Monoclonal antibodies to thermostable surface antigens of Vibrio cholerae O1 and O139 serogroups

Full Text

Достоверная иммунодиагностика возбудителей особо опасных инфекций может быть осуществлена только с применением высокоспецифичных антител. На сегодняшний день признано, что эффективной основой для производства высокоактивных иммуно- диагностических препаратов являются моноклональные антитела (МКА). Гибридомная биотехнология позволяет получать высокоаффинные антитела уникальной специфичности к отдельным антигенным детерминантам (в отличие от поликлональных сывороток) диагностически значимых антигенов возбудителя холеры. Зарубежными учеными в конце прошлого столетия проводились работы по получению МКА к поверхностным антигенам Vibrio cholerae О1 и О139 (ЛПС, белки внешних мембран, пили адгезии), а также холерному токсину, с последующим конструированием на их основе высокоэффективных тест-систем: для слайд-агглютинации [1], набор CholeraeScreen для реакции коагглютинации [2], дот-блот-ИФА (им- муноферментный анализ) [3], флуоресцирующие им- муноглобулины [4]. В последние годы исследователи сосредоточили внимание на создании тест-систем в формате иммуносенсоров (биомикрочипов), имму- нохроматографических полосок (ИХ-стрипов, “дип- стиков”) и дот-ИФА-тестов, поскольку время их постановки находится в пределах от 5-15 мин до 1,2 ч, что особенно актуально при исследовании большого количества проб в эндемичных по холере районах. Так, Chen W. и соавт. [5] разработали для ускоренной диагностики холерных вибрионов серовара Огава им- мунохроматографический тест, основанный на паре МКА, одно из которых специфически взаимодействует с эпитопами ЛПС штаммов Огава, т. е. тест-система позволяет дифференцировать серовары V. cholerae О1. J. Jyoung и соавт. сконструировали иммуносенсор на основе поверхностного плазмонного резонанса, используя МКА к V. cholerae О1 с чувствительностью 1 • 105-1 • 109 м.кл/мл [6]. Группа тайландских исследователей создала панель МКА для обнаружения и дифференциации V. cholerae О1, О139 и О141 методом дот-блоттинга [7]. Этими же авторами разработан для прямой детекции V. cholerae О139 в образцах морепродуктов высокочувствительный (104 КОЕ мл-1) иммунохроматографический стрип-тест на основе двух МКА [8]. При совместной работе таиландских и японских ученых сконструирован 5-минутный имму- нохроматографический тест на основе МКА к липопо- лисахариду V. cholerae О139 с чувствительностью 106 КОЕ/мл, который исключает перекрестные реакции с холерными вибрионами О1, не О1/не О139 [9]. В нашей стране также проводятся работы по получению МКА к холерным вибрионам и экспериментальные разработки иммунологических тест-систем: коагглютинационный и иммунофлуоресцентный диагностикум для выявления V cholerae О1 [10], дот-иммуноанализ для экспресс-диагностики токси- генных штаммов V cholerae [11], иммунофермент- ная тест-система для детекции возбудителя холеры О139 [12], ТИФА и дот-ИФА для контроля биосинтеза О-антигена V cholerae О1 при производстве бивалентной химической вакцины [13], иммунофермент- ный анализ двойных антител (ИФА-2АТ) для оценки токсинопродукции штаммов холерных вибрионов О1 и О139 [14]. Зарегистрированными на сегодняшний день являются два набора диагностических препаратов на основе МКА (свидетельство о государственной регистрации № РЗН 2014/2142 от 16.12.14, № РЗН 2015/2336 от 26.01.15) для ускоренной диагностики V cholerae О1 и О139 в реакциях иммунофлуоресценции и слайд-агглютинации. На современном этапе, учитывая актуальные направления в диагностике особо опасных инфекций, во ФГУН ГНЦ ПМБ (г. Оболенск) для обнаружения холерных вибрионов О1 разработаны иммунохроматографические тест-системы на основе МКА, полученных в Ростовском противочумном институте [15]. Также Е.В. Баранова и соавт. [16] сконструировали, используя МКА к холерному токсину, диагностикум «Тест-полоска V cholerae tox+». Следует отметить, что ИХ-тесты наряду с их преимуществами (получение результата в пределах 15 мин, простота постановки) не лишены недостатков: сравнительно низкая чувствительность порядка 108-109 м.кл/мл зависит от качества используемых антител и концентрации антигена в биоматериале. В связи с этим актуальным является разработка препаратов на основе высокоспецифичных МКА, направленных к диагностически значимым антигенам холерных вибрионов, для постановки ИФА и дот-иммуноанализа, которые позволяют выявлять и дифференцировать V cholerae О1 и О139 при концентрации их в пробе 105-106 м.кл/мл. Нами разработаны и сконструированы экспериментальные серии пероксидазных конъюгатов на основе видоспецифических МКА, направленных к эпитопам О-полисахарида холерных вибрионов О1-серогруппы (ПХ-МКА О1) и соответственно серогруппы О139 (ПХ-МКА О139). Моноклональные конъюгаты в ТИФА и дот-ИФА имеют чувствительность порядка 105-106 м.кл/мл, и строгую специфичность в отношении штаммов V cholerae O1, O139 при отсутствии перекрестных реакций с представителями близкородственных и гетерологич- ных микроорганизмов [17]. Однако практический интерес представляют не только видоспецифические, но и серовароспецифические пероксидазные конъюгаты для дифференциации холерных вибрионов О1 Огава и Инаба в прямых вариантах дот-ИФА и ТИФА. Ви- до- и серовароспецифические детерминанты входят в состав термостабильного О-антигена, локализованного на поверхности холерных вибрионов О1. Поэтому цель данной работы - получение набора МКА к поверхностным антигенным детерминантам холерных вибрионов и оценка возможности их применения в научных исследованиях и для разработки диагностических препаратов. Материалы и методы Штаммы микроорганизмов. В работе были использованы 24 штамма V. cholerae О1: 8 - V cholerae El Tor ctx+ tcp+, 8 - V cholerae El Tor ctx- tcp+, 8 - V cholerae El Tor ctx- tcp-; 11 штаммов V. cholerae О139: 5 - V cholerae О139 ctx+ tcp+, 6 - V. cholerae О139 ctx- tcp; 10 штаммов V cholerae не О1/не О139; 3 - E. coli, 2 - Salmonella spp., 4 - Aeromonas. Взвеси холерных вибрионов и гетеро- логичных микроорганизмов готовили в 0,9% растворе хлорида натрия (рН 7,2±0,1) по стандартным образцам мутности ГИСК им. Л.А. Тарасевича 10 ед. (ОСО 42-28- 85П), соответствующего года выпуска, эквивалентных концентрации 1 • 109 м.кл/мл; клетки обеззараживали кипячением в течение 30 мин. Лабораторные животные. Для получения перитонеальных макрофагов, иммунных спленоцитов использовали инбредных самок мышей линии Balb/c и беспородных белых мышей массой 16-20 г в возрасте 8-10 нед. Все эксперименты с животными были проведены в соответствии с Директивой Европейского союза 2010/63/EU. Умерщвление животных проводили с помощью ингаляционного наркоза хлороформом. Иммуноген. Для иммунизации мышей Balb/c, служащих донорами иммунных спленоцитов, использовали цельные клетки токсигенного штамма V cholerae El Tor 13020 (Инаба), обеззараженные кипячением в течение 30 мин. Иммунизацию проводили троекратно с интервалом в 14 дней. Бустерную инъекцию вводили за 3 дня до слияния. Получение гибридом. Получение гибридных клеток в соответствии с методикой Fazekas de St. и соавт. [18] проводили с помощью сливающего агента полиэтилен- гликоля 1500 (Fluka, Sigma-aldrich, США). Использовали мышиную миеломную линию P3-X63/Ag8.653, полученную из Российской коллекции клеточных культур позвоночных (Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург). Тестирование антителопродуцирующих гибридом проводили в непрямом ТИФА [19] с использованием цельных микробных клеток штамма V cholerae 13020, убитых кипячением. Мышиные иммуноглобулины выявляли пероксидазным конъюгатом BioRad (США). Результаты ТИФА учитывали с использованием спектрофотометра BioTek (США) по оптической плотности (ОП) при длине волны 450 нм (референс-волна 630 нм), считая позитивными лунки с образцами, интенсивность сигнала которых в 2 раза превышала ОП контрольных образцов. Из лунок, в которых регистрировали достоверно положительную реакцию, отбирали гибридомные клетки и клонировали их трижды методом предельных разведений [20] в HT-среде (среда DMEM Gibco с 20% эмбриональной телячьей сыворотки HyClone). Для криоконсервирования гибридом применяли среду, содержащую 90% эмбриональной телячьей сыворотки HyClone (Thermo scientific, Англия) и 10% диметилсульфоксида (Panreac). Очистка специфических иммуноглобулинов. Выделение иммуноглобулиновой фракции из культуральных жидкостей гибридом осуществляли преципитацией сульфатом аммония [21]. Очищенные препараты иммуноглобулинов консервировали добавлением мертиолата натрия до конечной концентрации 0,01%. После проверки титра антител препараты разливали по аликвотам и хранили при температуре -20oC. Электрофорез и иммуноблоттинг. Электрофорез бактериальных взвесей проводили по U. Laemmli [22] в пластинах 12,5% полиакриламидного геля размером 70 х 100 х 0,7 мм в денатурирующих условиях при постоянном напряжении (концентрирование 50 В, разделение 120 В) на приборе Helicon. Использовали белковые маркеры молекулярной массы от 10 до 250 кДа (BioRad). Полусухой перенос фракций бактериальных лизатов из геля на нитроцеллюлозную мембрану (НЦМ) (BioRad, США) проводили при постоянной силе тока 200 мА (в течение 30 мин) на приборе Helicon. Для окраски белков на мембране использовали краситель Ponceau S (Reanal, Будапешт). Постановку имму- ноблоттинга осуществляли, как описано H. Towbin и соавт. [23]. Результаты и обсуждение Рис. 1. Результаты определения специфичности МКА гибридомы H2F6 в дот-ИФА: I- 5 - штаммы Vibrio cholerae El Tor ctx+tcp+ - 13020, 18826, 18895, 15261, 17834; 6-10 - штаммы Vibrio cholerae El Tor ctx-tcp+ - 18780, 18775, 18781, 18786, 18778; II- 17 - штаммы Vibrio cholerae El Tor ctxtcp' - 19435, 18898, 18512, 18776, 18729; 18-22 - Vibrio cholerae O139 ctx+tcp+ - 16488, 16485, 16131, 16485, 16063; 23-26 - Vibrio cholerae O139 ctx'tcp' - 17682, 17780, 17780, 17785, 17788; 27 - Vibrio cholerae O22; 28 - Salmonella spp.; 29 - E. coli. Для иммунизации мышей в качестве иммуногена использовали микробные клетки, инактивированные кипячением, принимая во внимание, что специфический О-антиген устойчив к термообработке. После бустер- ного введения бактериальной взвеси V cholerae El Tor 13020 титры специфических антител в гипериммунных сыворотках мышей в ИФА составили 1:80 000-1:160 000. После проведения гибридизации (парное слияние) было засеяно 760 лунок, в 190 из них обнаружены гибридные клеточных культуры, устойчивые в селективной среде НАТ. При первичном тестировании в ТИФА культуральных жидкостей (КЖ) гибридом положительными оказались 180 клонов. Повторные скрининги КЖ показали, что большинство гибридных клеток утратили способность продуцировать МКА. В результате клонирования положительных гибридом отобрали 9, которые показали при длительном культивировании стабильную анти- телопродукцию и хорошие ростовые свойства. Данные клоны были масштабированы путем последовательного пересева в культуральные флаконы возрастающего объема и заложены на хранение в жидкий азот в сосуды Дьюара. В задачи исследования входило получение диагностически значимых гибридом, поэтому в ТИФА первоначально оценили специфическую активность МКА и частоту представленности соответствующих им антигенных детерминант на поверхности холерных вибрионов О1-, О139-серогрупп. Испытуемые штаммы холерных вибрионов Эль- Тор и О139 из коллекции музея живых культур института, выделенные от человека и из объектов окружающей среды, отличались по наличию генов ctx, tcp. Как видно из результатов ТИФА (см. таблицу), определяющим для условного разделения МКА на группы явилось наличие в клетках гена tcp. По этому критерию в 1-ю группу входят МКА гибридом ffiF6, F11H2, G3F5, E5F5, A5B6, вступающие в реакцию со штаммами V. cholerae El Tor, V. cholerae О139, имеющих генотип ctx+tcp+ и ctx-tcp+. Эти же МКА не взаимодействуют с клетками исследуемых штаммов, лишенных генов ctx, tcp. Другая группа включает МКА гибридом А5D8, В3A5, D6, 4F5, выявляющих общие эпитопы штаммов V. cholerae El Tor, О139, с которыми зарегистрирована положительная реакция, независимо от присутствия в клетках генов ctx, tcp. Отсутствие перекрестной реактивности с представителями близкородственных и гетерологичных микроорганизмов - свидетельство специфичности МКА в отношении холерных вибрионов О1-, О139-серогрупп. Взаимодействие в ИФА моноклональных антител с холерными вибрионами El Tor и О139 V cholerae El Tor ctx+ tcp+ 8/8* 8/8 8/7 8/7 8/8 8/8 8/8 8/7 8/8 V cholerae El Tor ctx- tcp+ 8/8 8/8 8/7 8/7 8/8 8/8 8/8 8/7 8/8 V cholerae El Tor ctx- tcp- 8/0 8/8 8/0 8/0 8/8 8/0 8/8 8/0 8/8 V cholerae О139 ctx+ tcp+ 5/5 5/5 5/4 5/4 5/5 5/5 5/5 5/4 5/5 V cholerae О139 ctx- tcp- 6/0 6/6 6/1 6/1 6/6 6/0 6/6 6/1 6/6 E. coli 3/0 3/0 3/0 3/0 3/0 3/0 3/0 3/0 3/0 V cholerae не OE^ O139 10/0 10/0 10/0 10/0 10/0 10/0 10/0 10/0 10/0 Aeromonas spp. 4/0 4/0 4/0 4/0 4/0 4/0 4/0 4/0 4/0 Salmonella spp. 2/0 2/0 2/0 2/0 2/0 2/0 2/0 2/0 2/0 Штамм V cholerae (обеззараженный кипячением) МКА (положительная реакция в ИФА) H2F6 A5D8 E5F5 G3F5 B3A5 A5B6 D6 F11H2 4F5 П р и м е ч а н и е. ствующих с МКА. отношение числа исследованных штаммов к числу штаммов, взаимодей * Очевидно, что в плане диагностики первоочередной интерес представляют МКА 1-й группы. Подтверждение тому - результаты дот-ИФА на примере МКА гибридо- мы ffiF6 (рис. 1), которые позволяют наглядно увидеть, что эти МКА только со штаммами V. cholerae El Tor и О139 tcp+ образуют на НЦМ интенсивно окрашенные пятна. Положительная реакция не регистрируется с холерными вибрионами, не содержащими генов ctx, tcp. Для определения химической природы антигенных детерминант, узнаваемых МКА и их эпитопной направленности мы использовали препарат ЛПС из штамма V cholerae El Tor 5879 (выделен по O. Westphal и соавт. [24]) и общую белковую фракцию внешних мембран, выделенную из клеток штамма V cholerae Classical 1395 (согласно методике Kabir S. [25]). При постановке ИФА, где на твердую фазу сенсибилизировали препарат ЛПС, у всех полученных МКА зарегистрирована отрицательная реакция. В качестве положительного 250 kD 150 1Ш~ 7i_ H2F6 H2F6 A5D8 A5D8 F8G12 F8G12 20-- 2Z_ ► j*'-.» * r 2L_ 20 Ж- • j метч. 1 1 I 2 1 2 1 j 2 : Рис. 2. Иммуноблот МКА с бактериальными лизатами: 1 - Vibrio cholerae El Tor - 13020 (ctx+tcp+), 2 - Vibrio cholerae El Tor 19435 (ctx-tcp-). контроля использовали МКА гибридомы F8G12, направленные к эпитопам О-антигена холерных вибрионов О1-серогруппы [10]. Отсутствие специфической реакции исследуемых МКА с препаратом ЛПС также подтвердилось и при проведении иммуноблоттинга, так как не были выявлены специфические окрашенные зоны на нитроцеллюлозной мембране (рис. 2). Когда антигеном в ТИФА служили белки внешней мембраны, то окрашенные лунки были зарегистрированы только в отношении МКА D6 и 4F5, т. е. двух из девяти испытуемых. Из полученных данных следует, что терморезистентные антигенные детерминанты не принадлежат ЛПС. В то же время большая часть имеющихся МКА не вступала в реакцию с белковой фракцией наружных мембран, выделенных из штамма классического холерного вибриона. Рис. 3. Иммуноблот МКА с бактериальными лизатами: 1 - Vibrio cholerae El Tor - 13020 (ctx+tcp+), 2 - Vibrio cholerae El Tor - 19435 (ctxtcp'). Для получения дополнительных сведений по вопросу природы и локализации антигенных детерминант, выявляемых комплементарными им МКА, была осуществлена постановка иммуноблота с клеточными лизатами штаммов V cholerae El Tor 13020 (ctx+ tcp+) и 19435 (ctx- tcp-), которые подвергли электрофорезу в ПААГ с Na-ДДС, затем осуществили перенос на НЦМ и проинкубировали с испытуемыми МКА (рис. 3). Как видно, МКА гибридом H2F6, G3F5, E5F5, A5B6 взаимодействовали только с tcp+-штаммами, образуя интенсивную полосу, локализованную на уровне маркерных белков 38-42 кДа; у tcp--штаммов аналогичная полоса не выявлена. Общие для tcp+- и tcp--холерных штаммов эпитопы выявляли МКА гибридом А5D8 и В3А5 в районе маркерных белков 38-42 кДа, МКА гибридомы D6 узнает «свои» антигенные детерминанты в виде тонкой полосы на уровне примерно 6065 кДа. В отличие от других МКА гибридомы 4F5 у tcp+^тамма выявляла 3 полосы, соответствующие 3842, 14 и 10 кДа, тогда как у tcp--штамма выявлялись только две нижние полосы - 10 и 14 кДа. Отечественные авторы при исследовании полипептидного профиля наружных мембран вирулентных и авирулентных штаммов V cholerae О1- и О139-серогрупп установили, что полипептиды с мол. массой 35-46 кДа имеются у всех штаммов V. cholerae О1 и О139, обусловливая характерный вид электрофореграмм [26]. Из всего состава мажорных белков наружных мембран наибольшим уровнем экспрессии отличаются белки, мигрирующие в виде комплекса полипептидов с мол. массой 37- 42 кДа. После проведения электрофореза и переноса белков из геля на НЦМ мембрана была окрашена красителем Ponceau S, в результате чего у всех трех штаммов визуализировалась интенсивная белковая полоса на уровне 38-42 кДа. В результате обработки НЦМ МКА на блотограмме обнаружены интенсивные полосы на уровне 38-42 кДа; и в связи с этим мы предположили, что полученные нами МКА специфически взаимодействуют с определенными белками наружных мембран. Из вышеприведенных данных следует (см. таблицу), что 1-я группа МКА, взаимодействующих в ТИФА с холерными вибрионами tcp+, не выявляет на блотограмме антиген 38-42 кДа у tcp--штаммов, т. е. очевидны их различия по этим белкам. Установлено также, что белки наружных мембран у холерных вибрионов О139-серогруппы отличаются более высокой гетерогенностью в сравнении с холерными вибрионами О1, что видно на электрофореграмме после переноса на мембрану и окраски ее красителем Ponceau S. При постановке иммуноблоттинга клеточного лизата V cholerae 0139 16064 (ctx+ tcp+) с МКА 1-й группы на блотограмме выявляется, помимо основной интенсивной полосы 38-42 кДа, несколько полос в диапазоне 20-37 кДа (рис. 4). Заключение Таким образом, в результате проведенных исследований получена панель гибридом-продуцентов МКА, направленых к поверхностным терморезистентным эпитопам холерных вибрионов Эль-Тор и О139. Рис. 4. Иммуноблот МКА с бактериальными лизатами: 1 - Vibrio cholerae El Tor - 13020 (ctx+tcp+), 2 - Vibrio cholerae O139 16064 (ctx+tcp+). К числу поверхностных структур относят и белки наружных мембран. Из имеющихся публикаций следует, что в результате электрофореза протеинов внешней мембраны представителей V. cholerae О1 регистрируется от 8 до 10 полос в диапозоне 94-27 кДа с мажорной полосой 40-45 кДа [27]. Другие исследователи отмечают, что у холерных вибрионов О1, О139 наибольшим уровнем экспрессии отличаются белки наружных мембран, мигрирующие в виде комплекса полипептидов с мол. массой 37-42 кДа [26]. Нами в результате иммуноблоттинга обнаружено, что МКА, включенные в 1-ю группу, узнают соответствующие им антигенные детерминанты на уровне 38- 42 кДа у штаммов V. cholerae El Tor и О139 с генотипом ctx+ tcp+ и ctx- tcp+. Аналогичные белки не обнаружены в составе поверхностных структур штаммов V cholerae El Tor и О139 ctx-tcp-. Поскольку установлено разделение холерных штаммов по признаку наличия гена tcp, то вполне вероятной представлялась возможность выявление с помощью определенных МКА белка токсинкорегулируемых пилей адгезии (ТКПА). Однако данные литературы [28] свидетельствуют, что мол. масса этого белка 20,5 кДа, тогда как различия между холерными штаммами tcp+ и tcp- наблюдаются в отношении белков 38-42 кДа. Среди белков наружных мембран наибольший интерес представляют OmpT и OmpU соответственно с мол. массой 40 и 38 кДа [27, 29]. Вполне возможно, что в имеющемся у нас наборе есть МКА, направленные к эпитопам белков OmpT или OmpU. Последние являются протеинами, участвующими в образовании пор во внешней мембране, способствующими поступлению питательных веществ [27]. Они также обеспечивают устойчивость к антибиотикам, гидролитическим ферментам, солям желчных кислот и другим стрессовым воздействиям. Кроме того, установлено, что OmpU является важным протективным антигеном, обладает свойствами адгезинов, которые играют существенную важную роль в патогенезе холеры [30]. Данные в публикациях Б.Н. Мишанькина и соавт. (2013) свидетельствуют, что белок OmpT наделен протеолитической активностью, расщепляет протамин, фибрин, желатин, казеин, коллаген и активирует плазминоген человека в плазмин, что обеспечивает известные преимущества вибрионам во время пребывания в кишечнике чувствительного хозяина [31]. Дальнейшие исследования с помощью МКА позволят более точно определиться и выяснить, о каких поверхностных белках идет речь. В нашей работе клетки V. cholerae El Tor 13020, используемые в качестве иммуногена, инактивировали кипячением и при этом белки наружных мембран сохранили свою активность, что позволяет отнести их к термостабильным антигенам. Большая часть из полученных МКА направлена к поверхностным терморезистентным белковым антигенам с мол. массой 38-42 кДа. МКА специфически взаимодействуют с клетками V. cholerae El Tor и О139, поэтому могут быть использованы для эпитопного анализа поверхностных антигенов холерных вибрионов О1 и О139, а также в иммуно- ферментных методах для детекции эпидемически опасных штаммов. Кроме того, создание панели МКА к антигенам холерных вибрионов позволит оценивать с помощью имму- ноферментных методов эффективность экспрессии диагностически значимых генов и генов вирулентности по наличию или отсутствию их продуктов. Это позволит проводить в совокупности с генетическими методами многофакторный анализ природных штаммов холерного вибриона. Изучение иммунобиологических свойств МКА позволит ответить на вопрос, какую функцию в клетке выполняют комплементарные им антигены. Последние можно выделить с помощью иммуносорбентов, приготовленных на основе специфических МКА.

About the authors

V. V Evdokimova

Rostov-on-Don Institute for Plague Control of Federal Agency for Consumer Rights Protection and Human Welfare Supervision

Email: nika-evd@yandex.ru
117/40, Maksima Gorkogo Str., Rostov-on-Don, Russian Federation, 344002

L. P Alekseeva

Rostov-on-Don Institute for Plague Control of Federal Agency for Consumer Rights Protection and Human Welfare Supervision

117/40, Maksima Gorkogo Str., Rostov-on-Don, Russian Federation, 344002

O. F Kretenchuk

Rostov-on-Don Institute for Plague Control of Federal Agency for Consumer Rights Protection and Human Welfare Supervision

117/40, Maksima Gorkogo Str., Rostov-on-Don, Russian Federation, 344002

V. D Kruglikov

Rostov-on-Don Institute for Plague Control of Federal Agency for Consumer Rights Protection and Human Welfare Supervision

117/40, Maksima Gorkogo Str., Rostov-on-Don, Russian Federation, 344002

I. V Arkhangelskaya

Rostov-on-Don Institute for Plague Control of Federal Agency for Consumer Rights Protection and Human Welfare Supervision

117/40, Maksima Gorkogo Str., Rostov-on-Don, Russian Federation, 344002

O. S Bursha

Rostov-on-Don Institute for Plague Control of Federal Agency for Consumer Rights Protection and Human Welfare Supervision

117/40, Maksima Gorkogo Str., Rostov-on-Don, Russian Federation, 344002

References

Supplementary files