Heterogeneity of Salmonella isolates obtained from various sources in Russia 2010–2019

Full Text

Введение

Одной из ключевых характеристик популяции возбудителя является ее гетерогенность, обусловливающая потенциальную адаптивную способность в окружающей среде [1, 2]. Применительно к пищевым антропозоонозам это свойство отражает в том числе и адаптацию патогена к широкому спектру естественных хозяев [3, 4]. Человек в эпидемическом процессе данных нозологий представляет собой индикаторное звено, реагирующее на изоляты, способные преодолевать его гастральный барьер и обладающие значимым потенциалом вирулентности для развития манифестных форм заболеваний.

Сопоставление разнообразия субвидовых типов (субтипов) возбудителей, изолируемых из продуктов питания, внешней среды и человека, позволяет точнее идентифицировать пути и факторы их передачи, особенно при их сочетанной активности в очагах заболеваемости, и выявить возможные ассоциации с конкретными видами продукции. Так, в странах ЕС в последние годы прослеживаются ассоциации серотипа Newport с мясом индеек и бройлеров, Infantis – с мясом бройлеров, «монофазных» Typhimurium со свининой и мясом бройлеров [5]. Наряду с этим значительная часть изолятов сальмонелл, выделенных из естественных источников, относится к субтипам, крайне редко выявляемым у человека, что ставит под сомнение их эпидемический потенциал и требует осторожной оценки фактов их выявления в продуктах питания.

Понимание данных особенностей находит отражение в подходах к контролю безопасности продуктов питания в рамках надзора за сальмонеллезом, которые могут существенно различаться в разных государствах. В странах ЕС требования по отсутствию содержания сальмонелл в продуктах питания на этапе их розничной продажи касаются только двух серотипов – S. еnteritidis и S. typhimurium [6]. В Российской Федерации традиционным является подход, при котором оценка безопасности продукта питания не учитывает субвидовой характеристики выявляемых изолятов сальмонелл^*.

Ограниченная дифференцирующая способность серотипирования как метода внутривидовой дифференцировки сальмонелл не позволяет достичь высокой достоверности реконструкции связей между различными звеньями цепи передачи патогена при проведении эпидемиологических расследований и требует применения более чувствительных дифференцирующих методов. Одним из наиболее распространенных методов субвидовой дифференцировки сальмонелл на протяжении многих лет являлся анализ набора продуктов рестрикции тотальной ДНК в пульсирующем электрическом поле – пульс-электрофорез (PFGE – Pulsed Field Gel Electrophoresis). Стандартизированные протоколы данных методик нашли широкое применение в практике эпидемиологического надзора разных стран [7, 8].

Целью данной работы является сравнительная субвидовая характеристика изолятов нетифоидных Salmonella enterica subsp. enterica, выделенных из клинического материала и различных объектов окружающей среды в РФ в период 2011–2019 гг.

Материал и методы

Изоляты Salmonella spp., включенные в исследование, были выделены от людей, предполагаемых пищевых факторов передачи возбудителя и образцов воды, исследованных в очагах заболеваемости вне зависимости от наличия доказательств их связи с заболеваниями человека. Выделение изолятов проводилось в ФБУЗ «ЦГиЭ» Роспотребнадзора в субъектах РФ, их дальнейшие исследования – в ФБУН «Центральный НИИ эпидемиологии» Роспотребнадзора.

Видовая идентификация штаммов выполнялась методом MALDI-TOF масс-спектрометрии (Bruker microflex (Bruker Daltonics, США). Для серотипирования использовались моноклональные реагенты Enteroclons (Sifin, Германия).

Генетическое субтипирование осуществлялось методом пульс-гель электрофореза (PFGE – Pulsed Field Gel Electrophoresis) – рестрикции тотальной бактериальной ДНК эндонуклеазами рестрикции XbaI и BlnI по протоколу PulseNet International Network с применением программного комплекса Bionumerix 6.6 (Applied Maths, США) [9].

Субтипы сальмонелл распределялись с помощью индексов α-разнообразия Симпсона и Шеннона (натуральный логарифм):

 

 

Достоверность различий в распространенности субтипов сальмонелл в различных источниках выделения оценивалась с использованием критерия χ² Пирсона. Оценка корреляции между параметрами, характеризующими разнообразие генотипов, проводилась с использованием коэффициента корреляции Пирсона.

Результаты

Динамика превалирования трех ведущих серотипов Salmonella enterica subsp. enterica среди изолятов, выделенных от человека, в период 2011–2019 гг., представлена на рис. 1.

 

Рис. 1. Доля трех ведущих серотипов Salmonella enterica subsp. enterica, среди изолятов, выделенных от человека (2011–2019 гг., ежегодное количество исследованных изолятов от 244 до 405, данные по серотипам Typhimurium и Infantis представлены по вспомогательной оси).

 

Ассоциация 20 доминирующих серотипов сальмонелл с продуктами питания и водой представлена на рис. 2.

 

Рис. 2. Sankey-диаграмма распределения двадцати ведущих по распространенности у людей сероваров сальмонелл по различным источникам изоляции (Российская Федерация, 2010–2019 гг.).

 

Распределение исследованных изолятов Salmonella enterica subsp. enterica с их дифференцировкой на серотипы и PFGE-типы для различных источников выделения представлено в табл. 1.

 

Таблица 1

Распределение изолятов, серотипов и параметры разнообразия PFGE-типов Salmonella enterica subsp. enterica в различных источниках выделения

Источник выделения изолята	Количество изолятов	Количество серотипов	Количество PFGE-типов	PFGE-тип
				индекс Симпсона	индекс Шеннона
Человек	2518	69	449	0,20	3,52
Мясо кур	235	21	107	0,06	3,91
Яйца кур	60	5	19	0,25	2,05
Свинина	26	9	22	0,02	2,99
Говядина	18	6	12	0,08	2,29
Индейка	14	5	10	–*	–*
Рыба	24	3	9	–*	–*
Вода (открытые водоемы, сточная)	89	28	67	0,01	4,09
Многокомпонентные блюда	92	5	20	0,15	2,27

Примечание. * – неприменим в связи с малым количеством типов.

 

Наиболее высокое разнообразие PFGE-типов наблюдалось в различных типах водных объектов и в мясе кур, наименьшее – в яйцах кур и многокомпонентных блюдах (в состав которых часто входят яйца кур). Разнообразие изолятов, выделяемых от человека, в данном ряду занимало промежуточное положение.

Распределение исследованных изолятов Salmonella enterica subsp. enterica с их дифференцировкой на серотипы и PFGE-типы для превалирующих серотипов представлено в табл. 2.

 

Таблица 2

Параметры разнообразия PFGE-типов для 10 серотипов Salmonella enterica subsp. enterica, превалировавших в исследованной выборке образцов

Серотип	Количество изолятов	Количество PFGE-типов	PFGE-тип
			индекс Симпсона	индекс Шеннона
Enteritidis	2062	102	0,38	2,00
Infantis	227	98	0,04	3,89
Typhimurium	134	66	0,04	3,69
Muenchen	64	30	0,08	2,94
Agona	39	11	0,13	2,06
Senftenberg	35	12	0,27	1,75
Kottbus	34	13	0,17	2,07
Braenderup	30	10	0,26	1,67
Bredeney	29	11	0,05	2,71
Litchfield	29	18	0,25	1,77

 

Среди трех превалирующих серотипов минимальное разнообразие PFGE-генотипов наблюдалось у наиболее распространенного Enteritidis, более высокое – у Infantis и Typhimurium.

Коэффициент корреляции между разнообразием генотипов сальмонелл во внешней среде и популяции человека составил по индексу Симпсона 0,770 (р = 0,015), по индексу Шеннона – 0,705; (p = 0,034) (табл. 3).

 

Таблица 3

Параметры разнообразия PFGE-типов Salmonella enterica subsp. enterica среди клинических изолятов и объектов окружающей среды в период 2011–2019 гг.

Год	Клинический материал				Внешняя среда
	изоляты	количество PFGE-типов	PFGE-тип		изоляты	количество PFGE-типов	PFGE-тип
			индекс Симпсона	индекс Шеннона			индекс Симпсона	индекс Шеннона
2011	244	22	0,41	1,57	19	7	0,3	1,44
2012	256	51	0,24	2,52	40	16	0,11	2,38
2013	406	105	0,12	3,44	91	36	0,11	2,88
2014	260	73	0,2	2,74	47	21	0,11	2,59
2015	299	72	0,31	2,38	57	21	0,11	2,52
2016	310	78	0,23	2,74	57	37	0,06	3,21
2017	264	67	0,22	2,61	53	36	0,04	3,33
2018	396	83	0,15	2,93	153	79	0,04	3,81
2019	252	65	0,19	2,80	177	82	0,07	3,70

 

Разнообразие PFGE генотипов сальмонелл трех ведущих серотипов сальмонелл в различных источниках выделения представлено на рис. 3.

 

Рис. 3. Минимальное остовное дерево PFGE-генотипов с использованием эндонуклеаз рестрикции XbaI и BlnI для S. еnteritidis (n = 2270) (а), S. typhimurium (n = 170) (б), S. infantis (n = 482) (в) в различных источниках изоляции.

 

Все серотипы сальмонелл, изолированные из продуктов питания встречались также среди клинических изолятов. В образцах воды были выявлены четыре штамма, относимых к четырем серотипам сальмонелл (Agama, Dabou, Fluntern, Konstanz), которые не обнаруживались в исследованной выборке образцов клинического материала. Два из них (серотипы Agama и Konstanz) были изолированы из воды открытых водоемов и два других (серотипы Dabou и Fluntern) – из сточных вод.

Штаммы, характеризовавшиеся идентичностью PFGE-паттернов при использовании двух эндонуклеаз рестрикции (XbaI и BlnI), встречались только в пределах одного серотипа сальмонелл.

Использованный протокол PFGE обладал более высокой разрешающей способностью в отношении изолятов серотипа Typhimurium (индекс Шеннона 3,69) и Infantis (индекс Шеннона 3,89), более низкой – в отношении серотипа Enteritidis (индекс Шеннона 2,00).

Соотношение общих с выделяемыми от человека и уникальных для фактора передачи PFGE-типов сальмонелл, представлено на рис. 4.

 

Рис. 4. Доля PFGE-типов (а) и относимых к ним изолятов сальмонелл (б), общих для факторов передачи и клинического материала (черные блоки) и уникальных, не выявлявшихся у человека (серые блоки).

 

Одними из наиболее распространенных субтипов сальмонелл, уникальных для различных источников выделения, являлись (здесь и далее номенклатура PFGE-типов сальмонелл приведена в соответствии с шаблоном Pulse Net International по внутренней базе данных лаборатории МДиЭ кишечных инфекций ФБУН «ЦНИИ эпидемиологии» Роспотребнадзора):

• для мяса кур – PFGE-типы серотипа Infantis 0074/JFXA26.0066, JFXX01.0089/JFXA26.0044, JFXX01.0018/JFXA26.0005, JFXX01.0024/JFXA26.0004, JFXX01.0056/JFXA26.0004;
• для мяса индейки – PFGE-тип JGPX01.0002/JGPA26.0001 серотипа Kentucky;
• для свиней – PFGE-тип JMPX01.0005/JMPA26.0012 серотипа Senftenberg;
• для воды естественных источников – PFGE-тип JPXX01.0029/JPXA26.0025 серотипа Typhimurium.

Наряду с уникальными для объектов окружающей среды, были идентифицированы субтипы сальмонелл, диспропорционально представленные среди клинических изолятов и других источников выделения (табл. 4).

 

Таблица 4

PFGE-типы сальмонелл, имеющие достоверные различия в частоте выявления в клиническом материале и объектах окружающей среды

Серотип_PFGE-тип	Частота выявления					Значимость по критерию χ2 Пирсона, р
	у человека		в других источниках выделения
	абс.	%	источник	абс.	%
Enteritidis_JEGX01.0001/JEGA26.0001	1118	44,4	Мясо кур	51	21,7	< 0,0001
			Свинина	4	15,38	0,002
			Вода	4	4,49	< 0,0001
Enteritidis_JEGX01.0005/JEGA26.0006	160	6,35	Рыба	5	20,83	0,017
			Мясо кур	3	1,28	< 0,0001
Enteritidis_JEGX01.0012/JEGA26.0012	9	0,36	Яйца кур	5	8,33	< 0,0001
Infantis_JFXX01.0015/JFXA26.0011	11	0,44	Мясо кур	15	6,38	< 0,0001
Montevideo_JIXX01.0001/JIXA26.0001	2	0,08	Яйца кур	3	5,0	< 0,0001
Montevideo_JIXX01.0002/JIXA26.0002	7	0,28	Говядина	2	11,11	0,002

 

При сопоставлении данных субвидового типирования по различным территориям, можно было отметить как существенные различия в разнообразии выявляемых PFGE-типов на различных территориях, так и соответствие разнообразия субтипов сальмонелл, изолируемых из клинического материала, их разнообразию в потенциальных факторах передачи (табл. 5).

 

Таблица 5

Разнообразие PFGE-типов сальмонелл, изолируемых из клинического материала и объектов окружающей среды на различных территориях

Территория выделения	Изоляты из окружающей среды			Изоляты из клинического материала
	индекс Симпсона	индекс Шеннона	количество образцов, n	индекс Симпсона	индекс Шеннона	количество образцов, n
Омск	0,05	0,15	78	0,06	0,22	181
Новосибирск	0,06	0,16	47	0,15	0,35	57
Улан-Удэ	0,13	0,24	41	0,21	0,37	97

 

Обсуждение

Субвидовое генетическое типирование является важным инструментом в надзоре за пищевыми зоонозными инфекциями, который позволяет на качественно новом уровне оценивать ассоциации заболеваний с потенциальными факторами передачи патогена. Однако выход на такой уровень возможен при накоплении минимально достаточного количества информации, получаемой при применении данных методов. Проведенный массив исследований, выполненный на базе отдельной организации, позволил дать динамическую оценку разнообразию клинических изолятов сальмонелл, выделенных от пострадавших на протяжении нескольких лет, но был недостаточен для аналогичной оценки штаммов, выделяемых из потенциальных факторов передачи возбудителя. В силу этих причин примеры наиболее успешного внедрения в практику данных алгоритмов исследований базируются на создании многоцентровых сетей, объединяющих комплекс лабораторных подразделений, использующих унифицированные протоколы исследований на национальном уровне [7]. Рассматриваемые ранее в качестве эталонных методики PFGE-типирования в настоящее время уже не могут претендовать на эту роль, хотя и остаются широко распространенными в силу своей низкой экономической затратности [8, 19]. Разрешающая способность PFGE с использованием двух эндонуклеаз рестрикции (XbaI и BlnI) остается недостаточной для дифференцировки наиболее распространенного у человека PFGE-типа Enteritidis_JEGX01.0001/JEGA26.0001, составляющего 44% клинических изолятов в Российской Федерации. Для решения этой задачи незаменимыми являются методы полногеномного секвенирования на основе анализа коровых однонуклеотидных вариаций или полногеномного мультилокусного сиквенс-типирования, детектируя эволюционные изменения в геномах штаммов с высокой временной дискретностью.

Зависимость гетерогенности клинических изолятов сальмонелл от их разнообразия в потенциальных факторах передачи кажется очевидным фактом и подтверждается результатами проведенного исследования (см. табл. 3). Однако априорное рассмотрение всего комплекса сальмонелл, выявляемых в продуктах питания, в качестве облигатных возбудителей заболеваний у человека неправомерно, и может приводить к ошибочным оценкам при решении задач эпидемиологического прогнозирования. Выраженное превалирование общих с клиническими изолятами субтипов сальмонелл в куриных яйцах в сравнении с мясом кур и особенно индеек может объяснять ведущую роль куриных яиц в формировании вспышек сальмонеллеза в странах ЕС [5]. Полученные данные могут служить основой для дифференцированного подхода к оценке пищевой безопасности различных категорий продуктов питания с вычленением их типов, требующих более эффективного мониторинга.

Заключение

Отсутствие определенных субтипов сальмонелл в исследованном перечне клинических изолятов, безусловно, не может рассматриваться как критерий их авирулентности. Однако полученные результаты доказывают, что вирулентность является количественным, а не качественным параметром, и может варьировать у данной группы патогенов в широких пределах, определяемых степенью специфической адаптации к организму основного хозяина и наличием субтип-специфичных генетических детерминант вирулентности. Данные факты позволяют рассматривать популяцию Salmonella enterica subsp. enterica как очень разнородный комплекс потенциальных патогенов, требующих дифференцированной оценки их эпидемиологического потенциала.

Дополнительная информация

Финансирование. Исследование проведено в рамках отраслевой программы научно-исследовательских работ Роспотребнадзора «Научно-методическое обеспечение эпидемиологического надзора за острыми кишечными инфекциями».

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликтов интересов.

Участие авторов. Все авторы внесли значительный вклад в проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию до публикации.

Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.

Funding. The study was carried out within the framework of the Rospotrebnadzor's sectoral research program "Scientific and methodological support for epidemiological surveillance of acute intestinal infections."

About the authors

Sofia Sh. Rozhnova

Central Research Institute of Epidemiology

Email: salm@pcr.ru
ORCID iD: 0000-0002-3009-8593
SPIN-code: 8888-2294

PhD

Russian Federation, Moscow

Konstantin V. Kuleshov

Central Research Institute of Epidemiology

Author for correspondence.
Email: konstantinkul@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-5238-7900
SPIN-code: 7404-4080

PhD

Russian Federation, Moscow

Anastasia S. Pavlova

Central Research Institute of Epidemiology

Email: epid-oki@pcr.ru
ORCID iD: 0000-0003-4619-9337
SPIN-code: 7102-1513

MD

Russian Federation, Moscow

Anna N. Guseva

Central Research Institute of Epidemiology

Email: epid-oki@pcr.ru
ORCID iD: 0000-0001-7028-0253
SPIN-code: 3419-6926

MD

Russian Federation, Moscow

Tatiana A. Kozhakhmetova

Central Research Institute of Epidemiology

Email: epid-oki@pcr.ru
ORCID iD: 0000-0002-4821-7992
SPIN-code: 4942-3575

MD

Russian Federation, Moscow

Nadezhda K. Akulova

Central Research Institute of Epidemiology

Email: epid-oki@pcr.ru
ORCID iD: 0000-0003-0208-7165

MD

Russian Federation, Moscow

Alexander T. Podkolzin

Central Research Institute of Epidemiology

Email: epid-oki@pcr.ru
ORCID iD: 0000-0002-0044-3341
SPIN-code: 8937-5504

MD, PhD

Russian Federation, Moscow

References

Supplementary files