Molecular bases of the interaction of M. tuberculosis complex and anti-tuberculosis drugs: the current state of the problem and its epidemiological significance

Full Text

Введение

 

По оценкам международных экспертов, микобактерии туберкулеза убили 1 миллиард человек за последние 200 лет [1] и остаются одним из самых смертоносных патогенов в мире. Не смотря на многолетний опыт применения противотуберкулезных препаратов во всем мире, за 2021г. по данным ВОЗ в мире умерло от туберкулеза 1.6млн человек Кроме того, с 2020 по 2021 г. на 3% увеличилось бремя лекарственно-устойчивого туберкулеза и произошло 450 000 новых случаев развития туберкулеза с устойчивостью к рифампицину. Рост численности заболевающих туберкулезом и его лекарственно-устойчивыми формами отмечается впервые за много лет. [2].

Если рассматривать медицинские предпосылки данного явления, нельзя не упомянуть о различиях в эффективности антибиотикотерапии у разных больных. Причины этих различий часто кроются в особенностях взаимодействия микобактерий и противотуберкулезных препаратов (ПТП). В ряде случаев микобактерии, не изменяя своего генетического аппарата стараются приспособиться к новым условиям существования и выжить, оставаясь невосприимчивыми, толерантными к антибиотикам.

В других случаях происходят изменения наследственного аппарата микобактерий, которые становятся наследуемыми. Другими словами, развивается лекарственная устойчивость, ложащаяся непосильным бременем непосильным бременем на программы здравоохранения во всем мире. При этом некоторые штаммы настолько устойчивы, что заболевание невозможно вылечить существующей антибиотикотерапией [3].

На каких молекулярных основах стоится взаимодействие микобактерии и противотуберкулезного препарата? Как развивается лекарственная устойчивость у конкретных бактерий? Каковы ее предпосылки? Почему при лечении сходными препаратами у одних пациентов обнаруживаются лекарственно-устойчивые формы, а у других нет? Возможен ли прогноз ее развития? Эти и другие вопросы являются предметом рассмотрения данного обзора.

 

Общие положения

Туберкулез у человека вызывают микобактерии М. tuberculosis complex (МБТК) – группа микроорганизмов рода Мусоbаctеrium, вызывающих специфические туберкулезные поражения органов и тканей. В состав МБТК входят: Mycobacterium africanum, Mycobacterium canettii, Mycobacterium bovis, Mycobacterium microti, Mycobacterium orygis, Mycobacterium caprae, Mycobacterium pinnipedii, Mycobacterium suricattae и Mycobacterium mungi, в дополнение к M. tuberculosis [4, 5] Последовательности геномов членов MTBC почти идентичны друг другу (сходство более 99%), но микобактерии значительно различаются по тропизму и уровню патогенности для конкретного хозяина [6]

Эти облигатные патогены, которые вызывают туберкулез и туберкулезоподобные инфекции у людей и животных, вероятно, произошли от общего предка в Африке в эпоху неолита [6]. Считается, что MTBC развивается от общего предка путем последовательных вставок/делеций ДНК, которые приводят к видообразованию видов и вариациям их патогенности. Сравнительный геномный анализ выявил 14 областей различий (RD1−14), которые присутствуют в геноме M. tuberculosis H37Rv (эталонный лабораторный штамм), но отсутствуют в геноме M. tuberculosis.bovis var BCG (вакцинный штамм). В этих областях идентифицируются хромосомные гены, связанные с патогенностью. Напротив, шесть областей, включающих специфичную для M. tuberculosis делецию 1 (TbD1) и делецию 1-5 H37Rv (RvD1–5), отсутствуют в геноме M. tuberculosis H37Rv по сравнению с другими членами комплекса. M. canettii включает все области TbD1, RvD и RD и считается наиболее тесно связанным генетически с предком MTBC. Анализ распространения этих различных геномных областей в многочисленных штаммах MTBC, выделенных из разных популяций людей и видов животных, сформировал генетическую линию MTBC [7].

Адаптированные к человеку штаммы можно сгруппировать в девять различных линий, обнаруженных в разных частях мира [8]. Линии L1, L2, L3, L4 и L7 - M. tuberculosis sensu stricto, а L5, L6 и L9 - M. africanum [8]. Линии L2 и L4 широко распространены [9], причем L2 преобладает в Азии, а L4 является наиболее распространенной линией, обнаруженной в Африке, Европе и Америке [9]. Линии L1 и L3 обнаружены в Южной Азии и Африке вблизи Индийского океана, а L7 ограничен Эфиопией [10]. Линии M. africanum L5 и L6 встречаются только в Западной Африке, и на их долю приходится до 50% случаев заболевания туберкулезом в этом регионе [10].Недавно были описаны линии L8 и L9, которые встречаются очень редко. Считается, что L8 рано отделился от общего предка адаптированного к человеку комплекса M. tuberculosis [10]; L9 (также M. africanum) тесно связан с L6, но встречается только в восточной Африке.

Эпидемиологические исследования показывают, что линии 2 и 4 могут быть более вирулентными, чем линии 1 и 3 [7] а штаммы линии 2 обычно устойчивы к лекарственным средствам [11] Кроме того, линии 2 и 4 могут легко передаваться, хотя молекулярные основы до конца не ясны [4,7].

Чаще всего случаи заболевания туберкулезом связаны с заражением микобактериями вида Mycobacterium tuberculosis, молекулярным особенностям взаимодействия с противотуберкулезными препаратами которого в основном и посвящена данная статья.

Успешному лечению туберкулеза могут препятствовать популяции микобактерий, которые временно способны выдерживать давление антибиотиков при отсутствии мутаций, вызывающих лекарственную устойчивость. Это явление принято называть лекарственной толерантностью (ЛТ).

Основными ответными реакциями M. tuberculosis на лекарственное давление являются снижение темпов роста, метаболический сдвиг и стимулирование активности оттока/выброса лекарственного препарата из бактериальной клетки. Метаболические сдвиги в микобактериях при лекарственном стрессе в основном происходят в метаболизме липидов. Нарушается окислительно-восстановительный гомеостаз со сниженной активностью цикла трикарбоновых кислот в пользу анаболизма липидов. Повышенный анаболизм липидов играет роль в утолщении клеточной стенки, что снижает чувствительность к большинству противотуберкулезных препаратов. В дополнение к этим общим механизмам обнаруживают механизмы, специфичные для отдельных препаратов. Так, например, при воздействии изониазида M. tuberculosis перепрограммирует несколько путей, связанных с биосинтезом миколовой кислоты. При воздействии рифампицина M. tuberculosis усиливает экспрессию своего лекарственного белка-мишени rpoB. При воздействии бедаквилина стимулируется синтез АТФ и активируются факторы транскрипции Rv0324 и Rv0880 [12].

Под лекарственной устойчивостью (ЛУ) в настоящее время принято понимать природную или приобретенную способность микроорганизмов сохранять жизнедеятельность и размножаться при воздействии на него лекарственных препаратов. В основе ЛУ бактерий к антибактериальным препаратам лежат обнаруженные молекулярно-генетическими методами передаваемые по наследству изменения генетического аппарата микобактерий.

Механизмы развития лекарственной толерантности

Стандартное лечение лекарственно-чувствительного туберкулеза, как правило, представляет собой комбинацию от двух до четырех препаратов (изониазид [INH], рифампицин [RIF], этамбутол [EMB] и пиразинамид [PZA]) в течение 2 месяцев с последующим введением INH и RIF в течение 4 месяцев [13, 14]. Реакция на стандартный режим лечения отличается вариабельностью, даже среди пациентов с подтвержденным лекарственно-чувствительным туберкулезом. Важным показателем ответа на лечение является время до конверсии культуры, т. е. время от начала лечения до получения первой из двух последовательных отрицательных культур), которое варьируется у разных пациентов, с 95% доверительными интервалами от 41 до 83 дней [15, 16]. Кроме того, в то время как большинство пациентов излечиваются и остаются свободными от туберкулеза после завершения 6-месячного курса лечения, у некоторых пациентов наблюдают рецидив, даже если они полностью придерживались лечения. На сегодняшний день эта межпациентная вариабельность в ответ на лечение в основном объясняется различными характеристиками хозяина, таких как исходная микобактериальная нагрузка, наличие полостных поражений, ВИЧ-инфекция и курение [17,18]

В дополнение к этим факторам, гетерогенность популяций микобактерий может также способствовать развитию вариабельности в ответ на лечение. Некоторые исследования показали, что кривые уничтожения M. tuberculosis под давлением лекарств являются двухфазными и, возможно, даже многофазными [12] При этом, измерение времени между инокуляцией среды и обнаружением роста в серийных изолятах в модельных экспериментах показало, что в образце мокроты пациента присутствуют множественные бактериальные популяции с различной динамикой роста и различными показателями гибели. Таким образом, можно утверждать, что популяции микобактерий гетерогенны, причем у одного пациента присутствует более одного бактериального фенотипа [19,20].

Лекарственная толерантность (ЛТ), феномен, при котором возбудитель туберкулеза выдерживает лечение антибиотиками в течение длительного периода без изменений наследственного аппарата [21], является одним из проявлений этой гетерогенности в популяциях микобактерий. В то время как лекарственная толерантность широко изучалась у других видов бактерий, таких как золотистый стафилококк, Salmonella spp. и Escherichia coli, ей уделялось меньше внимания у микобактерий [22].

При туберкулезе исследования в основном были сосредоточены на персистирующих микобактериях, подмножестве лекарственно-толерантных микобактерий, которые возникают в изначально гетерогенных популяциях. Благодаря остановке роста эти персистенты выживают в условиях стресса окружающей среды, включая стресс, вызванный присутствием бактерицидных препаратов в концентрациях, которые в противном случае являются смертельными [21,23].

Способствует выживанию микобактерий в стрессовых условиях и возможность образования биопленок. Образование специфического микобактериального сообщества со своей внутренней системой сигнализации в виде агентов Такие микобактериальные белки, как Rv0081, RegX3, devR и MprA являются наиболее перспективными в изучении понимания роли биопленок в формировании феноменов лекарственной толерантности и лекарственной устойчивости возбудителя туберкулеза [24].

Лекарственная устойчивость как природная или приобретенная способность жизнедеятельности и размножению в присутствии лекарственного средства, чаще всего специфична для одного лекарственного средства или класса лекарств, передается по наследству и увеличивает MIC, минимальную концентрацию конкретного антибиотика, необходимую для предотвращения роста [21, 25] Напротив, лекарственная толерантность часто действует на разные классы лекарств, редко генетически кодируется и не влияет на MIC, но изменяет MDK 99, минимальную продолжительность лечения, которая убивает 99% популяции микобактерий [21, 25]. Таким образом, при воздействии бактерицидных препаратов толерантные микобактерии погибают с меньшей скоростью, чем полностью восприимчивая популяция, из которой они возникли [21].

В дополнение к персистенции, толерантности и лекарственной устойчивости, M. tuberculosis также может адаптироваться к стрессу, вызванному антибиотиками, используя стратегии “внутренней устойчивости”, в которых используются непостоянные механизмы, такие как утолщение клеточной стенки микобактерий, активация насосов оттока и измененная экспрессия регуляторов транскрипции. Например, длительное воздействие низких доз ПТП на микобактерии может активировать белок-переносчик, который затем сверхэкспрессируется и необратимо приводит к развитию фенотипической резистентности. Ферменты β-лактамазы, кодируемые бактерией, могут ингибировать β-лактамный антибиотик, что приводит к устойчивости к этим лекарствам [26]

Строго говоря, механизмы внутренней устойчивости может быть расценены и как имеющие отношение к природной лекарственной устойчивости. Не следует забывать, однако, что «внутренняя устойчивость» определенно отличается от ЛУ, вызванной строго определенными мутациями в генах, и поэтому, на наш взгляд, является видом ЛТ, определяющей «норму реакции» отдельного видового признака в условиях стрессового воздействия.

Изучение взаимосвязи и различий между ЛТ и ЛУ у возбудителя туберкулеза важно, поскольку это может позволить разработать новые стратегии сокращения сроков лечения, направленные на те популяции M. tuberculosis, которые стали толерантными и в противном случае временно пережили бы присутствие лекарств (табл.1). Вместе с тем, необходимо постоянно иметь в виду, что проявления ЛТ могут быть вполне обнаружены и в мутированном фенотипе микобактерий с обнаруженной ЛУ.

Таблица 1. Сравнительный анализ проявлений лекарственной толерантности и лекарственной устойчивости

Table 1. Comparative analysis of manifestations of drug tolerance and drug resistance

Критерии сравнения	Лекарственная толерантность	Лекарственная устойчивость
Увеличение MIC	-	+
Увеличение MDK 99	+	-
Замедление метаболизма	+	+
Метаболический сдвиг	+	+
Изменение работы эффлюкс насосов	+	+
Повышение анаболизма липидов, утолщение клеточной стенки	+	+
Образование биопленок	+	+
Мутации генетического аппарата микобактерий	-	+

 

Выживание микобактерий сильно зависит от их способности быстро реагировать на стрессы. Как правило, сразу несколько взаимосвязанных биологических путей участвуют в возникновении и установлении лекарственно-толерантного состояния в ответ на стресс, вызванный эффективным лекарственным средством [27, 28]. В то время как некоторые из этих механизмов являются общими, поскольку они неспецифичны и возникают при воздействии различных классов лекарств (общая толерантность), другие являются механизмами лекарственной толерантности и возникают только после воздействия одного конкретного препарата или класса лекарств (специфическая лекарственная толерантность).

Под давлением лекарств экспрессия сотен генов M. tuberculosis быстро меняется. Результирующая транскрипционная и посттранскрипционная регуляция генов приводит к толерантному фенотипу M. tuberculosis. Основные механизмы, придающие лекарственно-толерантный фенотип у микобактерий включают

• замедление метаболизма за счет снижения активности метаболических процессов и скорости роста, что является успешной стратегией, поскольку антибиотики обычно нацелены на активные клеточные процессы;
• метаболический сдвиг, который заключается в перенаправлении потоков метаболитов, при воздействии антибиотиков на определенные метаболические пути;
• утолщение клеточной стенки, которое снижает концентрацию препарата в микобактериальных клетках;
• усиление работы откачивающих насосов, что ускоряет выведение антибиотиков из микобактерии.

Отражают ли указанные изменения в регуляции генов развитие толерантного состояния M. tuberculosis в ответ на антибиотический стресс или это отбор ранее существовавшей лекарственно-толерантной субпопуляции микобактерий в ходе воздействии антибиотиков? А может быть, это комбинация двух этих двух путей развития толерантности? Эти вопросы еще требуют разрешения.

Общая толерантность

Транскрипционная и постранскрипционная регуляция генов

Процессы, которые управляют развитием клеток, приводящим к лекарственной толерантности, сложны и регулируются тесно взаимосвязанными метаболическими путями. На уровне транскрипции некоторые факторы транскрипции WhiB и сигма-факторы функционируют как регуляторы стресса. Посттранскрипционно системы токсин-антитоксин (ТА) и малые регуляторные РНК также координируют лекарственную толерантность [12].

У M. tuberculosis whiB3 и whiB7, два из семи идентифицированных whiB-подобных генов, были связаны с ЛТ [12]. Сигма-факторы также играют решающую роль в транскрипции прокариот посредством связывания РНК-полимеразы. Регуляторная сеть сигма-факторов сложна и включает в себя множество посттрансляционных модификаций, таких как фосфорилирование и ацетилирование с помощью протеинкиназ и анти-сигма-факторов. У M. tuberculosis идентифицировано 13 сигма-факторов [29]. Исследования показали, что SigA, SigB, SigE и SigF могут быть вовлечены в процессы адаптации возбудителя туберкулеза к антибиотик-индуцированному стрессу. При лекарственном давлении экспрессия SigB, -E, -F, -G, -H, -I и -J увеличивается, в то время как экспрессия SigA уменьшается [12, 30].

 Системы TA представляют собой двухкомпонентные системы, которые позволяют быстро адаптировать экспрессию генов у бактерий после воздействия стресса [31] Системы токсин-антитоксин включают токсин, который может вызывать остановку роста (или гибель клеток), и антитоксин, который нейтрализует токсин. При нормальных условиях токсин и антитоксин экспрессируются повсеместно, так что действие токсина нейтрализуется антитоксином. В условиях антибиотического стресса ингибирование роста может быть достигнуто путем индукции специфических протеаз, которые разлагают антитоксин, так что действие токсина больше не ограничено [12, 32]. У M. tuberculosis было идентифицировано 79 локусов TA; экспрессия различных систем TA, а также экспрессия протеаз изменяются при приеме антибиотиков и увеличиваются при длительном воздействии лекарств. В то время как некоторые токсины (например, семейство mazF, Rv1577c, Rv2651c и Rv0366c) обеспечивают лекарственную толерантность к различным классам лекарств, другие токсины (например, RelE) вызывают лекарственно-специфическую толерантность к антибиотикам [12, 33].

Регуляция ЛТ малыми регуляторными РНК у M. tuberculosis изучена не полно [34], хотя для других бактерий было получено достаточно данных о том, что такие РНК были вовлечены в регуляцию ответов на антибиотики путем корректировки экспрессии генов, связанных с внутриклеточными насосами, ферментами, транспортными белками, синтезом клеточной стенки и мембранными белками

Снижение метаболической активности

Поскольку большинство антибиотиков нацелены на метаболически активную микобактерию, пониженная метаболическая активность как результат введения лекарств может успешно вызывать состояние лекарственной толерантности [35]. Например, наблюдение, что RIF убивает значительно больше микобактерий в логарифмической фазе, чем в стационарной фазе, показывает, что замедление метаболизма за счет снижения репликации является успешной стратегией для создания толерантности к RIF [12].

У M. tuberculosis гены, участвующие в цикле Кребса, аэробном дыхании и синтезе АТФ, подвергаются понижающей регуляции при добавлении противотуберкулезных препаратов [28]. Кроме того, снижаются синтез мРНК и синтез белка, о чем свидетельствует пониженная экспрессия генов, участвующих в транскрипции (tuf, gyrA и gyrB) и основных компонентов трансляции (включая 16S РНК и гены, кодирующие рибосомные белки) [28].

Метаболический сдвиг

Установлено, что перенаправление обменного потока органических соединений с путей, генерирующих энергию, на пути накопления энергии было связано с остановкой роста и снижением восприимчивости к лекарствам у M. tuberculosis. Хотя большинство выводов о метаболическом сдвиге основаны на исследованиях экспрессии генов, в нескольких исследованиях были обнаружены изменения, соответствующие метаболическому сдвигу липидного обмена и окислительно-восстановительного гомеостаза в ответ на воздействие лекарственных средств. M. tuberculosis может переключаться от цикла трикарбоновых кислот на накопление углерода в жирных кислотах (FAs) через синтез триацилглицерола (TAG) посредством усиления регуляции tgs1 (ген, кодирующий триацилглицеринсинтазу) [12].

При замедлении цикла трикарбоновых кислот замедляется, снижается оборот альфа-кетоглутарата, оксалоацетата и богатых энергией восстановителей, таких как NADH, что приводит к снижению синтеза аминокислот, трансляции белка и метаболизма в целом. Кроме того, обнаружено, что гены, кодирующие ферменты, которые катализируют глиоксилатный обходной путь, такие как изоцитратлиазы, активируются под давлением RIF, что, как показано, приводит к перекрестной толерантности к INH, RIF и стрептомицину [12].

Утолщение клеточной стенки микобактерий

Толстый и вязкий билипидный слой клеточной стенки замедляет поглощение липофильных лекарственных средств и уменьшает проникновение гидрофильных лекарственных средств через микобактериальные порины. Снижение поглощения липофильных препаратов после утолщения клеточной стенки опосредованно подтверждается наблюдением повышенного поглощения и притока липофильных препаратов (RIF) у мутантов с дефицитом миколата M. smegmatis, у которых были дефекты в ключевых генах синтеза клеточной стенки [12]

Поскольку утолщение клеточной стенки происходит только в условиях анаэробного или микроаэробного стресса, утолщение клеточной стенки M. tuberculosis, скорее всего, действует как стратегия, дополняющая метаболический сдвиг от аэробных энергетических путей (таких как аэробное дыхание и синтез АТФ) к анаэробному дыханию [28]. Аналогичным образом, адаптация липидного обмена M. tuberculosis и измененный окислительно-восстановительный гомеостаз при лекарственном давлении могут влиять на проницаемость клеточной стенки и способствовать лекарственно-толерантному состоянию [12].

Усиление регуляции откачивающих насосов

Эффлюксные (откачивающие) насосы представляют собой белковые каналы-переносчики, которые перекачивают различные соединения, включая антибиотики, из клетки. Обнаружены специфические мутации в генах, ассоциированных с насосами, которые связаны с ЛУ к некоторым противотуберкулезным препаратам. Между тем, повышающая регуляция экспрессии эффлюксной помпы может рассматриваться как адаптивный механизм ЛТ, который может быть активирован под действием лекарственных препаратов у генетически восприимчивых штаммов M. tuberculosis. При этом следует отметить, что экспрессия эффлюксной помпы зависит от условий, обратима и преходяща [35].

Подобно тому, как специфическая мутация для одного лекарственного средства может вызвать “перекрестную резистентность” к другому лекарственному средству, широкий целевой диапазон эффлюксных насосов может привести к снижению чувствительности M. tuberculosis к нескольким противотуберкулезным препаратам [12, 28, 36].

 

Генетические варианты, способствующие развитию толерантности

Несмотря на то, что толерантность является обратимым фенотипическим состоянием M. tuberculosis, недавние данные свидетельствуют о том, что наличие специфических генетических вариантов может увеличить склонность M. tuberculosis к переходу в состояние лекарственной толерантности при стрессе от антибиотиков. Например, наличие мутаций в гене prpR, который регулирует катаболизм пропионата, обеспечивало лекарственную толерантность, когда M. tuberculosis подвергался воздействию RIF, INH и офлоксацина [37]. Другим примером являются “высокоперсистентные” (hip) мутанты генов, связанных с путями биосинтеза липидов и метаболизмом трикарбоновых кислом, которые были выделены под давлением RIF и стрептомицина [38].

Механизмы специфической лекарственной толерантности

Изониазид

При отсутствии толерантности INH ингибирует синтез миколевой кислоты, что приводит к недостаточной выработке миколевой кислоты для роста. При воздействии INH M. tuberculosis использует несколько механизмов толерантности для преодоления ингибирования синтеза миколевой кислоты, вызванного INH:

• синтезированные de novo жирные кислоты и деградированные триглицериды стимулируют синтез миколевой кислоты, действуя как источник предшественников миколевой кислоты;
• активация генов, участвующих в синтезе миколевой кислоты (cmaA2, cmrA, mmaA2, mmaA3, mmaA4, umaA1 и fbpC);
• угнетение цикла трикарбоновых кислот приводит к замедлению метаболизма из-за снижения синтеза АТФ и белка;
• снижение потребности в миколевых кислотах при замедления процессов роста обеспечивает достаточный уровень продукции миколевой кислоты;
• tuberculosis снижает экспрессию NADH-дегидрогеназы, что также приводит к замедлению метаболизма [12].

Рифампицин

Рифампицин (RIF) ингибирует транскрипцию РНК путем связывания с субъединицей РНК-полимеразы B. Мутации в гене rpoB, кодирующем РНК-полимеразу B, которые приводят к снижению аффинности связывания RIF, были широко изучены в отношении приобретения устойчивости к RIF [39]. Между тем, показано, что у M. tuberculosis может развиться толерантность к воздействию RIF из-за нарушения трансляции rpoB, активации rpoB, повышения активности эффлюкс-насосов и метаболических сдвигов [28, 40, 41, 42]

Доказано, что нарушение трансляции является исключительно фенотипическим явлением [42] В нормальных условиях экспрессия rpoB с промотора I ингибирует экспрессию rpoB с промотора II. При воздействии RIF ингибирование РНК-полимеразы снижает транскрипцию с промотора I, что приводит к снижению ингибирования промотора II и общему увеличению транскрипции rpoB. Интересно, что этот механизм наблюдается только тогда, когда M. tuberculosis подвергается воздействию низких концентраций RIF, поскольку воздействие высоких концентраций RIF приводит к одновременному ингибированию активности РНК-полимеразы как на промоторах I, так и на II [41]

В дополнение к сверхэкспрессии лекарственной мишени замедление метаболизма за счет снижения репликации может привести к толерантности к RIF, поскольку, как уже было сказано ранее, RIF убивает значительно больше микобактерий M. tuberculosis в log-фазе, чем в стационарной фазе [12]

Этамбутол

Этамбутол (EMB) проявляет свою бактериостатическую активность, ингибируя выработку арабиногалактана, компонента клеточной стенки микобактерий       [43]. EMB может действовать в синергизме с INH, воздействуя на путь биосинтеза миколовой кислоты посредством подавления inhA. Таким образом, механизмы толерантности M. tuberculosis, задействованные в случае с INH, могут генерировать перекрестную толерантность к EMB [44]. Несмотря на недостаток данных по исследованию толерантности к EMB, показано, что EMB обладает высокой бактерицидной активностью в том случае, если в микобактерии отсутствует сигма-фактор SigB или SigE, что позволяет предположить, что сигма-факторы SigB и SigE могут вызывать толерантность при воздействии EMB [45].

Пиразинамид

Пиразинамид (PZA) представляет собой пролекарство, которое преобразуется амидазой, кодируемой геном pncA (Rv2043c), в активное соединение пиразиноевую кислоту (POA), которая влияет на активность важнейших клеточных ферментов и выработку энергии путем закисления цитоплазмы и дестабилизации протонной движущей силы PMF. PMF является движущей силой синтеза АТФ. Когда протоны проходят через канал в ферменте, движение вращает белок, подобно тому, как ветер приводит в движение турбину. Механическое движение этого ротора обеспечивает энергию для добавления неорганической фосфатной группы к аденозиндифосфату (АДФ) с образованием АТФ. Было показано, что, хотя PZA обладает ограниченной бактерицидной активностью в отношении активно растущих бактерий, PZA эффективен против статического и метаболически замедленного микобактерий, которые остаются под давлением INH и RIF, снижая таким образом проявления ЛТ [12].

Улучшенная бактерицидная активность PZA в условиях снижения энергетического метаболизма может также объяснить сильный синергизм между PZA и бедаквилином (BDQ), важным противотуберкулезным препаратом, ингибирующим синтез АТФ, на мышиных моделях и в клинических испытаниях [46].

Этионамид

Следствием стресса, вызванного этионамидом (ETH) у M. tuberculosis, является транскрипционный ответ, подобный тому, который наблюдается при стрессе INH, что неудивительно, т.к. оба препарата нацелены на синтез миколовой кислоты. Из 70 генов, дифференциально экспрессирующихся при стрессе, вызванном ETH, 39 генов вели себя аналогично при стрессе INH. Тем не менее, микобактерии, которые не могут превращать пролекарство INH и, следовательно, не развивают стрессовую реакцию при воздействии INH, все же развивают стрессовую реакцию при воздействии ETH [12]

Аминогликозиды

Аминогликозиды (AG) ингибируют синтез белка путем связывания рРНК. Под влиянием AG сверхэкспрессия whiB7 влияет на гены, участвующие в оттоке лекарств (tap) и защите рибосом (включая eis), снижая чувствительность ко всем AG, используемым для лечения туберкулеза (амикацин, канамицин, капреомицин и стрептомицин) [12]. В отличие от необратимых мутаций в промоторных областях eis, которые придают ЛУ к капреомицину, канамицину и амикацину, сверхэкспрессия whiB7 и активация eis могут вызывать временное состояние пониженной чувствительности к AG [12]

Бедаквилин

При воздействии бедаквилина (BDQ), который ингибирует АТФ-синтазу, M. tuberculosis быстро адаптирует свой метаболизм. Низкая бактерицидная активность BDQ в течение первых дней после воздействия BDQ, вероятно, отражает развитие процессов, связанных с ингибированием АТФ, что дополнительно усугубляется стрессовой реакцией, вызванной BDQ, которая вызывает метаболический сдвиг и замедление метаболизма [30, 47, 48] Возможно также стимулирование синтеза АТФ для преодоления дефицита АТФ, вызванного BDQ. Этот процесс может быть реализован либо непосредственно через сверхэкспрессию генов, кодирующих субъединицы механизма АТФ-синтазы, либо косвенно путем стимуляции окислительного фосфорилирования. Последнее может быть выполнено путем увеличения синтеза компонентов, используемых при окислительном фосфорилировании (например, цитохромов), и/или путем стимуляции метаболизма трегалозы и активности цикла Кребса для увеличения выработки богатых энергией метаболитов, которые стимулируют окислительное фосфорилирование и генерируют протонную движущую силу, необходимую для синтеза АТФ. Из 10 известных универсальных стрессовых белков у M. tuberculosis 7 активируются при воздействии BDQ.

Кроме того, сверхэкспрессия нескольких факторов транскрипции (включая SigG, Rv0324 и Rv0880) генерирует толерантность к BDQ, индуцируя реакцию BDQ на стресс [30, 48]. Из них Rv0324 также сверхэкспрессируется при воздействии капреомицина и моксифлоксацина, что указывает на потенциальный антагонизм. Интересно, что экспрессия Rv0880 снижается при воздействии претоманида (PTM), что указывает на синергизм между претоманидом и BDQ [48].

Наконец, экспрессия эффлюксной помпы при воздействии BDQ может способствовать развитию переходного состояния толерантности к BDQ. Это неудивительно, учитывая, что мутации в Rv0678, репрессоре транскрипции генов MmpS5-MmpL5, кодирующих эффлюксную помпу, придают устойчивость к BDQ и перекрестную устойчивость к клофазимину. Наблюдение за тем, что ингибиторы эффлюксной помпы верапамил и резерпин повышают активность BDQ у дикого типа H37Rv M. tuberculosis, предполагает, что активность эффлюксной помпы обеспечивает базовый уровень внутренней устойчивости к BDQ у M. tuberculosis [12]. В итоге можно предположить, что индуцируемая BDQ сверхэкспрессия активности эффлюксной помпы может привести к толерантности к BDQ.

Таким образом, лекарственная толерантность, временное и обратимое фенотипическое состояние бактерий M. tuberculosis, которое развивается в ответ на стресс (в том числе и лекарственный), является результатом адаптивных механизмов, которые позволяют M. tuberculosis выживать в течение более длительного периода в стрессовых условиях. Основными общими механизмами, которые микобактерии используют для приобретения временного лекарственно-толерантного состояния, являются замедление их метаболизма, перестройка основных метаболических путей для обхода эффектов лекарств, усиление работы эффлюксных насосов и реструктуризация клеточной стенки. Эти механизмы взаимосвязаны посредством сдвига центральных путей углеводного обмена, метаболизма липидов и окислительно-восстановительного гомеостаза с помощью транскрипционных и посттранскрипционных регуляторов, таких как сигма-факторы, WhiB-регулоны и системы токсин-антитоксин.

Клинико-эпидемиологическое значение феномена лекарственной толерантности

В настоящее время были сделаны важные наблюдения, которые подчеркивают клиническую значимость и потенциальное применение улучшенного понимания толерантности.

• Во-первых, получены подтверждения того положения, что наличие толерантности может увеличить риск развития резистентности. Это было продемонстрировано в (in vitro и in vivo) экспериментальных эволюционных исследованиях E. coli и золотистого стафилококка [49, 50]. У M. tuberculosis наблюдается увеличение толщины клеточной стенки от панчувствительной к МЛУ и ШЛУ. Можно предполагать, что временная лекарственная толерантность M. tuberculosis может предшествовать устойчивой лекарственной устойчивости. Утолщение клеточной стенки приводит к появлению фенотипически устойчивых микобактерий, которые способны дольше выживать в присутствии противотуберкулезных препаратов. В условиях, когда M. tuberculosis в течение длительного времени подвергается воздействию мутагенной среды, создаются предпосылки к приобретению лекарственной устойчивости [12]. Гипотеза о толерантности, предшествующей лекарственной устойчивости, дополнительно подтверждается наблюдением сдвига трегалозы в клинических изолятах с ШЛУ по сравнению с чувствительными изолятами и обнаружением того факта, что, у устойчивых штаммов накопление мутаций prpR по сравнению с чувствительными штаммами [37, 51].
• Во-вторых, открытие того, что добавление к схемам, содержащим INH, препаратов, нацеленных на окислительно-восстановительный метаболизм (таких как противомалярийный препарат хлорохин), стимулирует гибель микобактерий, толерантных к INH, и снижает частоту рецидивов, подчеркивает возможность изучения повторного назначения существующих лекарств для оптимизации лечения туберкулеза за счет снижения развития толерантности [52]
• В-третьих, вывод о том, что доля толерантных бактерий, индуцированных RIF, обратно пропорциональна используемой дозе RIF, поддерживает использование схем лечения высокими дозами RIF, поскольку это может снизить развитие толерантности к RIF [41, ]
• В-четвертых, PZA выделяется как дополнительный и синергический сопутствующий препарат в различных схемах лечения [46, ] Понимание того, как PZA воздействует на толерантные бактериальные популяции, будет иметь большое значение для разработки лекарств, которые воздействуют на толерантные M. tuberculosis [53].

Наконец, представляет интерес наблюдение о том, что развитие толерантности к BDQ может быть подавлено введением BDQ в комбинации с PTM, особенно с учетом недавно предложенного режима Nix-TB (PTM плюс BDQ и линезолид) для лечения штаммов, трудно поддающихся лечению МЛУ и ШЛУ [54].

Таким образом, лучшее понимание механизмов толерантности, используемых M. tuberculosis под давлением лекарств, может привести к выявлению новых или перепрофилированных лекарств, которые позволяют разработать разумную схему лечения, чтобы избежать толерантности к основным препаратам, используемым при лечении туберкулеза. Предотвращение развития лекарственной толерантности может дополнить современные подходы к сокращению сроков лечения, поскольку предотвращение приобретения толерантности может сократить продолжительность инфекционности, снизить частоту рецидивов и снизить риск развития лекарственной устойчивости. Уже идентифицирован ряд интересных генов и гипотетических белков [55] и будущие исследования могут привести к выявлению дополнительных новых агентов.

Совместное лечение ингибиторами микобактериальной помпы оттока (такими как верапамил) может ограничить внутреннюю резистентность, индуцируемую помпами оттока [40, 56,), и препараты, которые нацелены на сигма-факторы, также могут представлять интерес для оптимизации лечения туберкулеза [12]

Развитие лекарственной устойчивости микобактерий

Благодаря возможности развития с определенной частотой хромосомных мутаций в геноме M. tuberculosis, в основном из-за появления однонуклеотидных полиморфизмов, возникают штаммы, обладающие природной или вызванной антропогенным фактором сопротивляемостью (устойчивостью) к лекарственным средствам [57]

Существует несколько подходов к определению типов лекарственной устойчивости микобактерии туберкулеза [58], например, по чувствительности к противотуберкулезным препаратам:

• Истинная генетическая устойчивость – это видовой признак микроорганизмов, который связан с отсутствием точки приложения антибиотика в M. tuberculosis, ее недоступностью из-за плохой проницаемости клеточной стенки или разрушения ферментами. Известно, что M. tuberculosis обладают истинной генетической устойчивостью ко многим неспецифическим антимикробным препаратам, относящимся к семействам пенициллинов, β-лактамов, макролидов, карбапенемов, цефалоспоринов, тетрациклинов.
• Приобретенная лекарственная устойчивость МБТ проявляется в возможности размножаться при воздействии на них противотуберкулезных препаратов ввиду развития точечных мутаций в определенных генах. Приобретенную лекарственную устойчивость подразделяют на первичную и вторичную. Первичная ЛУ определяется у больных, заразившихся лекарственно-устойчивыми микобактериями. Эти пациенты ранее не принимали противотуберкулезные препараты. Вторичная ЛУ развивается в процессе самого лечения больного туберкулезом. Устойчивость МБТ развивается через 3-6 месяцев с начала лечения [58].
• Ложная резистентность определяет случаи, в которых одни микобактерии были устойчивы к одним препаратам, другие – к другим. Так называемая «скрытая» устойчивость отражает представление о том, что при микробиологическое исследование каверн возможно обнаружение лекарственно-устойчивых микобактерий у пациентов с лекарственно-чувствительным туберкулезом [59].

Можно разделить ЛУ микобактерии по спонтанности возникновения мутаций (спонтанные и индуцированные). По мнению экспертов, в активно размножающейся микобактериальной популяции всегда имеется небольшое количество лекарственно-устойчивых спонтанных мутантов. Спонтанные мутации при этом устойчивы только к одному препарату (спонтанная или эндогенная ЛУ) [58].

При экзогенной (индуцированной) ЛУ происходит естественный отбор в пользу мутантов с естественной ЛУ к противотуберкулезным препаратам. В дальнейшем это приводит к изменению в геноме, что приводит к увеличению бактериальной популяции с лекарственно-устойчивыми микобактериями. Этому способствует проведение неадекватной химиотерапии, при этом пациенту назначается неправильный режим, несбалансированное сочетание и дозы противотуберкулезных лекарственных средств [58].

Для микобактерий МБТК, согласно Клиническим Рекомендациям 2022г., выделяют [14]

• Монорезистентность – это устойчивость микобактерии туберкулеза только к одному противотуберкулезному препарату;
• Полирезистентность – это устойчивость микобактерии туберкулеза к двум и более противотуберкулезным препаратам кроме одновременной устойчивости к изониазиду и рифампицину;
• Устойчивость к изониазиду – это лекарственная устойчивость микобактерии туберкулеза к изониазиду независимо от лекарственной устойчивости к другим противотуберкулезным препаратам, определенная любым методом определения лекарственной чувствительности;
• Устойчивость к рифампицину – это лекарственная устойчивость микобактерии туберкулеза к рифампицину независимо от лекарственной устойчивости к другим противотуберкулезным препаратам, определенная любым методом определения лекарственной чувствительности;
• Множественную лекарственную устойчивость (МЛУ) – это устойчивость микобактерии туберкулеза одновременно к изониазиду и рифампицину независимо от наличия устойчивости к другим противотуберкулезным препаратам;
• Пре-широкая лекарственная устойчивость (пре-ШЛУ) – это устойчивость микобактерии туберкулеза к рифампицину с устойчивостью к изониазиду или без нее, в сочетании с устойчивостью к любому фторхинолону;
• Широкая лекарственная устойчивость (ШЛУ) – это устойчивость микобактерии туберкулеза к рифампицину с устойчивостью к изониазиду или без нее, в сочетании с устойчивостью к любому фторхинолону и, по крайней мере, к линезолиду или бедаквилину.

 

 

 Предпосылки развития лекарственной устойчивости

В последнее время исследователей интересуют вопросы о возможном существовании геномных признаков предлекарственной устойчивости у микобактерий туберкулеза. Другими словами, существуют ли такие особенности генома микобактерий, при определении которых можно предсказать развитие ЛУ у конкретной линии микобактерий.

Было показано, что на генном уровне большинство несинонимичных мутаций (приводящих к аминокислотным заменам в конечном белковом продукте), связанных с генотипами предрезистентности, локализованы в генах, связанных с процессами образования клеточной стенки и метаболизмом. Для подтверждения их связи с приобретением лекарственной устойчивости в будущем необходимы функциональные исследования и проспективные клинические испытания [60].

Идентификация и контроль монорезистентных штаммов является ключевым компонентом усилий по профилактике и борьбе с инфекцией туберкулеза в общественном здравоохранении. Монорезистентность связана с повышенной вероятностью прогрессирования до множественной лекарственной устойчивости. На популяционном уровне было показано, что монорезистентные к изониазиду штаммы имеют по меньшей мере в 15 раз больший риск развития множественной лекарственной устойчивости по сравнению с чувствительными к дикому типу штаммами. Неадекватная диагностика монорезистентности к изониазиду неизбежно приведет к неправильному лечению и может способствовать быстрому развитию множественной лекарственной устойчивости, что представляет значительную угрозу для борьбы с туберкулезом [60].

В результате геномного анализа 51 229 клинических изолятов Mycobacterium tuberculosis исследователями из США было показано, что регулятор транскрипции Rv1830 (resR) используется в качестве частой мишени положительного (адаптивного) отбора. Мутанты resR не проявляют канонической лекарственной устойчивости или лекарственной толерантности, но при этом сокращают постантибиотиковый эффект, т.е. позволяют микобактериям возобновлять рост после воздействия препарата значительно быстрее, чем у штаммов дикого типа. Авторы работы назвали обнаруженный фенотип фенотипом устойчивости к антибиотикам antibiotic resilience, в смысле повышенной жизнеспособности микобактерий изолята, в противовес термину resistence, имеющему в английском значении оттенок сопротивления. ResR действует в регуляторном каскаде с другими факторами транскрипции, контролирующими рост и деление клеток, которые подвергаются положительному отбору в клинических изолятах Mycobacterium tuberculosis [61].

Механизмы развития лекарственной устойчивости

ЛУ противотуберкулезных препаратов может реализовываться в бактериальной клетке по следующим основным универсальным механизмам [62]

1. Снижение проницаемости клеточной стенки бактерии для препарата;
2. Ферментативная инактивация препарата;
3. Инактивация фермента, приводящего антибиотик в активную форму;
4. Модификация мишени препарата;
5. Повышение экспрессии белка-мишени противотуберкулезного препарата;
6. Ускоренное выведение препарата из клетки.

Вышеназваные механизмы могут проявляться в качестве природных свойств бактериальной клетки, а могут быть экзогенно индуцированы специфическим воздействием противотуберкулезных препаратов.

В любом случае, в отличие от лекарственной толерантности, лекарственная устойчивость бактерий всегда подразумевает изменение наследственного аппарата микобактерий в сторону образования устойчивых мутаций в определенных генах

 

Специфическая лекарственная устойчивость микобактерий

Первый противотуберкулёзный препарат, стрептомицин, был открыт в 1943 году. Он относится к группе аминогликозидов. Стрептомицин оказывает бактерицидный эффект - связывается с 30S-субъединицей рибосомы, препятствует её связыванию с мРНК, нарушает тем самым синтез белка [63]. Устойчивость к стрептомицину связывают с мутациями в генах rpsL и rrs. Ген rpsL кодирует рибосомальный белок S12, а ген rrs – 16S рРНК. Мутации в этих генах нарушают структуру транскрипта и не позволяют стрептомицину связываться со своей мишенью [57]. Стрептомицин обладает выраженной нефро- и ототоксичностью [64, 65]. Уже в 50-х годах было отмечено снижение его клинической эффективности за счет развития ЛУ. Однако его продолжают использовать в качестве препарата первого ряда в схемах терапии ЛЧ-ТБ [14]. Другие аминогликозиды, открытые позже (канамицин, амикацин) включены в список препаратов второго ряда. Принцип их действия тот же, что и у стрептомицина. Устойчивость к канамицину и амикацину так же, как и к стрептомицину, связана с мутациями в гене rrs. Так же на устойчивость к ним влияют мутации в гене tylA, которые изменяют метилирование 16S и 23S рРНК [57].

В 1950-ых годах были введены в практику новые ПТП – изониазид и парааминосалициловая кислота (ПАСК) [66]. Изониазид подавляет синтез миколовых кислот, чем оказывает бактерицидный эффект на делящиеся клетки и бактериостатический – на покоящиеся [63]. Резистентность МТБ к изониазиду связана с мутациями в генах inhA и katG. InhA кодирует эноил-несущий белок, участвующий в синтезе миколовых кислот и являющийся мишенью препарата. KatG – ген, кодирующий каталазу-пероксидазу, которая участвует в переходе изониазида в активную форму [57]. Нарушения структуры и функции этих белков блокируют работу препарата. Отмечены нейро- и гепатотоксическое действие изониазида [64]. На сегодняшний день изониазид, наряду с рифампицином, является одним из ключевых препаратов для лечения ЛЧ-ТБ.

С механизмом действия изониазида схожи механизмы действия этионамида и протионамида. Отличие в том, что для активации им необходима монооксигеназа, которую кодирует ген ethA. Мутации в этом гене, приводящие к нарушению функции белка, связаны с устойчивостью к этионамиду и протионамиду, как и мутации в гене inhA [57]..

ПАСК нарушает метаболизм фолиевой кислоты и обмен железа (Фисенко, 2006), что оказывает бактериостатический эффект. Вызывает наибольшее количество нежелательных явлений, поэтому назначается редко [14]. Сегодня ПАСК считается препаратом второго ряда, используется в схемах терапии ЛУ-ТБ. Устойчивость к ПАСК связана с мутациями в генах thyA (кодирует тимидилатсинтазу), folC (кодирует фолиполиглутаматсинтазу) и dfrA (кодирует дигидрофолатредуктазу) [57]. Дигидрофолатредуктаза необходима для активации ПАСК, а тимидилсинтаза и фолиполиглутаматсинтаза участвуют в метаболизме фолатов.

С 1952 года в терапии туберкулеза используется аналог никотинамида - пиразинамид [62]. Механизм его действия связан с изменением pH цитоплазмы, что приводит к ингибированию работы целого ряда ферментов [67]. Обладает гепато- и нефротоксичностью. Включен в клинические рекомендации 2022 года в качестве ПТП первого ряда. Устойчивость к пиразинамиду связана с мутациями в гене pncA, кодирующием никотинамидазу [67], необходимую для перехода препарата в активную форму.

В конце 60-ых годов были разработаны рифампицин и этамбутол [68]. Рифампицин принадлежит к группе антибиотиков-рифамицинов. Он ингибирует ДНК-зависимую РНК-полимеразу, что приводит к угнетению синтеза РНК и последующей гибели клетки [63]. Он эффективен против внутри- и внеклеточно расположенных МБТ. Устойчивость МТБ к рифампицину связана с мутациями в RRDR-области гена rpoB, кодирующего РНК-полимеразу [57]. Мутации, приводящие к изменению структуры этого белка, не позволяют рифампицину связаться с мишенью. Отмечено гепато – и нефротоксическое действие препарата [65]. Использование рифампицина ограничено распространением ЛУ-ТБ [2]. В актуальных клинических рекомендациях рифамицины включены в список ПТП первого ряда.

Этамбутол нарушает синтез полисахаридных компонентов клеточной стенки МБТ, чем оказывает бактериостатическое действие [63]. Обладает нейротоксичностью, вызывает диспептические явления. Рекомендован для использования в терапии лекарственно-чувствительного туберкулёза в качестве препарата первого ряда. ЛУ M. tuberculosis к этамбутолу связана с мутациями в генах embB и ubiA, кодирующих ферменты, задействованные в биосинтезе арабиногалактана и являющиеся мишенями препарата [57]

В 80-ых годах была обоснована необходимость полихимиотерапии с одновременным приёмом как минимум 3 препаратов с различными механизмами действия для снижения риска развития ЛУ [69].

С 90-ых годов в качестве ПТП начинают использовать фторхинолоны (Старшинова, 2014). Препараты этой группы связываются с ДНК-гиразой, чем блокируют её активность и, следовательно, угнетают синтез ДНК [63], чем оказывают бактерицидный эффект. Устойчивость МТБ к фторхинолонам связана с мутациями в области QRDR гена gyrA, кодирующего ДНК-гиразу [57]. Изменения в структуре этого белка блокируют взаимодействие с фторхинолонами. Препараты этой группы обладают нейротоксичностью [64] могут вызывать аллергические реакции. Наряду с бедкавилином и линезолидом считаются приоритетными препаратами для включения в схемы лечения ЛУ-ТБ.

Также приоритетными препаратами второго ряда в Клинических рекомендациях 2022 года названы циклосерин и его производное теризидон. Они блокируют синтез пептидогликана, входящего в состав клеточной стенки, за счёт чего достигается бактерицидный эффект [63]. Циклосерин является нейротоксичным [64] теризидон переносится лучше [14]. Устойчивость к циклосерину, вероятно, связана с мутациями в гене ald, кодирующем L-аланиндигидрогеназу. Этот фермент участвует в синтезе пептидогликана [70].

Препараты группы карбапенемов (меропенем, имипенем) рекомендованы для включения в схемы терапии ЛУ-ТБ [14]. Карбапенемы, как и циклосерин, нарушают синтез пептидогликана [31]. Устойчивость к карбапенемам связана с активностью микобактериальных бета-лактамаз класса А и С. Их активность может быть заблокирована препаратом клавуланат, что делает МБТ чувствительными к карбапенемам, а клавуланат – необходимой частью схемы терапии [71].

В 2012 году в России был зарегистрирован перхлозон (тиоуреидоиминометилпиридиния перхлорат) [66]. Препарат обладает бактериостатической активностью за счёт нарушения синтеза компонентов клеточной стенки, включён в список ПТП второго ряда [14]. Устойчивость МБТ к перхлозону, как и устойчивость к этионамиду и протионамиду, может быть связана с мутациями в гене ethA, кодирующем монооксигеназу, необходимую для активации пролекарства [72].

 

Широкая лекарственная устойчивость, характеристика препаратов и мутации.

 

Бедаквилин относится к диарилхинолинам. Он специфически ингибирует протонную помпу АТФ-синтазы, что приводит к угнетению синтеза АТФ и гибели клетки. В 2012 году бедаквилин получил одобрение FDA [73]. В настоящий момент бедаквилин входит в рекомендованную ВОЗ схему терапии МЛУ-ТБ. В России бедаквилин применяют с 2014 года [14], в 2022 году включен в клинические рекомендации по лечению туберкулеза.

Уже в 2014 году было получено первое сообщение о случае бедаквилин-устойчивого туберкулёза [73]. На сегодняшний день бедаквилин-устойчивые микобактерии туберкулеза наиболее широко распространёны в Индии, Пакистане, России, Китае и странах Южной Африки [2]

Устойчивость МТБ к бедаквилину связана, как правило, с мутациями в генах atpE либо mmpR5 [74, 75]. Первый кодирует белок АФТ-синтазу, мишень препарата. Мутации в этом гене приводят к изменению конформации АТФ-синтазы и, как следствие, препятствуют взаимодействию с бедаквилином.

Второй ген, mmpR5, кодирует репрессор эффлюксной помпы. Мутации в этом гене приводят к утрате репрессором своей функции, и, следовательно к росту активности помпы и неспецифическому удалению бедаквилина из клетки.

На территории России ШЛУ чаще связывают с мутациями в гене mmpR5 [76, 77].

Линезолид – антибиотик класса оксазолидинонов. Он препятствует образованию 70S-инициирующего комплекса и приводит к остановке трансляции и, как следствие, синтеза белка. Препарат эффективен не только против МТБ, но и против ряда других бактериальных инфекций.

Линезолид был одобрен FDA в 2000 году для лечения инфекций, вызванных стафилококками, стрептококками и энтерококками, включая лекарственно-устойчивые [78]. В терапии МЛУ-ТБ его начали применять в Европе в 2005 году [79], в России – в 2011 [80]. Сейчас линезолид входит в рекомендованную ВОЗ схему терапии МЛУ-ТБ. В российские клинические рекомендации линезолид был включен в 2022 году.

Первое сообщение о линезолид-устойчивом туберкулезе относится к 2007 году [81]. Большая часть случаев выявления линезолид-устойчивого туберкулеза приходится на Индию, Пакистан, Россию, Китай и страны Южной Африки [2].

Устойчивость МТБ к линезолиду связана с мутациями в гене rplC, кодирующем 50S рибосомальный белок L5 [38]. Мутации в этом гене ведут к изменению структуры белка и, как следствие, препятствуют связыванию с линезолидом.

Деламанид, препарат из группы дигидронитроимидазолов, применяется с 2015 года [82]. Он ингибирует синтез миколовых кислот, что обуславливает его бактерицидное действие. Деламаниду требуется активация нитроредуктазой, соответственно, мутации в генах, кодирующих этот фермент и его регуляторы (ddn, fgd1, fbiA, fbiB, fbiC, fbiD), связаны с устойчивостью МБТ к деламаниду. Активен против вне- и внутриклеточных МБТ [14]. Отнесён к ПТП второго ряда.

Клофазимин известен с 50-ых годов. В прошлом его применяли для лечения лепры. Механизм действия связан с игнибированием транспорта ионов в дыхательной цепи [83]. Устойчивость МБТ к клофазимину связана с мутациями в гене mmpR5, который кодирует репрессор эффлюксной помпы. Мутации в этом гене приводят к утрате репрессором своей функции, следовательно - росту активности помпы и неспецифическому удалению препарата из клетки. ВОЗ рекомендует включать клофазимин в терапию ЛУ-ТБ [84].

Клинико-эпидемиологическое значение феномена лекарственной устойчивости

К настоящему времени учитывая данные многочисленных клинических наблюдений становится понятно, что в составе одного изолята, выделенного из мокроты туберкулезного больного можно получить в итоге несколько отдельных изолятов, обладающих своими и часто не полностью перекрывающимися бактериологическими характеристиками. Фетотипически данные микобактерии могут демонстрировать как отсутствие ЛУ к ПТП, так и ее возможное наличие [38].

Кроме того, следует учитывать возможное наличие феномена лекарственной толерантности (ЛТ), при котором M. tuberculosis выдерживает лечение антибиотиками в течение длительного периода без изменений наследственного аппарата [21].

Молекулярно-биологическая характеристика полученных изолятов, между тем, может выявить некоторые мутации, которые не будут связаны с фенотипической изменчивостью и никак себя не проявлять. Другие мутации напротив, будут демонстрировать четкую взаимосвязь между фенотипом и генотипом. [38].

Изучение географического распространения отдельных вариантов и их комбинаций, молекулярная эволюция мутантных вариантов представляются очень перспективными направлениями исследования [85]. С их помощью возможен поиск ответов на вопрос о направлении современной эволюции микобактерии туберкулеза и М. tuberculosis complex в целом.

С точки зрения молекулярно-биологических исследований наиболее перспективным и информативным представляется полногеномное секвенирование имеющегося изолята. В этом случае можно получить не только информацию о наличии или отсутствии мутаций в конкретных регионах ДНК микобактерий, но и оценить в целом потенциал для возможного комбинированного развития феноменов ЛУ и ЛТ. Более дешевое выборочное/фрагментарное секвенирование наиболее перспективных регионов генетического аппарата микобактерий также может дать много полезной информации.

В любом случае, использование данных секвенирования, в отличие от традиционного метода ПЦР, выявляющего только отдельные генетические детерминанты, позволит произвести корректное сопоставление данных клинических, бактериологических и молекулярно-биологических исследований с последующей персонализированной коррекцией схемы лечения.

Перспективы фаговой терапии туберкулеза

Возникновение широкого спектра лекарственной толерантности и устойчивости микобактерий туберкулеза привело исследователей к поиску новых стратегий лечения туберкулеза без использования химиопрепаратов. В настоящее время выделено и секвенировано более 2000 отдельных микобактериофагов, вирусов, которые заражают Mycobacterium spp. (https://phagesdb.org ) [5]. Эти фаги были организованы в соответствии с их общими отношениями последовательностей в 29 геномных групп, обозначенных кластерами от A до Z и от AA до AC.

Следует ожидать наличие значительного клинического потенциала для использования микобактериофагов в борьбе с туберкулезом, в качестве диагностических репортерных фагов, для профилактического прерывания передачи туберкулеза или для терапевтического лечения инфекций. Все это достигается путем идентификации конкретных кандидатов в фаги, выяснения механизмов резистентности и перекрестной резистентности, а также определения вариантов течения инфекции для разных штаммов и генетических линий. Потенциал терапевтического применения фагов для прямой борьбы с туберкулезными инфекциями неясен из-за сложности инфекций, при которых патоген живет внутриклеточно в макрофагах и в недоступных гранулемах. Тем не менее, на поздних стадиях инфекции часто имеется значительное количество внеклеточных бактерий, которые должны быть доступны для фагов.

В экспериментах был получен аддитивный эффект использования фага FionnbharthΔ 45 Δ 47 и противотуберкулезных препаратов рифампицина и изониазида. Также был показан терапевтический эффект использования фагов на изониазид-устойчивом штамме katG (del 371g) (mc 2 4977) [86].

Поскольку лекарственно-устойчивые штаммы M. tuberculosis накапливают индивидуальные мутации генов-мишеней, а не дефекты в отдельных локусах экспортеров лекарств, относительно маловероятно, что другие лекарственно-устойчивые штаммы будут иметь заметно отличающиеся профили фаговой инфекции. Вместе с тем, этот вопрос требует дальнейшего изучения. В целом, следует ожидать, что использование грамотно подобранного фагового коктейля может сыграть положительную роль при преодолении феноменов ЛТ и ЛУ микобактерий.

Заключение

Таким образом, в основе взаимодействия микобактерий туберкулеза и противотуберкулезных препаратов лежат сложные молекулярные механизмы, которые могут быть:

• не определены генетически, а являться проявлением «нормы реакции» изменчивости микобактерий;
• определены генетически и, в силу отсутствия процессов-мишеней внутри микобактериальной клетки, определять истинную, природную устойчивость микобактерий к ПТП;
• определены генетически в качестве предпосылок для возникновения и отбора мутированных вариантов микобактерий в условиях стрессирующего воздействия антибактериальных препаратов;
• определены генетически в виде отобранных и фенотипически проявляющихся мутированных вариантов наследственного аппарата микобактерий туберкулеза.

Преодоление невосприимчивости к ПТП возможно, поэтому, только после тщательного анализа данных клинических, бактериологических и молекулярно-генетических исследований изолятов микобактерий у конкретного пациента. Использование для этого методов полного или, в ряде случаев, фрагментарного секвенирования представляется наиболее перспективным подходом. Дополнительную помощь при разработке индивидуальных планов лечения может оказать использование грамотно подобранного фагового коктейля из микобактериофагов.

About the authors

Yuri Khomyakov

Plague Control Center

Author for correspondence.
Email: khomyakov@cmd.su
ORCID iD: 0000-0003-0540-252X

Ass. Prof., M.D; PhD, Dr. Sci (Biology), Head of Laboratory of virology.

Russian Federation

Darya Dmitrievna Zvyagintseva

FBIS Central Research Institute of Epidemiology

Email: dzvyaginceva@gmail.com

Researcher

Russian Federation, 111123, Россия, г. Москва, ул. Новогиреевская, дом 3а

Tatiana Khomyakova

Research Institute of Human Morphology of Russian Scientific Center of Surgery, Moscow, Russian Federation

Email: tathkom@yandex.ru

senior researcher

References

Supplementary files

There are no supplementary files to display.