозначены точками. Буквами выделен триплет, содержащий однонуклеотидную вставку в позиции 206 и аминокислоты, не соответствующие таковым, белка PurE референс-штамма V cholerae О395. Звездочками обозначены позиции белка PurE, соответствующие стоп-кодонам. зывания белка HapR с промоторными областями генов aphA и hapA является и тот факт, что у всех атипичных штаммов практически полностью отсутствовала продукция НАР. Ответственность за синтез НАР несет ген hapA, позитивно регулируемый каскадом, в состав которого входят гены rpoS и hapR [19, 20, 22]. Анализ нуклеотидной последовательности самого гена hapA у всех исследованных штаммов не выявил отличий от референс-штамма О395. В то же время фрагментарное секвенирование гена hapR подтвердило наличие обеих замен ещё у 11 из 12 штаммов. Только у штамма М-9, выделенного из воды в Астрахани, обладающего продукцией НАР и отличающегося более низкой продукцией СТ и ТСР. чем другие штаммы, выделенные в 1942 г., отличий от штамма О395 выявлено не было. По данным различных американских авторов, повреждение хотя бы одного из регуляторных генов rpoS и/или hapR ведет к снижению, а то и полному отсутствию продукции у штамма HAP и повышению продукции СТ и ТСР [19, 20]. В связи с этим мы считаем, что наличие значимых мутаций сразу в двух регуляторных генах rpoS и hapR, оказывающих негативное влияние на регуляторный каскад на поздней стадии инфекционного процесса, может способствовать повышенной продукции СТ и TCP. На последнем этапе нашей работы мы изучили причины ауксотрофности штамма V. cholerae М-29 по аденину. Анализ полногеномной нуклеотидной последовательности показал, что в геноме штамма М-29 в гене purE, ответственном за синтез фосфо- рибозиламиноимидазолкарбоксилазы (EC 4.1.1.21), принимающей участие в метаболизме аденина [21], имелась вставка аденина в позиции 206 от начала гена, приводящая к сдвигу рамки считывания и образованию стоп-кодона (рис. 3, а и б), что вероятно и послужило причиной ауксотрофности по аденину штамма М-29. Заключение В результате проведенных исследований было показано, что атипичность клинических и эпидемических проявлений холеры в России в 1942-1943 гг. была связана с генетическими изменениями вызвавших её штаммов, обусловив наличие у них таких фенотипических особенностей, как ауксотрофность по аденину, гиперпродукция СТ и ТСР, отсутствие продукции НАР. Ауксотрофность по аденину данной группы штаммов была связана с мутацией в гене purE, приводящей к отсутствию фермента фосфорибо- зиламиноимидазолкарбоксилазы, участвующего в метаболизме аденина. Вследствие этого указанные штаммы, попадая в организм ослабленных голодом и тяжелой работой заключенных, долгое время не вызывали типичной клинической картины холеры из-за медленного нарастания клеточной популяции, которая для своего роста требовала наличия аденина. Это же свойство штаммов препятствовало и распространению вибрионов водным путем. Тем не менее штаммы, попавшие в организм человека из-за отсутствия тормозного воздействия белков RpoS и НарR, синтезировали значительное количество ТСР и СТ. Однако активация СТ происходила достаточно медленно из-за практически полного отсутствия НАР, активирующей СТ, путем расщепления его молекулы на 2 субъединицы: А1 и А2 [13, 19]. Это способствовало развитию легких и стертых клинических форм. Причиной снижения продукции НАР также являлось отсутствие регуляторных белков RpoS и НарR, инициирующих экспрессию гена hapA. Недостаток НАР, разрушающей на поздней стадии эпидемического процесса рецепторы кишечного эпителия, способствуя выходу холерного вибриона во внешнюю среду [13, 19], обусловил длительное сохранение вибрионов внутри кишечника, что препятствовало широкому распространению инфекции. В то же время в кишечнике зараженных людей происходило накопление большого количества холерного и других токсинов, обусловливая высокую летальность среди заключенных. В результате описанных событий штаммы холерного вибриона, вызвавшие вспышку азиатской холеры в 1942-1943 гг., несмотря на их высокую вирулентность и гиперпродукцию СТ и ТСР, большую скученность и миграцию населения, вызванных войной, не смогли вызвать широкого эпидемического распространения. Это еще раз подчеркивает тот факт, что при развитии эпидемического процесса следует учитывать влияние большого количества факторов, таких как гено- и фенотипические особенности микроорганизма, организма хозяина-человека, социально-бытовых условий, своевременность проведения противоэпидемических мероприятий и т. д. Отсутствие одного из указанных факторов или их особое сочетание (например, ослабленный голодом организм хозяина и ауксотрофность микроорганизма на фоне мутаций в регуляторных генах) могут оказать значительное влияние на развитие эпидемического процесса.

About the authors

N. B Cheldyshova

Russian Research Anti-Plague Institute “Microbe"

Email: chelna-25@yandex.ru
46, Universitetskaya Str., Saratov, Russian Federation, 410005

A. A Kritskiy

Russian Research Anti-Plague Institute “Microbe"

46, Universitetskaya Str., Saratov, Russian Federation, 410005

Ya. M Krasnov

Russian Research Anti-Plague Institute “Microbe"

46, Universitetskaya Str., Saratov, Russian Federation, 410005

N. I Smirnova

Russian Research Anti-Plague Institute “Microbe"

46, Universitetskaya Str., Saratov, Russian Federation, 410005

References

Supplementary files