Method of DNA-comet assay in the diagnosis of liver fibrosis in patients with chronic viral hepatitis C

Full Text

Метод ДНК-комет был впервые предложен в 1984 г. Ostling и Johanson. На агарозный гель, нанесённый на предметные стёкла, помещали культуры клеток млекопитающих, затем их лизировали в гипертоническом растворе соли с детергентом. После этого образцы подвергали электрофорезу в нейтральных условиях, где освобождённая ДНК, в которой содержались двунитевые разрывы, мигрировала по направлению к аноду. Для визуализации генетического материала препараты окрашивали бромидом этидия и микроскопировали, анализируя структуры, похожие на кометы с «головой» из клубка ДНК и «хвостом» из мигрировавшей ДНК, на фотометре микроскопа [1]. Позже N. Singh и со- авт. [2] было предложено проводить электрофорез в щелочной среде (рН>13,0), что позволяло оценить не только двунитевые разрывы, но и однонитевые и щелочелабильные сайты. В 1990 г. P. Olive и соавт. [3] предложили ещё одну модификацию процедуры с рН ~ 12,3. Этот вариант оказался более чувствительным к оценке генотоксичности, так как геноток- сиканты индуцировали одно- и двунитевые разрывы и появление щелочелабильных сайтов. В медицине метод комет использовали для изучения генотоксического влияния органических соединений [4], состояния ДНК малигнизирован- ных клеток при раке шейки матки [5], эндометрия [6] . Особый интерес представляли лимфоциты как объект для изучения ввиду их относительно лёгкой доступности по сравнению с другими клетками человека. Состояние их ДНК изучали у курильщиков [7] , больных сахарным диабетом [8] и при тяжёлой сочетанной травме [9]. Результаты исследований помогли учёным установить роль деструкции ДНК в патогенетических процессах при данных состояниях, а также оценить тяжесть и выраженность патологических процессов у больных. Так, S. Shawki и соавт. [10] указали на патогенетически значимую роль повреждений ДНК в эволюции гепатоцеллю- лярной карциномы. Деструкция ДНК показывает интенсивность внутриклеточного оксидативного и нитрооксидативного стресса, которые могут запускать мутагенез и раковую трансформацию, что подчёркивает необходимость оптимизации терапии для уменьшения степени ДНК-повреждений. Вопрос, затрагивающий зависимость уровня повреждений ДНК в лимфоцитах от степени выраженности гистопатологических изменений в печени, до сих пор не изучен. Имеются противоречивые данные - одни авторы [11, 12] её подтверждают, указывая на значимую роль окислительного стресса, особенно возрастающего при исходе в цирроз, другие - отвергают [13, 14]. Такая противоречивость и послужила поводом для нашего исследования. Цель работы - изучить количество одно- и дву- нитевых разрывов ДНК-лимфоцитов, выделенных от больных хроническим вирусным гепатитом C (ХВГС) в зависимости от степени выраженности фиброза по данным эластометрии печени. Материалы и методы В исследовании приняли участие пациенты инфекционного отделения ГБУЗ «Краевая клиническая больница» №2 и ГБУЗ «Краевая клиническая инфекционная больница» - 100 человек за период 2012-2014 гг. Контрольную группу составили 43 добровольца без сопутствующих хронических заболеваний органов кровообращения и почек, сопоставимые по полу и возрасту с основной группой и у которых не определялись маркёры вирусных гепатитов в крови (табл. 1). 1-я 2-я 3-я 4-я 5-я 6-я % ДНК в хвосте кометы 13 ± 3,3 18 ± 3 25 ± 5,1* 57 ± 6,3* 68,4 ± 10,3* 12 ± 5 Количество повреждённых клеток, % 36* 42* 40* 64* 67* 20 Апоптотические клетки (число в 100 полях зрения) 1 ± 1 1 ± 1 1 ± 1 2 ± 1 5 ± 1* 1 ± 1 Некротические клетки (число в 100 полях зрения) 0 0 0 0 0 0 Характеристика изменений в ДНК лимфоцитов периферической крови в зависимости от фиброза печени у пациентов ским вирусным гепатитом С (1 - 5-я группы) и здоровых добровольцев (6-я группа) Таблица 2 с хрониче- Группа *р < 0,05 в сравнении с контрольной группой. Возраст больных колебался от 25 до 79 лет, средний возраст составил 43 ± 14 лет; количество мужчин - 51, женщин - 49. Все исследуемые были разделены на 6 групп: 1-я - пациенты со степенью фиброза F0 («=19), 2-я - пациенты со степенью фиброза F1 («= 21), 3-я - пациенты со степенью фибро- Таблица 1 Демографическая характеристика больных хроническим вирусным гепатитом С по группам в зависимости от стадии фиброза печени Показа- Группа тель 1-я 2-я 3-я 4-я 5-я 6-я Количество человек 19 21 20 17 23 43 Средний возраст 48 ± 17 47 ± 14 43 ± 15 38 ± 12 47 ± 12 39 ± 12 Коли- 9/10 10/11 12/8 10/7 11/12 25/18 чество мужчин/ женщин в группе за F2 (n=20), 4-я - пациенты со степенью фиброза F3 («=17), 5-я - пациенты со степенью фиброза F4 («=23), 6-я - контрольная группа (« = 43). Критериями включения пациентов в группу были наличие подтверждённого методом ИФА гепатита С с давностью заболевания более 6 мес, идентифицированного генотипа 1 и установленного количества вируса в крови методом ПЦР. Степень выраженности фиброза печени определяли на аппарате FibroScan по классификации METAVIR. Биохимическую активность при гепатите устанавливали на основании лабораторных синдромов мезенхимального воспаления, цитолиза, холестаза. Критериями исключения служили: признаки хронической артериальной недостаточности, ишемическая болезнь сердца, сердечная недостаточность, сахарный диабет, пациенты с другими инфекционными заболеваниями и сопутствующими заболеваниями внутренних органов в стадии обострения, беременные, пациенты с психическими заболеваниями, курильщики. Все больные получали стандартную патогенетическую терапию ХВГС. Исследование проб крови проводили однократно - при поступлении у пациентов забирали 2 мл цельной крови в пробирки, содержащие антикоагулянт. Выделение лимфоцитов проводили поэтапным методом с использованием градиента фиколл- урографина (р=1,077 г/см3) в стерильных условиях (Boyum,1968). Цельную кровь, разведенную питательной средой 199 (1:2), наслаивали на раствор Исследуемые группы □ со Ш С1 0 С2 ■ СЗ Щ С4 Рис. 1. Степень деструкции ДНК-лимфоцитов периферической крови, выраженная в классах ДНК-комет. фиколл-урографина и центрифугировали при комнатной температуре в центрифуге с горизонтальным ротором при 2000 оборотах/мин в течение 30 мин. Выделенные клетки трижды отмывали средой 199, центрифугируя по 10 мин при 1000 оборотов/мин. Оценку степени повреждения ДНК проводили щелочной модификацией метода ДНК-комет (P. olive [3]). Отмытые лимфоциты (50 мкл) смешивали с 500 мкл 1% раствора легкоплавкой агарозы («Sigma»), приготовленной на фосфатно-солевом буфере при температуре 37° С до финальной концентрации 104 клеток/мл. Затем 60 мкл клеточной суспензии наносили на слайды, предварительно покрытые нормоплавкой агарозой («Sigma») и накрывали покровными стёклами. Слайды для застывания агарозы хранили 5 мин при температуре 4° С. После затвердевания агарозы снимали покровные стекла и помещали препараты в холодный (4° С) лизирующий буфер (10 мМ Tris-HCl, pH 10,0, 2,5 мМ NaCl, 100 мМ EDTA-Na2, 1% Triton X-100, 10% ДМСО) на 1 ч при 4° С. По окончании лизиса препараты помещали в камеру для электрофореза, содержащую щелочной буфер (300 мМ NaOH, 1мМ EDTA-Na2) на 40 мин. Далее проводили электрофорез при напряжении 20 В и силе тока 300 мА в течение 25 мин. Слайды после электрофореза трижды по 5 мин обрабатывали нейтральным буфером (0,4 М Tris-HCl pH 7,5), затем дегидратировали метанолом и красили раствором бромида этидия (2 мкг/мл). Препараты ДНК просматривали на флюоресцентном микроскопе Zeiss при увеличении в 200 раз. Полученные изображения анализировали с помощью программы Comet Score. Анализу подвергались не менее 100 клеток каждого препарата. Для степени повреждения ДНК использовали показатель содержания ДНК в хвосте комет (% DNA t %) и процент повреждённых клеток, который рассчитывали по формуле (C2+C3+C4) / (C0+C1+C2+C3+C4) • 100%. Апоптотические клетки идентифицировали как специфичные ДНК- кометы с диффузным «хвостом» и практически отсутствующей «головой», некротические клетки определяли как широкие рыхлодиффузные ДНК- кометы неправильной формы. Классифицировали кометы по классам в зависимости от показателя % ДНК в «хвосте» следующим образом: С0 - 0 - 20%, С1 - 24 - 40%, С2 - 41 - 60%, С3 - 61 - 80%, С4 - 81 - 100%. Статистическую обработку проводили с помощью программы WinStat. Результаты и обсуждение Щелочная модификация метода ДНК-комет позволила оценить количество одно- и двунитевых разрывов, а также подсчитать популяцию лимфоцитов, погибших путём апоптоза. Оценивая полученные результаты по критерию % ДНК в «хвосте» кометы, было установлено, что уровень показателей изменялся от группы к группе в зависимости от степени выраженности фиброза (табл. 2). Из таблицы следует, что при фиброзе F2 - F4 (3 - 5-я группы) наблюдались наиболее выраженные изменения по сравнению с таковыми в контрольной группе (о<0,05). Обсуждая механизмы повреждения ДНК-лимфо- цитов, следует учесть, что ведущее место занимает окислительный стресс, который, как известно, присутствует при ХВГС с генотипом 1 [15, 16]. Возрастающая интенсивность процессов окисления с увеличением степени фиброза и других системных изменений в организме пациентов усиливает повреждение ДНК не только лимфоцитов, но и других клеток. А деструктивная ДНК - прямой путь к канцерогенезу и раковому перерождению клетки [10, 12]. На рис. 1, 2, а, б, в, г, д, е отражены преобладающие классы ДНК-комет в исследуемых группах, где наблюдалась следующая картина: в 1-й и 6-й группах преобладали кометы класса С0, во 2-й и 3-й группах - С1, в 4-й группе - С2, в 5-й группе - С3. Также прослеживается постепенное увеличение доли повреждённых клеток от 20% в контрольной группе до 67% в группе больных циррозом печени в исходе ХВГС (см. табл. 2). Такое распределение свидетельствует об усиливающейся деструкции ДНК лимфоцитов в зависимости от степени фиброза в печени. Также следует отметить, что во всех группах присутствовали апоптотические клетки в единичном количестве, однако в 5-й группе их количество было достоверно больше по сравнению со всеми остальными группами (см. табл. 2). Некротических клеток не было зарегистрировано ни в одной группе. Таким образом, полученные результаты совпадают с имеющейся информацией об увеличении интенсивности апоптоза при хроническом вирусном гепатите на стадии цирроза, поскольку апоптоз служит естественным путём элиминации любых стареющих и повреждённых клеток, в том числе и лимфоцитов [17]. Рис. 2. Микрофотографии ДНК-комет лимфоцитов периферической крови больных хроническим вирусным гепатитом С и здоровых добровольцев. а - 1-я группа; б - 2-я группа, в - 3-я группа, г - 4-я группа, д - 5-я группа, е - 6-я группа. Окраска бромидом этидия. х200. Заключение Проведённое исследование показало взаимосвязь между стадией выраженности фиброза и степенью деструкции ДНК-лимфоцитов периферической крови. Максимально процесс деструкции ДНК-лимфоцитов периферической крови установлен у пациентов с ХВГС с исходом в цирроз. Это позволило рассматривать метод ДНК- комет как перспективный дополнительный вспомогательный метод в оценке формирования фиброза печени. Кроме того, метод перспективен и в получении информации о состоянии генетического аппарата клеток пациента в целом на примере лимфоцитов, что может быть использовано для прогноза вероятности формирования гепато- карциномы.

About the authors

A. F Popov

Pacific State Medical University

Email: doctor.popov@mail.ru
2, Ostryakova Pr., Vladivostok, Russian Federation, 690002

A. O Mikhailov

Pacific State Medical University

Email: mao1991@mail.ru
2, Ostryakova Pr., Vladivostok, Russian Federation, 690002

N. S Ivanova

Pacific State Medical University

2, Ostryakova Pr., Vladivostok, Russian Federation, 690002

A. I Simakova

Pacific State Medical University

Email: anna-inf@yandex.ru
2, Ostryakova Pr., Vladivostok, Russian Federation, 690002

References

Supplementary files