Distribution of the tick-borne encephalitis virus among naturally infected ixodid ticks and small mammals in the Novosibirsk region

Full Text

Клещевой энцефалит (КЭ) - опасное для человека природно-очаговое заболевание вирусной этиологии с преимущественным поражением центральной нервной системы с периодическими подъемами и спадами уровней заболеваемости. Переносчиком возбудителя - вируса клещевого энцефалита (ВКЭ) - являются иксодовые клещи, паразитирующие на позвоночных. ВКЭ относится к семейству Flaviviridae вирусов с геномной РНК-положительной полярности и длиной 10. 500-11. 000 нуклеотидных остатков. Молекулярногенетический и антигенный анализ показал существование трех основных типов ВКЭ: дальневосточного (ДВ), европейского (Евр) и сибирского (Сиб), а также 2 минорных типов [1] и новых вариантов ВКЭ, вызывающих летальные геморрагические формы инфекции [2]. Оценки уровней смертности и частот персистентных форм инфекции существенно различаются для разных типов ВКЭ. Уровни летальных исходов достигают 20-60% от общего числа инфицированных лиц для ДВ-типа, 6- 8 и 1-2% для Сиб и западноевропейского типов соответственно [3]. Наиболее высокие частоты хронизации инфекции отмечены для инфекций ВКЭ Сиб типа [3]. Цель работы - молекулярно-генетический анализ изолятов ВКЭ от иксодовых клещей и мелких млекопитающих методами ОТ-ПЦР-РВ и филогенетического анализа нуклеотидных последовательностей. Материалы и методы Иксодовые клещи и дикие мелкие млекопитающие для исследований ВКЭ. Голодных половозрелых иксодовых клещей и диких мелких млекопитающих отлавливали в 2009-2014 гг. на территории стационарного участка - антропургического очага КЭ в лесопарке Новосибирска (54o49’ с.ш., 83o05’ в.д.). Видовую принадлежность иксодовых клещей после сбора с растительности на флаг определяли по морфологическим признакам, согласно классической методике фенотипической дифференциации иксодовых клещей [4, 5]. Отловы мелких грызунов и насекомоядных проводили в те же годы на той же территории, что и клещей. Определение вида, пола и возраста мелких грызунов и насекомоядных осуществляли в соответствии с [6]. Детекция ВКЭ. Детекцию ВКЭ проводили с использованием комплекса методов: ОТ-ПЦР-РВ, им- муноферментного анализа (ИФА) на антиген ВКЭ с использованиемнабора“ВектоВКЭ-антиген-стрип” (ЗАО “Вектор-Бест”, Новосибирск) и биопробы на 1-3-суточных или 10-12-суточных лабораторных мышах ICR [7]. Идентификацию патогенных для лабораторных мышей изолятов ВКЭ осуществляли посредством реакции биологической нейтрализации на мышах ICR массой 8-10 г [8], реакции торможения гемагглютинации с гусиными эритроцитами [9], а также молекулярного типирования в ОТ-ПЦР-РВ с праймерами и генотипспецифичны- ми флуоресцентными зондами, соответствующими генам NS1 и NS5 ВКЭ [7, 10], и филогенетического анализа нуклеотидных последовательностей фрагментов генов Е и NS1 ВКЭ [11]. Нейровирулентность вируса определяли посредством внутримоз- гового и подкожного титрования 10-кратных разведений вирусофорных суспензий на мышах ICR массой 8-10 г. Имаго клещей анализировали индивидуально. После определения видовой принадлежности и пола клещей раскладывали в микропробирки и до исследований хранили не более 1 нед в холодильнике при температуре 4oC. Для исследования брали только живых клещей, промывали 70% этанолом, троекратно - физиологическим раствором, затем растирали в отдельных пластиковых микропробирках (1,5 мл) металлическими пестиками в 200 мкл физиологического раствора. Из тщательно отмытых физиологическим раствором образцов головного мозга и селезенки, а также из сгустков крови млекопитающих посредством растирания в ступках готовили 10% суспензии в физиологическом растворе. Для исключения повторного размораживания суспензии клещей, органов и сгустков крови млекопитающих разливали в микропробирки по 50 мкл; для выделения РНК в пробирку с гомогенатом добавляли 3 объема 5,5 М раствора гуанидинизотиоцианата, до исследования хранили при -70oC. Определение нуклеотидных последовательностей генов Е и NS1 для изолятов РНК ВКЭ из го- могенатов клещей и мозга биопробных мышей проводили в Центре секвенирования ДНК ФГБУН ИХБФМ СО РАН (Новосибирск) с использованием автоматического анализатора ДНК модели ABI 310 (Applied Biosystems, США) и набора BigDye 3.1. Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей проводили при помощи программного обеспечения Mega 6.06 (http://www.megasoftware. net/) с использованием пяти альтернативных алгоритмов по 1000 репликаций [11]. Вирусные нагрузки оценивали с использованием количественной ОТ-ПЦР-РВ с калибровочным графиком зависимости пороговых циклов (Ct) флуоресценции от количеств рекомбинантной плазмидной ДНК ВКЭ [10]. Статистическое сравнение выборочных долей и абсолютных количеств проводили по критерию Примечание. m1 - статистическая погрешность процента и инфекционного титра lg < 0,05, p < 0,01 соответственно. Вид клеща Патогенность изолятов ВКЭ для лабораторных мышей Вирусофорность (% = m1) Нейровирулентность изолятов ВКЭ от иксодовых клещей (lg LD50±m1) Число образцов для молекулярного типирования Частота типов ВКЭ среди клещей, положительных в ОТ-ПЦР-РВ внутримоз- говые титры подкожные титры ДВ Сиб Евр смешанная инфекция разными типами ВКЭ Ixodes Патогенный 1,8±0,3** 3,86±0,32 2,26±0,3 Патогенный 95,7±4,3 91,3±6,0 9,5±6,6 91,3±6,0 pavlovskiy 28/1514 (n = 23) 22/23 21/23 2/21 21/23 Апатогенный 1,5±0,5 - - Апатогенный 14,3±14,3 85,7±14,2 28,5±18,4 14,3±14,3 22/1514 (n = 7) 1/7 6/7 2/7 1/7 Всего 3,3±0,5 - - Всего 76,7±7,9* 90,0±5,6 14,3±6,7 73,3±8,2 50/1514 (n = 30) 23/30 27/30 4/28 22/30 Ixodes Патогенный 0,8±0,4** 3,18±0,44 1,93±0,5 Патогенный 100,0 100,0 12,5±12,5 100,0 persulcatus 9/1146 (n = 8) 8/8 8/8 1/8 8/8 Апатогенный 2,8±0,5 - - Апатогенный 23,8±9,5 76,1±9,5 14,3±7,8 14,3±7,8 32/1146 (n = 21) 5/21 16/21 3/21 3/21 Всего 3,6±0,6 - - Всего 44,8±9,4* 82,8±7,1 13,8±6,5 37,9±9,2 41/1146 (n = 29) 13/29 24/29 4/29 11/29 Патогенный 1,4±0,2 3,64±0,25 2,12±0,25 Патогенный 96,8±3,2 93,5±4,5 9,7±5,4 93,5±4,5 37/2660 (n = 31) 30/31 29/31 3/31 29/31 В с е г о ... Апатогенный 2,0±0,3 - - Апатогенный 21,4±7,9 78,6±7,9 17,9±7,4 14,2±6,7 54/2660 (n = 28) 6/28 22/28 5/28 4/28 Таблица 1 Сравнение вирусофорности, нейровирулентности вирусных изолятов и распределение генетических типов ВКЭ у иксодовых клещей на территории Новосибирской области Всего 3,4±0,4 91/2660 Всего (n = 59) 61,0±6,4** 84,7±4,7** 14,0±4,6 55,9±6,5 36/59 51/59 8/59 33/59 LD50. *, ** - уровни статистической значимости различий; p Стьюдента, принят уровень значимости различий p < 0,05. В тексте и таблицах для выборочных долей приведены ошибки репрезентативности [12]. Работу с инфекционным ВКЭ и потенциально опасным материалом выполняли в лаборатории, аттестованной для работы с патогенами второй группы опасности для человека Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (лицензия № 77.99.18.001.Л.000032.03.08 от 05.03.08). Содержание, кормление, уход за животными и выведение их из эксперимента осуществляли в соответствии с требованиями «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение к приказу МЗ СССР от 12 августа 1977 г. № 755). Результаты и обсуждение В сообществе иксодовых клещей на территории исследуемого очага отмечены два наиболее массовых вида: таежный клещ Ixodes persulcatus Schulze и клещ Павловского Ixodes pavlovskyi Pomerantsev 1946 [13, 14]. Доля клеща Павловского в очаге в сборах с растительности в среднем составила 70,8±0,7%. При этом на участках, расположенных до 3 км от населенного пункта, доля I. pavlovskyi в отловах клещей достигала более 90%. Детекция и молекулярное типирование ВКЭ у клещей Детекция ВКЭ посредством комплекса вирусологических и молекулярно-биологических методов в 2660 имаго клещей двух видов выявила в среднем 3,4±0,4% инфицированных особей. При этом лишь 1,4±0,2% содержали патогенный для лабораторных мышей ВКЭ, РНК ВКЭ и белок оболочки вирионов Е, а остальные 2,0±0,3% не вызывали признаков КЭ у мышей. Частоты детекции ВКЭ у клещей Павловского и таежного статистически не различались, но частота обнаружений патогенного вируса по данным биопробы у клеща Павловского (1,8±0,3%) значимо превосходила (p < 0,01) таковую у таежного клеща (0,8±0,3%) (табл. 1). При титровании ВКЭ непосредственно из вирусофорных суспензий клещей на лабораторных мышах значимых различий нейровирулентности у иксодид двух видов не выявлено. Усредненные за период исследований инфекционные титры вируса у I. pavlovskyi и I. persulcatus при внутримозговом заражении составляли 3,86±0,3 и 3,18±0,4 lg LD50, при подкожном заражении - 2,26±0,3 и 1,93±0,5 lg ld50 соответственно (см. табл. 1). Таблица 2 Количественные оценки ВКЭ в клещах и мелких млекопитающих Вид клещей и мелких млекопитающих ДВ Сиб Евр средний пороговый цикл (Ct±m) и диапазон (мин.-макс.) средний пороговый цикл (Ct±m) и диапазон (мин.-макс.) средний пороговый цикл (Ct±m) и диапазон (мин.-макс.) Клещ Павловского Ixodes pavlovskyi 28,8±1,0 31,1±1,5 31,4±1,4 (15,9-41,4) (15,3-47,5) (20,9-41,3) Таежный клещ Ixodes persulcatus 28,3±1,4 36,4±1,6 41,4±0,8 (17,0-42,0) (22,3-49,5) (34,7-46,1) Всего в клещах ... 28,6±1,0 33,6±1,1 36,4±1,0 (15,9-42,0) (15,3-49,5) (20,9-46,1) Красная полевкаMyodes rutilus Pallas: органы 38,6±4,9 37,3±1,4 Н.и. (26,6-49,6) (24,8-45,8) клетки крови 30,9±1,0 40,8±1,1 Н.и. (11,8-48,1) (35,4-46,4) Полевая мышь Apodemus agrarius Pallas: органы 33,6±1,7 36,9±2,8 52,7 (11,9-49,6) (22,9-46,5) клетки крови 33,7±1,4 35,0±1,0 Н.и. (11,9-49,6) (22,9-46,2) Красно-серая полевка Myodes rufocanus Sundevall: органы 26,1±4,8 33,8±2,3 Н.и. (10,7-41,4) (18,3-42,7) Лесная мышовка Sicista betulina Pallas: органы 35,6±3,5 32,6±2,4 Н.и. (19,5-49,3) (22,4-46,2) Грызуны: органы 33,7±2,1 35,0±1,2 52,7 (11,9-49,6) (22,9-46,2) клетки крови 31,8±1,1 39,6±1,0 Н.и. (11,8-49,6) (22,9-46,4) Обыкновенная бурозубка Sorex araneus L.: органы 40,5±2,3 29,8±2,6 29,0±2,5 (14,0-50,3) (25,6-48,1) (26,0-31,9) Всего в мелких млекопитающих: органы 36,0±1,3 36,0±1,4 36,9±10,0 (10,7-52,5) (22,9-48,1) (26,0-52,7) Молекулярное типирование посредством ОТ- ПЦР-РВ и филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей генов Е и NS1 изолятов РНК ВКЭ от клещей (см. рисунок) показали моно- или смешанные формы инфекции тремя основными типами ВКЭ. Анализ генетического состава ВКЭ у инфицированных иксодид обоих видов показал, что в среднем превалировала доля особей с Сиб-типом (84,7±4,7%), значимо (p < 0,01) меньше была доля клещей с ДВ-типом - 61,0±6,4% и еще меньше Евр - 14,0±4,6% (см. табл. 1). Вместе с тем у I. pavlovskyi доля особей, содержащих ДВ-тип (76,7±7,9%), была достоверно (p < 0,05) выше таковой у I. persulcatus (44,8±9,4%) (см. табл. 1). При этом доли Сиб-типа у разных видов клещей были близкими (90,0±5,6 и 82,8±7,1%) и Евр-типа ВКЭ - 14,3±6,7 и 13,8±6,5% (см. табл. 1). Исходя из сходных значений пороговых циклов (31,1±1,5 и 36,4±1,6), вирусные нагрузки также были близкими (табл. 2). Выявлены особенности генетического состава ВКЭ в клещевых суспензиях в зависимости от патогенности для мышей ICR (см. табл. 1). В абсолютном большинстве клещей обоих видов, содержащих патогенный ВКЭ, обнаружена смесь в основном ДВ- и Таблица 3 Сравнение вирусоносительства с распределением трех основных типов ВКЭ среди мелких млекопитающих Виды млекопитающих Доля животных с РНК ВКЭ (%) (Aim)1, X/n Доля животных, инфицированных ВКЭ определенного типа, среди образцов, положительных в ОТ-ПЦР-РВ, % ДВ (A±m) Сиб (A±m Евр (A±m) Смешанная инфекция (A±m) Красная полевка Myodes rutilus Pallas: органы 78,1±7,4 84,0±7,4 52,0±10,2 0 36,0±9,8 25/32 21/25 13/25 0/15 9/25 клетки крови 82,2±5,8 91,9±4,5 54,1±8,3 Н.и. 45,9±8,3 37/45 34/37 20/37 17/37 Красно-серая полевка Myodes rufocanus Sundevall: органы 46,2±8,1 66,7±11,4 61,1±11,8 0 27,8±10,9 18/39 12/18 11/18 0/10 5/18 Полевая мышь Apodemus agrarius Pallas: органы 35,3±8,3 41,7±14,9 75,0±13,0 14,3±14,3 25,0±13,0 12/34 5/12 9/12 1/7 3/12 клетки крови 47,0±8,7 93,8±6,2 31,3±12,0 Н.и. 25,0±11,2 16/34 15/16 5/16 4/16 Лесная мышовка Sicista betulina Pallas: органы 77,8±10,0 64,3±13,3 85,7±9,7 0 50,0±13,9 14/18 9/14 12/14 0/12 7/14 Обыкновенная бурозубка Sorex araneus L.: органы 73,3±8,2 77,2±9,2 45,5±10,8 28,6±12,5 31,8±10,2 22/30 17/22 10/22 4/14 7/22 Всего в органах мелких млекопитающих (гры- 59,5±4,0 70,3±4,8 60,4±5,2 8,9±3,8 34,0±5,0 зунов и насекомоядных) ... 91/153 64/91 55/91 5/56 31/91 Всего в органах и крови мелких млекопитаю- 62,1±3,2 78,5±3,4* 55,6±4,2 36,1±4,0 щих (грызунов и насекомоядных) ... 144/232 113/144 80/144 52/144 Примечание. '(A±m): А - % животных, содержащих РНК ВКЭ среди исследованных, m - статистическая погрешность (в %); * - уровень статистической значимости отличий p < 0,001. Сиб-типов. Напротив, среди клещей с апатогенным ВКЭ детектировали преимущественно моноинфекции РНК ВКЭ и лишь у 14,2±6,7% из них смесь ДВ- и Сиб-субтипов. Таким образом, сравнительное изучение зараженности I. pavlovskyi и I. persulcatus показало, что спектр основных генетических типов и нейровирулентность ВКЭ не имели значимых различий у двух видов. Вместе с тем доли клещей с патогенным для лабораторных мышей вирусом и более опасным для человека ДВ-типом ВКЭ были значимо больше у клеща Павловского по сравнению с таежным. Детекция и молекулярное типирование ВКЭ у мелких млекопитающих. Мелкие грызуны - красная полевка Myodes rutilus Pallas, красно-серая полевка Myodes rufocanus Sundevall, полевая мышь Apodemus agrarius Pallas, лесная мышовка Sicista betulina Pallas и насекомоядные - обыкновенная бурозубка Sorex araneus L (1758) прокармливают личинок и нимф иксодовых клещей и являются резервуарными хозяевами ВКЭ на территории Новосибирской области [7]. Детекция ВКЭ в органах 153 особей перечисленных видов и крови 45 красных полевок и 34 полевых мышей посредством ОТ-ПЦР-РВ, иммунофермент- ного анализа (ИФА) на антиген Е ВКЭ и биопробы на мышах ICR показала, что инфицированность позвоночных хозяев ВКЭ (табл. 3) существенно превосходила зараженность иксодовых клещей (см. табл. 1). Однако патогенный для лабораторных мышей вирус среди образцов, содержащих субвири- онные компоненты ВКЭ, обнаруживали в отличие от клещей только у единичных зверьков. При этом признаки КЭ у лабораторных мышей были стертыми, обычно без параличей и парезов, что могло быть обусловлено аттенуацией вируса при персистенции в организме диких млекопитающих [15]. Субвирионные компоненты (РНК ВКЭ и/или белок Е) и патогенный для лабораторных мышей ВКЭ были выявлены в пробах 70,9±3,0% исследованных зверьков. Частота детекции вирусной РНК в пробах органов млекопитающих составляла в среднем 62,1±3,2% (см. табл. 3). Встречаемость вирусной РНК в клетках крови красной полевки и полевой 100 81 100 □ изолят ВКЭ 61 Microtus rossiae □ изолят ВКЭ 11 от Sorex araneus □ изолят ВКЭ 42 Myodes rutilus JO0 Софьин JN229223 □ изолят ВКЭ 12 от Myodes rutilus □ изолят ВКЭ 21 от Myodes rutilus □ изолят ВКЭ 27 от Myodes rutilus _ Васильченко L40361 Айна JN003206 * изолят 2452 от Ixodes persulcatus GQ423570 * изолят 2730 от Ixodes pavlovskyi JN993573 Заусаев AF527415 I *изолят 2432 от Ixodes persulcatus GQ423569 *изолят 2689 от Ixodes persulcatus JQ693478 100 рАбсеттаров AF091005 Найдорф NC 001672 К23 АМ600965 ОГЛ штамм NK-8-14(3)/9984 AF482348 0,08 0,06 Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей фрагмента гена Е изолятов ВКЭ от иксодовых клещей и мелких млекопитающих на территории Новосибирской области (выделенные жирным шрифтом и звездочкой), с использованием ПО Mega 6.06 (UPGMA, 1000 репликаций). Внешняя группа: штамм NK-8-14(3)/9984 вируса омской геморрагической лихорадки (ОГЛ) (номер доступа в GenBank AF482348), выделенный от гамазового клеща Androlaelaps casalis на территории Новосибирской обл. в 1991 г. Референсные штаммы трех основных генетических типов ВКЭ: Софьин (дальневосточного типа); Айна, Васильченко и Заусаев (сибирского типа); Абсеттаров, Найдорф и К23 (европейского типа). мыши соответствовала инфицированности образцов их органов. Молекулярное типирование посредством ОТ- ПЦР-РВ с генотипспецифичными флуоресцентными зондами показало моно- или смешанные формы инфекции ДВ-, Сиб- и Евр-субтипами ВКЭ (см. табл. 3). В среднем среди инфицированных млекопитающих в отличие от клещей значимо чаще (p < 0, 001) детектировали ДВ-тип у 78,5±3,4%, Сиб-тип у 55,6±4,2%, Евр-тип у 8,9±3,8% особей. При этом смесь генетических субтипов ВКЭ обнаруживали как в одном, так и в разных органах у одной особи млекопитающих, в среднем у 36,1±6,4% особей (см. табл. 3). Моноинфекция Евр-типа в отличие от клещей не выявлена ни у одного вида, но в смешанной форме РНК ВКЭ Евр-типа детектировали у полевой мыши и обыкновенной бурозубки. В органах большинства видов мелких млекопитающих наблюдали относительное доминирование моноинфекции ДВ-типа ВКЭ по сравнению с таковой Сиб-типа. В крови полевой мыши и красной полевки выявлено достоверное (p < 0,001) превалирование образцов с моноинфекцией ДВ-типа. Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей генов Е (см. рисунок) и NS1 ВКЭ (данные не представлены) от клещей и из органов мелких млекопитающих показал инфекцию Сиб- и ДВ-типом ВКЭ, что соответствовало результатам ОТ-ПЦР-РВ с генотипспецифичными флуоресцентными зондами (см. табл. 1, 3) [7, 13, 14]. Необходимо отметить совпадение топологии деревьев, построенных с использованием пяти альтернативных алгоритмов ПО Mega 6.06, что наряду с высокими индексами поддержки кладистических групп (см. рисунок) свидетельствует о достоверности молекулярного типирования на основании филогенетического анализа. Количественные оценки. Пороговые циклы изо- лятов РНК ВКЭ от клещей варьировали в диапазоне от 15,3 до 49,5 (см. табл. 2). Средние пороговые циклы для ДВ-типа ВКЭ у двух видов клещей были сходными, а для Сиб- и Евр-типа у клеща Павловского достоверно меньше, чем у таежного клеща (см. табл. 2), что свидетельствовало о повышенных вирусных нагрузках и, следовательно, опасности I. pavlovskyi. На основании калибровочного графика зависимости пороговых циклов от количеств генов- эквивалентов ВКЭ [10] и уравнения Лукьянова- Матца можно оценить средние количества молекул геномной РНК в инфицированных клещах: ДВ-тип - 3,2 • 104 копий в клеще; Сиб и Евр - приблизительно в 10 и 100 раз меньше соответственно. При этом для клеща Павловского количества РНК Сиб-типа (5,7 • 103 в клеще) и Евр-типа (4,7 • 103) были существенно больше по сравнению с таковыми у таежного клеща (1,5 • 102 и 1,2 -101 соответственно). У диких млекопитающих средние пороговые циклы РНК ВКЭ в органах были сходными для трех основных типов ВКЭ (см. табл. 2), что соответствовало нескольким тысячам генов-эквивалентов РНК ВКЭ в мозге и селезенке. Необходимо отметить повышенные вирусные нагрузки ДВ- и Сиб-типов ВКЭ у мелких грызунов по сравнению с насекомоядными (см. табл. 2). Количества РНК ДВ-типа ВКЭ в 1 мл крови варьировали в диапазоне до 2,4 • 105 и Сиб-типа - до 2,4 • 102. Масса крови, поглощаемой за многодневный период питания на млекопитающих, составляет в среднем у личинок I. persulcatus Генетический состав ВКЭ в исходных образцах Количество Генетический состав ВКЭ в пробах мозга лабораторных биопробных мышей проб X/n1 исходное заражение 1 пассаж (A±m)2 смесь ДВ и Сиб ДВ Сиб отрицательные смесь ДВ и Сиб Патогенные гомогенаты клещей Смесь ДВ- и Сиб-типов 14/16 87,5±8,5 12 1 1 0 14 Монотип ДВ 1/16 6,3±6,3 0 1 0 0 1 ОТ-ПЦР - отрицательные 1/16 6,3±6,3 1 0 0 0 1 В с е г о ... 16 13/16 2/16 81,3±10,1 12,5±8,5 Апатогенные гомогенаты клещей 1/16 6,3±6,3 0/16 0 16/16 100% Смесь ДВ- и Сиб-типов 8/94 8,5±2,9 1 0 3 4 Н.и. Монотип ДВ 15/94 16,0±3,8 0 1 1 13 Н.и. Монотип Сиб 1/94 1,1±1,1 0 0 1 0 Н.и. ОТ-ПЦР - отрицательные 70/94 74, ±4,5 0 0 3 67 Н.и. В с е г о ... 94 1/94 1/94 8/94 1,1±1,1 1,1±1,1 8,5±2,9 Апатогенные гомогенаты органов мелких млекопитающих 84/94 89,4±3,2 Н.и. Смесь ДВ- и Сиб-типов 17/130 13,1±3,0 0 1 7 9 Н.и. Монотип ДВ 30/130 23,1±3,7 0 5 5 20 Н.и. Монотип Сиб 12/130 9,2±2,5 0 1 3 8 Н.и. ОТ-ПЦР - отрицательные 71/130 54,6±4,4 0 3 7 61 Н.и. Таблица 4 Трансформация генетического состава ВКЭ из гомогенатов клещей и органов мелких млекопитающих в головном мозге лабораторных мышей ICR В с е г о ... 130 0/130 10/130 22/130 98/130 Н.и. 0 8,7±2,5 16,9±3,3 75,3±3,8 Примечание. 'X - абсолютное количество изолятов, содержащих РНК ВКЭ указанного генетического субтипа среди всех исследованных (n); 2(A±m): А - процент изолятов с ВКЭ указанного субтипа среди всех исследованных, m - статистическая погрешность (в %). 1,4 -2,6 мг, у нимф - 15,9-16,5 мг [4, 16]. Следовательно, при питании личинки могут быть инфицированы кровью мелких грызунов, содержащей до 624 молекул РНК ДВ-типа ВКЭ, нимфы - до 3960, Для Сиб-типа количества в 1000 раз меньше, поэтому возможно попадание лишь единичных геномных РНК как в личинки, так и в нимфы. Теоретическая возможность передачи ВКЭ разных типов с кровью диких грызунов неполовозрелым клещам подтверждает их резервуарную роль. Изменения соотношений генетических типов при адаптациях к лабораторным мышам. Комплексное (внутримозговое и подкожное) инфицирование новорожденных лабораторных мышей ICR гомогена- тами клещей или органов диких мелких млекопитающих, содержащих ВКЭ, приводило к изменениям исходного генетического состава ВКЭ (табл. 4). При этом смешанный состав патогенных изолятов ВКЭ после введения в мозг лабораторным мышам изменялся в единичных случаях. В то же время апа- тогенные изоляты вирусной РНК, полученные из клещей и органов млекопитающих, претерпевали существенную трансформацию генетической структуры с изменением, исчезновением исходных типов или даже появлением в мозге клинически здоровых мышей. Обращает на себя внимание одинаковый характер изменений исходного генетического состава апатогенного ВКЭ из клещей и органов млекопитающих - снижается доля образцов с РНК ВКЭ ДВ- типа и инфицированных смесью РНК двух типов, но увеличивается относительное количество образцов, содержащих моноинфекцию РНК ВКЭ Сиб-типа (см. табл. 4). Заключение Вирусоносительство у диких мелких млекопитающих существенно превышало вирусофорность среди иксодовых клещей. В отличие от клещей в гомогенатах органов и крови млекопитающих, содержащих РНК и/или белок Е ВКЭ, патогенный для лабораторных мышей вирус выявлен только у единичных особей. Молекулярно-генетический анализ показал, что на территории Новосибирской области среди клещей и мелких млекопитающих циркулируют 3 основных типа ВКЭ - дальневосточный, сибирский и европейский в моно- или политиповой форме. Среди инфицированных клещей преобладал сибирский тип ВКЭ (p < 0,01), у диких мелких млекопитающих - дальневосточный тип (p < 0,001). Исходный генетический состав изолятов ВКЭ от резервуарных хозяев претерпевал изменения в организме инфицированных лабораторных мышей- сосунков в зависимости от патогенности. При минимальных генетических перестройках патогенных изолятов ВКЭ трансформация апатогенных изоля- тов была значительной.

About the authors

V. N Bakhvalova

Institute of Systematics and Ecology of Animals of Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences

Email: bvntbe@yandex.ru
11, Frunze str., Novosibirsk, Russian Federation, 630091

G. S Chicherina

Institute of Systematics and Ecology of Animals of Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences

Email: chicherinagalina@bk.ru
11, Frunze str., Novosibirsk, Russian Federation, 630091

V. V Panov

Institute of Systematics and Ecology of Animals of Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences

11, Frunze str., Novosibirsk, Russian Federation, 630091

V. V Glupov

Institute of Systematics and Ecology of Animals of Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences

Email: skif@eco.nsc.ru
11, Frunze str., Novosibirsk, Russian Federation, 630091

O. V Morozova

Research Center of Epidemiology and Microbiology Center named after Academician N.F. Gamaleya

Email: omorozova2010@gmail.com
18, Gamaleya Str. Moscow, Russian Federation, 123098

References

Supplementary files