Phylogenetic analysis in epidemiological investigations of cases of HIV infection

Full Text

С увеличением количества ВИЧ-инфицированных лиц расследование случаев ВИЧ-инфекции становится необходимой и часто используемой мерой. Основным методом, применяющимся при этом, является эпидемиологическое расследование. В рамках проведения эпидемиологического расследования передачи ВИЧ-инфекции, особенно в нозокомиальных очагах и криминальных случаях, возникает потребность в получении объективных данных о связи между предполагаемым источником инфекции и реципиентом. Однако не во всех случаях результаты эпидемиологического расследования позволяют определить истинный источник ВИЧ-инфекции и подтвердить предполагаемые связи. С этой целью могут быть использованы современные методы молекулярной диагностики. В течение пяти месяцев 2011-2012 гг. были зарегистрированы 3 случая заражения замужних, социально-адаптированных женщин репродуктивного возраста ВИЧ, у которых постоянные половые партнеры имели отрицательный ВИЧ-статус. В ходе эпидемиологического расследования было выяснено, что женщины получали медицинскую помощь в учреждении, занимающемся вспомогательными репродуктивными технологиями, и сделано предпоДля корреспонденции: Сандырева Татьяна Павловна, зав. отд-нием лабораторной диагностики «ГБУЗ Свердловский областной центр по профилактике и борьбе со СПИД и инфекционными заболеваниями», e-mail: sandyreva@mail.ru ложение о нозокомиальном случае инфицирования. Было проведено серологическое обследование круга контактных лиц, включая сотрудников клиники, и выявлен ВИЧ-инфицированный сотрудник, задействованный в оказании помощи пострадавшим женщинам как донор для процедуры цитоиммунизации. Собранные эпидемиологические данные указывали на сотрудника, как на предполагаемый источник ВИЧ-инфекции. Согласно существующим рекомендациям “Эпидемиологическое расследование случая ВИЧ-инфекции и проведение противоэпидемических мероприятий” [1], в Российской Федерации при эпидемиологическом расследовании может применяться генотипирование с целью определения субтипа штаммов ВИЧ-1. Выявление в исследуемых образцах штаммов разных субтипов ВИЧ-1 свидетельствует о получении инфекции из разных источников и отсутствии эпидемиологической связи. В России наиболее распространенным является субтип А1 ВИЧ-1, который встречается более чем в 80% случаев [2]. Поэтому результаты субтипирова-ния вируса часто оказываются неинформативны для эпидемиологического расследования. Филогенетический анализ как способ установления генетического родства между вариантами ВИЧ-1 на основе сравнения вирусных геномов успешно применяется в эпидемиологических расследованиях за рубежом с 1990 г. [3-5]. В нашей стране отсутствуют опубликованные работы по данной 17 ЭПИДЕМИОЛОГИЯ И ИНФЕКЦИОННЫЕ БОЛЕЗНИ, № 1, 2014 Рис. 1. Филогенетическое дерево образцов исследуемой группы (22, 26227, 26228, 26588) и группы сравнения, построенное на основании нуклеотидных последовательностей региона pol. теме. Вместе с тем в связи с широким распространением ВИЧ-инфекции существует острая необходимость стандартизации и внедрения филогенетического анализа в эпидемиологическое расследование. Достоверность результатов филогенетического анализа чрезвычайно важна, так как они могут быть использованы в качестве доказательств передачи при расследовании случаев ВИЧ-инфекции в ходе судебного процесса, например в нозокомиальных очагах или при профессиональном инфицировании. В данной работе представлены результаты филогенетического анализа при расследовании групповых случаев ВИЧ-инфекции, выполненного на основе зарубежных рекомендаций “The use of phylogenetic analysis as evidence in criminal investigation of HIV transmission” [6], для верификации выводов, полученных при классическом эпидемиологическом подходе. Материалы и методы Исследования проводились в отделении лабораторной диагностики ГБУЗ СО “Свердловский областной центр по профилактике и борьбе со СПИД и инфекционными заболеваниями” и затем были верифицированы в ФБУН Центральный НИИ эпидемиологии Роспотребнадзора. Были собраны образцы плазмы крови от четырех инфицированных женщин, одна из которых была предполагаемым источником для остальных. Для установления генетического родства между вариантами ВИЧ исследуемой группы и циркулирующими вариантами в популяции ВИЧ-инфицированных лиц на территории Свердловской области в качестве локального контроля в исследование были включены 50 образцов плазмы крови пациентов, проживающих в данном регионе, в возрасте 22-35 лет, большинство (72%) женщины, заразившиеся в течение последних двух лет. Для получения нуклеотидных последовательностей вариантов ВИЧ-1 по регионам гена протеазы (pro) и обратной транскриптазы (rev) использовался набор реагентов ViroSeq (Abbott, США), региона гена белков оболочки (env) набор реагентов “АмплиСенс HIV-Resist-Seq” (ФБУН цНИи эпиде миологии, Россия), согласно инструкции производителя. Исследование проводили методом прямого автоматического секвенирования по обеим цепям с использованием генетического анализатора ABI 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, США). Обработка данных секвенирования и получение консенсусной нуклеотидной последовательности для региона pol проводились с помощью программного обеспечения Viroseq HIV-1 Genotyping System Software v.2.8 (Celera, США), для региона env с помощью программного обеспечения ДЕОНА (ООО “МедАйтиГрупп”, Россия). В результате получали 18 Рис. 2. Филогенетическое дерево образцов исследуемой группы (22, 26227, 26228, 26588) и группы сравнения, построенное на основании нуклеотидных последовательностей региона env. специфические фрагменты ДНк: регион генов pro и rev 1302 пары нуклеотидов (п.н.) и регион env -424 п.н. Дальнейшую работу с нуклеотидными последовательностями (множественное выравнивание, расчет генетических дистанций и построение филогенетических деревьев) проводили с помощью программного обеспечения BioEdit version 7.0.9.0 (http://www. mbio.ncsu.edu/ bioedit/bioedit.html) и MEGA version 5 (http://www.megasoftware.net) с использованием статистического метода Maximum Likelihood analysis (bootstrap level 1000). Субтипирование штаммов ВИЧ-1 проводили с помощью программного обеспечения COMET HIV-1/2 and HcV (http://comet. retrovirology.lu) и REGA HIV-1 Sybtyping Tool v.2.0 (http://dbpartners.stanford.edu). Нуклеотидные последовательности исследуемой группы депонированы в GeneBank с присвоенными уникальными номерами для образцов 22, 26227, 26228, 26558 соответственно по гену pol KF147834 KF147837, по гену env KF147838 KF147841. Результаты и обсуждение Увеличение числа ВИЧ-инфицированных пациентов среди лиц, получающих медицинскую помощь, а также рост числа случаев ВИЧ-инфекции среди доноров крови и медицинского персонала повышает риски нозокомиального механизма передачи инфекции. В ходе проведения эпидемиологического расследования был выявлен ограниченный круг лиц, которые могли составлять цепь передачи с одним источником и несколькими реципиентами. Для подтверждения данных, полученных в ходе эпидемиологического расследования, было проведено молекулярно-биологическое исследование, включающее субти-пирование и филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей вариантов ВИЧ-1 пациенток и предполагаемого источника. Результаты субтипирования нуклеотидных последовательностей показали, что все образцы исследуемой группы относятся к уникальной рекомбинантной форме URF A1/CRF03. Большинство образцов группы сравнения по региону env и pol относятся к субтипу А1 ВИЧ-1. Только один образец группы сравнения (№ 624) принадлежал к циркулирующей рекомбинантной форме CRF02_AG по обоим регионам (рис. 1), и для одного образца (№ 26813) получен дискордантный результат субтипирования: CRF03_AB для региона pol, и В для региона env (рис. 2). Согласно рекомендациям зарубежных исследователей, основными критериями подбора группы сравнения являются: путь инфицирования, географический регион проживания, сроки инфицирования, социальный контекст, оптимальная численность 20-50 образцов. При сложности подбора локальной контрольной группы возможно использование нуклеотидных последовательностей, депонированных в международных базах данных, руководствуясь 19 ЭПИДЕМИОЛОГИЯ И ИНФЕКЦИОННЫЕ БОЛЕЗНИ, № 1, 2014 указанными критериями подбора. Для проведения анализа рекомендуется исследовать не менее двух регионов размером в пределах 500 нуклеотидов и более. Необходимо отметить, что выбор фрагментов генома ВИЧ для анализа чрезвычайно важен для обеспечения надежности получаемых результатов. В филогенетический анализ были включены нуклеотидные последовательности вариантов ВИЧ-1 по регионам pol и env, полученные от трех реципиентов, и предполагаемого источника, образовавшие исследуемую группу и 50 нуклеотидных последовательностей группы сравнения. По регионам pol и env проведено выравнивание нуклеотидных последовательностей, приведение их к единому размеру по самой короткой, затем были построены филогенетические деревья. В дальнейшем группу сравнения сократили до 25 образцов наиболее топологически близких к исследуемой группе, оптимизировали дендрограмму без искажения результатов филогенетического анализа (см. рис. 1, 2). Анализ структуры филогенетических деревьев, построенных по обоим регионам, показал, что образцы, входящие в исследуемую группу, образуют общий кластер, обособленный от образцов группы сравнения. При этом генетическая дистанция среди образцов исследуемой группы составила: по региону pol 1,048-1,503%, по региону env 0%, что значительно меньше, чем между ближайшими образцами исследуемой группы и группы сравнения: 2,149 и 7,873% по регионам pol и env соответственно. Результаты филогенетического анализа указывают на наличие эпидемиологической связи внутри исследуемой группы, что подтверждает случай нозокомиальной передачи ВИЧ-инфекции. Заключение Таким образом, с помощью филогенетического анализа было показано, что степень генетического родства образцов исследуемой группы выше, чем в группе сравнения, что в сочетании с данными эпидемиологического расследования подтверждает участие предполагаемого источника в инфицировании трех женщин. Однако в тех случаях, когда результаты филогенетического анализа противоречат результатам эпидемиологического расследования или когда проведение филогенетического анализа согласно всем критериям невозможно, результаты филогенетического анализа должны использоваться с осторожностью. Особую значимость в филогенетическом анализе имеют следующие аспекты: стандартизация этапов исследования и профессионализм лаборатории, соблюдение критериев подбора группы сравнения, выбора анализируемых регионов, размера исследуемых областей и методологии построения филогенетических деревьев, так как результаты могут быть определяющими доказательствами в эпидемиологическом расследовании и использованы в судебном процессе. В настоящее время существует необходимость в нормативных документах, регламентирующих методологию применения филогенетического анализа в ходе расследования нозокомиальных и криминальных случаев ВИЧ-инфекции. Авторы статьи благодарны за консультативную и практическую помощь в проведении эпидемиологического расследования и подготовке статьи В.В. Покровскому, Н.Н. Ладной, С.Ю. Ковалеву, С.С. Смирновой, Н.Ю. Пономаренко.

About the authors

T. P. Sandyreva

Sverdlovsk Regional Center for prevention of AIDS and Infectious Diseases and Combating the Spread of AIDS

Email: sandyreva@mail.ru

N. A. Gerasimova

Sverdlovsk Regional Center for prevention of AIDS and Infectious Diseases and Combating the Spread of AIDS

Email: ngerasimova2010@gmail.com

N. A. Lopatukhin

Central Research Institute of Epidemiology" of The Federal Service on Customers' Rights Protection and Human Well-being Surveillance

Email: lopatukhin@pcr.ru

N. A. Kireev

Central Research Institute of Epidemiology" of The Federal Service on Customers' Rights Protection and Human Well-being Surveillance

Email: Dmitry.kireev@pcr.ru

N. A. Kuevda

Central Research Institute of Epidemiology" of The Federal Service on Customers' Rights Protection and Human Well-being Surveillance

Email: Dmitry.kuevda@pcr.ru

N. A. Shipulin

Central Research Institute of Epidemiology" of The Federal Service on Customers' Rights Protection and Human Well-being Surveillance

Email: german@pcr.ru

N. A. Podymova

Sverdlovsk Regional Center for prevention of AIDS and Infectious Diseases and Combating the Spread of AIDS

Email: org@livehiv.ru

References

Supplementary files