Taxonomic status of Bhanja and Kismayo viruses (family Bunyaviridae)

Full Text

Прототипный штамм вируса Бханджа IG-690 был впервые изолирован в 1954 г. из клещей НаешарЬу-salis intermedia, собранных с козы в Индии [13]. Впоследствии циркуляция вируса Бханджа была установлена во многих странах Африки, Азии и Европы [7, 8]. Вирус Бханджа наряду с двумя африканскими переносимыми клещами арбовирусами Кисмайо и Форекария на основании перекрестных связей, выявленных в реакции связывания комплемента (РСК) и реакции торможения гемагглютинации (РТГА), объединены в антигенную группу Бханджа [2, 3, 5]. На основании данных электронной микроскопии вирус Бханджа был включен в состав семейства Bunyaviridae в категорию Бунья-подобных вирусов [11]. Для вирусов Бханджа, Кисмайо и Форекария не установлено антигенных связей с другими представителями семейства Bunyaviridae, и их таксономическое положение до настоящего времени не определено. Известно, что вирус Бханджа обладает патогенностью для человека, вызывая острые лихорадочные гриппоподобные заболевания [1, 4, 12]. Описан случай тяжелого менингоэнцефалита при естествен- Для корреспонденции: Климентов Александр Сергеевич, аспирант ФГБУ НИИ вирусологии, мл. науч. сотр. ФГБУ Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов, e-mail:aklimentov@ mail.ru ном заражении через укус клеща [14]. Имеющаяся в литературе информация о вирусах Форекария и Кисмайо весьма ограничена. На настоящий момент какие-либо данные молекулярно-генетических исследований вирусов группы Бханджа отсутствуют. Настоящая работа посвящена определению таксономического положения вирусов Бханджа и Кис-майо в пределах семейства Bunyaviridae. Материалы и методы В работе были использованы вирусы из коллекции лаборатории биологии и индикации арбовиру-сов ФГБУ НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского Минздравсоцразвития РФ, Москва. Штамм IG-690 вируса Бханджа был выделен в 1954 г. в Вирусологическом центре, г. Пуна, штат Орисса, Индия. Источником выделения послужили клещи Haemaphysalis intermedia [13]. Вирус поддерживался в пассажах через мозг новорожденных белых мышей (н. б. м.), детальная пассажная история штамма недоступна. Штамм Rh91 вируса Кисмайо был выделен в 1974 г. в Институте полиомиелита и вирусных энцефалитов АМН CCCP из клещей Rhipicephallus pul-chellus, собранных с домашних животных в Сомали [2]. Штамм прошел 17 пассажей через мозг н. б. м. 4 Тотальную РНК из вируссодержащего материала выделяли реагентом "Тризол" ("Gibco BRL") и переводили в двунитевую ДНК с использованием рандомизированного олигонуклеотида с адапто-ром FR28-RT-N: 5 ’ -GCCGGAGCTCTGCAGATATC-NNNNNNNN-3’(Синтол), как для синтеза первой цепи при помощи обратной транскриптазы SuperScrip-tII ("Invitrogen"), так и для синтеза второй цепи при помощи фрагмента Klenow exo-ДНК-полимеразы I E. coli ("Fermentas"). Амплификацию проводили с использованием олигонуклеотида, комплементарного адапторному участку. Продукты ПЦР разделяли в 1% агарозном геле, фрагменты длиной 300—1200 п. н. выделяли из геля с помощью коммерческого набора QIAquick Gel Extraction Kit ("Qiagene") и клонировали с использованием набора InsTAclone PCR Cloning Kit ("Fermentas"). Секвенирование клонов проводили с использованием универсальных праймеров M13^UC ("Fermentas"/"Promega") на автоматическом секвена-торе Beckman Coulter CEQ 8000. Рис. 1. Иммуноблоты фракций сахарозных градиентов, содержащие вирусы Бханджа (BHAV) и Кисмайо (KISV), окрашенные антителами к вирусам Бханджа (а) и Кисмайо (б). Справа от блотов указано положение маркеров молекулярных масс в кД, слева — расчетные массы и положения окрашиваемых вирус-специфических белков. Для обработки последовательностей использовали программы SeqMan и SeqBuilder (пакет программ LaserGene DNAStar v7.0). Выравнивание аминокислотных последовательностей проводили с помо Рис. 2. Фрагмент множественного выравнивания выведенных аминокислотных последовательностей L-сегмента генома вирусов Бханджа и Кисмайо с 709-й по 925-ю аминокислоту (нумерация по выведенной аминокислотной последовательности полимеразы вируса Бханджа), флебовирусов (объединены в рамку) и прототипных представителей других родов семейства Bunyaviridae. Белыми буквами на черном фоне обозначены аминокислоты, которые консервируются более чем в 60% аминокислотных последовательностей, использованных для построения выравнивания. Серым цветом выделены гомологичные аминокислоты. Тире обозначены пропуски в аминокислотных последовательностях, образовавшиеся при построении выравнивания. Для вирусов Бханджа и Кисмайо приведены общепринятые сокращения BHAV и KISV соответственно. STFSV — Severe fever with thrombocyt^e^a syndrome (код доступа в NSBI: ADZ04509); UUKV — Uukuniemi virus (NP941973); SFSV — Sandfly Sicilian Turkey virus (YP004382743); SFNV — Sandfly fever Шр^ (YP089669); RVFV — Rift Valley fever virus (YP003848704); HTNV — Hantaan virus (NP941982); BUNV — Bunyamwera virus (NP047211); DUGV — Dugbe virus (NP690576); TSWV — Tomato spotted wilt virus (NP049362). 5 ЭПИДЕМИОЛОГИЯ И ИНФЕКЦИОННЫЕ БОЛЕЗНИ, № 4, 2012 щью подпрограммы ClustalW в программе Mega5 [9]. Филогенетический анализ проводили методом ближайших соседей (neighbour-joining). При построении филогенетического дерева использовали р-дистанцию (р-distance). Статистическую значимость топологии полученных деревьев оценивали "bootstrap"-тестом (1000 реплик). При постановке иммуноблота белки разделяли с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях в присутствии до-децилсульфата натрия по Лэммли. Использовали стандарты молекулярных масс PageRuller Prestained Protein Ladder ("Fermentas") или SeeBlue Plus2 PreStained Protein Standard ("Invitrogen"). В качестве первичных антител использовали ИАЖ мышей, иммунизированных вирусами Бханджа или Кисмайо, а в качестве вторичных — кроличьи антимышиные антитела, конъюгированные с пероксидазой хрена ("Promega"). Результаты и обсуждение Подход, использованный нами для определения нуклеотидной последовательности геномов виру сов Бханджа и Кисмайо, был основан на методе неспецифичной амплификации нуклеиновых кислот с одного рандомизированного праймера с адаптером (sequence independent single primer amplification (SISPA)) [6]. В качестве исходной матрицы для создания геномных библиотек была использована тотальная РНК, изолированная из частично очищенных в градиенте плотности сахарозы препаратов вирусов Бханджа и Кисмайо. Вируссодержащие фракции определяли методом иммуноферментного анализа с использованием поликлональных антител к вирусам Бханджа и Кисмайо, а также иммунобло-та. На рис. 1 приведены результаты анализа фракций сахарозных градиентов, использованных для выделения РНК, с помощью иммуноблота с использованием антител к вирусам Бханджа и Кисмайо (а и б соответственно). Как видно, антитела к вирусу Бханджа окрашивают во фракции, содержащей вирус Бханджа, два белка с мол. массами 26 и 27 кД (см. рис. 1, а). Антитела к вирусу Кисмайо в этой же фракции достоверно окрасили по крайней мере один белок массой 26 кД (см. рис. 1, б). Во фракции, содержащей вирус Кисмайо, антитела к этому виру- 30 40 50 60 10 ао 100 I ■ I ■ SADPHCGS DTVfc IGDRQf lvhk Λε V vis ygJtr V] rhqvsMvavIhtkhgs vapgjJpieIyY' |ILRRHSAVIE§NVI HANGSilVQIQVSl I . . . . I . . . . I . . . . I . . . . I |sqqffJkeBv pvlq-qpsge ”fsrmmatl§vn ppeqrig-c S LW SiSK PL Ξ KRSVTVQQ P I - - - I - - - I - - - - I - - - - I - ÜMTiTTEGISISSIKDELKDVT’ ihle|inggvrlitltselrs|t’ BesdIkvdhilIivrhfypdhycI eravIlrJmI pp p ve t se dt|d s|y se|l ds h ï i>r s t g fm i sg| |i|y ее vJrrt s lkme dt s s r e§dt§lwe1gkn kl iIkth g pki v y IephglvXrstgfkissI ER VVpiRjL SÄKPIQRVEF Л' A 9 .. I .... I .... I .... I .... I JSTRVSKGSKVWKIEFNNQYP3S iSSGK ksJeHh fhsgslvg-iRAK D KE FKHP FKMADRL S D ,t-impsBeHmipypgmas- M-QKPAMF V YLPYPGMSE-:S-QSpsBeBtlky pgi SQ- BHAV SFTSV uukv SFSV SFNV RVFV BHAV SFTSV UUKV SFSV SFNV RVEV 110 120 I I .... I ---|St^QARGTTVGGES FELTA- —ktaihvkgalvdgteftfeg; ---SHFEIRIWDKERSMEYFLES: SI GÎeBG IH L S H DE VQ V S S H Y R VHl ivgIcBgvhmteesspsnihmvah ssgIeBgvhmahddqsvsskivah 160 170 180 190 200 I . . . . I . , . . I — ■ I — ■ I ■ ■ I ■ ■ I — I ■ — I ■ — I |LLFLM--LAVFYIFÏALiKTIMRIIMTCLSILYG|FMIVIKISRC 150 I lYPYGK! IY РА КК.Ш FI 11V·- -1LLG Y A< fskeqvBilvavs--slcil: Ihtalsafvvvtl-vvlvvlm; htlfsaJlistt-vmsiltl: IhTALSAFWVFV-FSSIAII' 210 , , . , I , , . , l , LGRLGKRKGERTY LMRTVSCLVGKLMl 220 I , , . . I , , ILMEAID“ ÎRQ---- 230 . I . . I 240 - J - . I vAlm IdJgR TCSKRLNKRAERLKESIHSLEEGLNNV! TSRKLKLSTERRIâBiNE — mikswkkkvgsaisJtnd--- IYKKMVARVA DMINQVNR— -vïhJ] stnvcSî I 250 260 270 , I - . - , I , . - , I , , - . I , , , . I , DEKEPEAPKPMATANKAKQPRIVLFIILGIFVHVAF |E I GE MGEGM Q D DVR IEMARPRR VRH WM YS p VI LT I LAI G L AEi FREQNNPARAVARPNVRÛKMFNLTRLSFVVVGMÉCLACP1 IG WR F EE ARAT H RMR DR D---RRFIPRSAVYLAiBfLISV' TIGWRDNRRYGRDVERAQYTGGAPGAKYSFYGVMlBsLLGN1 JlGWMEGGQLVLGNPAPIPR--HAPI PR YSTYLMl|lï VS Yj IGVWGSWVI. VIATFTWKII I VgKRC§VL FR VAPAVLL11 |LLVKGAKDLVKKLFYWLIT l| YR vgKCL КIA PR К VLNl| IVKLMFAÏ IKK IfwBilsllcr IfsBiiklacw IlcBlsvfcgw IlmBitafirw 280 ■ . I - 310 , . . . I , . ,. r, BHAV VITÏEÎELRj SFTSV RALLPAVNE UUKV SSLLQVSP] SFSV LVNVEÎAGPlI SFNV TVIMKLGPlI RVFV TALI RAGS 320 330 I . Э40 . 1 . . 350 - I . I 360 . I . 370 - I . . 380 200 , , , I T - г , I ISFGSDNIFi RQGSGNMK] ST35DGVW, F/AKG-SKS' ttsg-sst: |steg-vnt: 390 GGSLSNPIF IgSPDSKCT.F GTAVD5IR0 |Z>SADKKFL-7 KDNEKQFI^ 7KEDQTKFLK V1LDIVGRS DL L DiEeJy NGH ANHid l/KR I nIkÉkKS SMF V FD AR Ξ rBt| γό ikIeBvrrd^BvprvthrBi GTl |I AS 91 Is E GQBŒs QY G'VEJLSs Il s s evtIre geI^t l y t p vblhs i/s S eIsIrE Goftffil 3 S FS pkilBs . I .... I .... I I .... I IrwaMsBgnsg-JvgvgkedydrJlgeqess—THPNWRC IrwaBdBqsgc p- fh ftsHsfIddwagkmdrag--lgfsg Jkgea-|sefki|dy|pBwgheeelma-qlgwsy| VAEgKGDARWNWTLvIrIfQGIΓΝЫ--SVISENR SDR-BlKWKT|etBaBfTGKAHG- -EVMHENR |H VN R-i L S W R dBetIaIfS F VGE S - - TTM RE WK LMHeB LVgEg BHAV SFTSV UUKV SFSV SFNV RVFV 420 430 . I . . . . I . . . . I . . . KRYGTNADSRVF 440 450 460 470 480 I .... 1 .... I .... I .... I .... I .... I .... I .... I .... I .... I .. . Л|к PL aBfLST К Г V V DT AT HKE DTTLK S G E AK VI DK V S FH Y RT DKN L FAG ITIP SpMaaBvPSAVIД iflMPSGEVRTFHPMSGIPTQVFK§V5VTyjGSDMEVSGLT fylrktfshlsqdafniyeBseBsyrinvlvstnsthsnltlklgvpdsiphglislssvsqppaiays- H AR LRAT KRE AI HHnJ I cBsH R L Via l| DFN GKK E К V ΞΜΤ GMT TQ FF SWlSMT L a|d FEG IT GTNS , Y VH ΞILKSVYKN G fBÏIrBvaIn H R I. R Ш vBt US R - KF PM V LMAM S TQ PT Dw|s IG LI BdSEG IT GTN A HT Y LQSVRKE A LMBnB I cflvH К LT LB lB DF DG S V S TIDLGAS S SR FT NwBs VS L sBdÆG IS G SN S Рис. 3. Множественное выравнивание выведенной аминокислотной последовательности M-сегмента генома вируса Бханджа с 305-й по 778-ю аминокислоту (нумерация аминокислот согласно аминокислотной последовательности предшественника гликопротеинов SFTSV) и флебовирусов. Потенциальный сайт отщепления поверхностного гликопротеина Gc от белка-предшественника указан стрелкой. Использованы обозначения и сокращения, как и на рис. 2. Коды в базе NCBI: STFSV — ADZ04471, UUKV — NP941979, SFSV — YP004382742, SFNV — YP089671 и RVFV — YP003848705. 6 су окрашивают полосу, соответствующую мол. массе ~24 кД, которая, вероятнее всего, представляет собой 2 белка с близкими молекулярными массами (см. рис. 1, б). Антитела к вирусу Бханджа также окрашивают в этой фракции по крайней мере один белок мол. массой 24 кД (см. рис. 1, а). Основным иммуногеном при буньявирусной инфекции является белок нуклеокапсида. Следовательно, можно предположить, что выявленные в иммуноблоте белки, вероятнее всего, являются белками нуклеокап-сида. В пользу этого свидетельствует и наличие перекрестного окрашивания, поскольку именно белок нуклеокапсида распознается в реакции связывания комплемента, а исследуемые вирусы в этой реакции имеют перекрестную антигенную связь [5]. Соответствующую выявленным нами белкам вирусов Бханджа и Кисмайо молекулярную массу имеют белки нуклеокапсида, только представители родов Phlebovirus и Orthobunyavirus. Нами было секвенировано более 200 клонов библиотеки вируса Бханджа и около 50 клонов — вируса Кисмайо. Большинство секвенированных клонов содержали вставки ДНК генома мыши (98% для библиотеки вируса Бханджа и 92% — вируса Кисмайо), как правило, нуклеотидные последовательности 18S либо 28S рибосомальных РНК. Тем не менее в каждой из геномных библиотек было обнаружено по 4 клона, содержащих последовательности нуклеотидов, не имевших значимой гомологии ни с одной из нуклеотидных последовательностей баз данных NCBI. В связи с этим было проведено сравнение выведенных аминокислотных последовательностей с базами данных NCBI. В результате было обнаружено, что 5 из 8 выведенных аминокислотных последовательностей имеет родство с белками, кодируемыми геномами представителей рода Phlebovirus. В одном из клонов библиотеки вируса Бханджа содержалась нуклеотидная последовательность, которая на аминокислотном уровне имела сходство в 39% с участком, расположенным между 694-й и 750-й аминокислотами предшественника поверхностных гликопротеинов (кодируется средним (M) сегментом генома) вируса тяжелой лихорадки с синдромом тромбоцитопении (Severe fever with thrombocytopenia syndrome virus (SFTSV), JQ684872). Выведенные аминокислотные последовательности еще двух клонов этой же библиотеки имели сходство в 38% с участком со 160-й по 216-ю аминокислоту и в 52% с Рис. 4. Филогенетические деревья построены на основании выравнивания практически полной аминокислотной последовательности полимеразы (отсутствуют 23 C-концевые аминокислоты, согласно аминокислотной последовательности SFTSV) (а) и фрагмента предшественника поверхностных гликопротеинов (б) вируса Бханджа и представителей всех родов семейства Bunyaviridae. Цифры в узлах деревьев соответствуют бутстреп-поддержке. Положение вируса Бханджа на деревьях указано стрелкой. Вирус Gouleako на деревьях отмечен звездочкой, поскольку предложено выделить его в отдельный от флебовирусов род [9]. Для вирусов, не приведенных на рис. 2 и 3, использованы следующие сокращения (в скобках приведены коды доступа в NCBI для L- и M-сегментов): AGUV — Aguacate virus (YP004414703, YP004414702); CDUV — Candiru virus (YP004347993, YP004347992); GOUV — Gouleako virus (ABP68557, AEJ38174); WSMoV — Watermelon silver mottle virus (NP620752, NP620767); GBNV — Groundnut bud necrosis virus (NP619688, NP619703); TZSV — Tomato zonate spot virus (YP001740047); TSWV — Tomato spotted wilt virus (NP049362, NP049359); CaCV — Capsicum chlorosis virus (YP717924); INSV — Impatiens necrotic spot virus (NP619710, NP619691); MYSV — Melon yellow spot virus (YP717933, YP717935); ANDV — Andes virus (NP604473, NP604472); DOBV — Dobrava-Belgrade virus (NP942555, NP942554); SEOV — Seoul virus (NP942558, NP942557); SNV — Sin Nombre virus (NP941976, NP941974); TPMV — Thottapalayam virus (YP001911124); TULV — Tula virus (NP942124, NP942586); BUNV — Bunyamwera virus (NP047212, NP047211); OROV — Oropouche virus (NP982304, NP982303); AKAV — Akabane virus (YP001497159, YP001497160); LACV — La Crosse virus (NP671968, NP671969); DUGV — Dugbe virus (NP690576, NP690575); CCHFV — Crimean-Congo hemorrhagic fever virus (YP325663, NP950235). 7 ЭПИДЕМИОЛОГИЯ И ИНФЕКЦИОННЫЕ БОЛЕЗНИ, № 4, 2012 участком с 825-й по 937-ю аминокислоту флебовирус-ной полимеразы (кодируется большим (L) сегментом генома) вирусов Армеро (Armero, HQ661805) и SFTS (JQ684871) соответственно. Аминокислотные последовательности двух клонов библиотеки вируса Кис-майо имели сходство в 48% с 549-й по 689-ю и с 865-й по 978-ю аминокислоту полимеразы вируса SFTS. На основании полученных нуклеотидных последовательностей были сконструированы специфические олигонуклеотиды, которые были использованы для праймерной "прогулки" и создания библиотек. В результате нам удалось определить 1398 (~40% длины сегмента) и 6186 (~96% длины сегмента) нуклеотидов последовательности М- и L-сегментов соответственно генома вируса Бханджа и 1297 (~20% длины сегмента) нуклеотидов последовательности L-сегмента генома вируса Кисмайо. Для определения таксономического положения вирусов Бханджа и Кисмайо выведенные аминокислотные последовательности белков, кодируемых L- и M-сегментами генома, были проанализированы при помощи множественного выравнивания с белками других представителей семейства Bunyaviridae (рис. 2 и 3). Анализ показал, что наиболее высокое сходство белка, кодируемого L-сегментом исследуемых вирусов, наблюдается с L-белками представителей флебовирусов: 36% идентичности с SFTSV и 32% с другими представителями рода. Гомология между вирусами Бханджа и Кисмайо на этом участке составляет 77%. M-сегмент вируса Бханджа также кодирует белок, наиболее близкородственный поверхностным гликопротеинам флебовирусов (30% идентичности с SFTSV, 25% с UUKV и флебовирусами, переносимыми москитами). Таким образом, можно сделать заключение, что исследуемые вирусы являются новыми представителями рода флебовирусов. Данный вывод был дополнительно подтвержден при помощи филогенетического анализа. На филогенетических деревьях, построенных для белков, кодируемых сегментами L (рис. 4, а) и M (рис. 4, б) представителей семейства Bunyaviridae, частично секвенированный нами вирус Бханджа с высокой степенью достоверности (100% для L-сегмента и 92% для M-сегмента) группируется с вирусами, входящими в род Phlebovirus. Следует отметить, что ближайшим родственником (хотя весьма дальним) является вирус, вызывающий тяжелую лихорадку с синдромом тромбоцитопении в Китае (SFTSV). Вирус Форекария, имея серологическое родство с вирусом Бханджа, также, вероятно, является флебовирусом. Заключение Результаты проведенного нами молекулярногенетического анализа частично секвенированных сегментов генома, кодирующих поверхностные гликопротеины и вирусную полимеразу вируса Бхан-джа, и геномного сегмента, кодирующего полимеразу вируса Кисмайо, позволяют сделать заключение, что исследованные вирусы являются новыми пред ставителями рода Phlebovirus в составе семейства Bunyaviridae.

About the authors

A. S Klimentov

Email: aklimentov@mail.ru

A. P Gmyl

Email: apgmyl@mail.ru

A. M Butenko

Email: arboelisa@mail.ru

L. V Gmyl

Email: lvgmyl@mail.ru

O. V Isaeva

V. F Larichev

Email: vlaritchev@mail.ru

N. V Khutoretskaya

Email: arboelisa@mail.ru

G. G Karganova

Email: karganova@bk.ru

References

Supplementary files