Conservation of cholera vibrios in complex microcosm containing green microalgae

Full Text

ОБОСНОВАНИЕ

Фитопланктон является одним из основных компонентов водной экосистемы. В поверхностных водоёмах средних широт массовое размножение и цветение фитопланктона начинаются в летний период, и это способствует обеспечению питательными веществами зоопланктона и других гидробионтов [1–3]. В летне-осенний период (с июля по ноябрь), численность фитопланктона достигает более 100 000 кл/см³, и, как следствие, отмечается ухудшение показателей качества речной воды [4], одновременно регистрируются случаи заболевания людей желудочно-кишечными заболеваниями [5], вплоть до смертельных исходов, и зачастую в это время на эндемичных территориях возникают эпидемии холеры [6, 7].

Холерные вибрионы, как и большинство микроорганизмов, могут существовать в форме биоплёнок, адгезируя на поверхности биотических компонентов хитинового покрова некоторых морских животных, целлюлозного покрова водорослей [8–10] и абиотических (пластисфера) компонентов [11], что может способствовать их распространению на различные расстояния. Возможно, это является объяснением одного из механизмов аутохтонного существования холерных вибрионов в водоёмах. Научных данных по взаимодействию биоплёночной формы холерных вибрионов с постоянными представителями гидробиоценоза водоёмов средних широт — зелёными одноклеточными водорослями в доступной литературе нами не найдено.

Цель — определить длительность сохранения холерных вибрионов на биотических (хитин) и абиотических (пластик) субстратах в присутствии зелёных одноклеточных водорослей при изменении температуры культивирования в условиях эксперимента.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Для экспериментального моделирования использовали биоплёночные и планктонные формы холерных вибрионов на биотических и абиотических субстратах и зелёные одноклеточные водоросли (микроводоросли). Штаммы Vibrio cholerae различались по происхождению, токсигенности и набору генов: V. cholerae О1 El Tor 19 613 (Инаба), 19 667 (Огава) ctxАВ⁺tcpА⁺csh1^–, 20 000 (Огава), 19 670 (Инаба) ctxА^–tcpА^–csh1⁺; V. cholerae О139 17 259 ctxАВ⁺tcpА⁺csh1^– и 17 918 ctxАВ^–tcpА^–csh1^–. Штаммы водорослей IPAS S-313 Desmodesmus communis и А-241 Ankistrodesmus falcatus, являющихся обычными обитателями поверхностных водоёмов средних широт, получены из коллекции микроводорослей Института физиологии растений имени К.А. Тимирязева Российской академии наук.

Получение биоплёнок холерных вибрионов проводили запатентованными и описанными ранее способами, где в качестве биотического субстрата использовали хитиновый экзоскелет речного рака Astacus astacus, в качестве абиотического — пластинки из пищевого пластика [12–14]. Совместное культивирование холерных вибрионов в биоплёночной и планктонных формах с зелёными микроводорослями проводили в конических химически чистых колбах по методике, описанной нами раннее [15]. Эксперименты проводили в стерильных условиях на речной автоклавированной воде. Экспериментальные пробы состояли из холерных вибрионов (10⁴ м.к./мл), одноклеточных зелёных водорослей (10⁴ кл/мл), биотического (хитин) или абиотического (пластик) субстрата и без субстратов. В контрольные пробы входили холерные вибрионы без субстратов.

Условия эксперимента для опытных и контрольных проб были одинаковыми. Первый месяц культивирование проб проходило при комнатной температуре 23±2℃ и дневном освещении, со второго месяца эти же пробы помещали в условия температуры 14±2℃ и освещённости «день/ночь». Дневная освещённость составляла 1000 люкс. С третьего месяца пробы культивировали при температуре 8±2℃ без освещения (имитация зимних условий).

Концентрацию холерных вибрионов в планктонной и биоплёночной форме количественно оценивали методом полимеразной цепной реакции в реальном времени [16–18] — количество клеток водорослей под микроскопом [15]. Жизнеспособность холерных вибрионов подтверждали бактериологическим способом по росту на агаре Мартена с рН 7,6 [12]. Высевы осуществляли один раз в неделю.

Визуализацию микрокосмов в экспериментальных и контрольных пробах проводили микроскопическими методами с помощью световой и люминесцентной микроскопии [13]. Фиксированные препараты окрашивали конго-красным и фуксином, нативные — акридиновым оранжевым. Исследуемые образцы изучали в световом микроскопе NikonEclipse E200 F с люминесцентным модулем и иммерсионной системой при увеличении 10×100.

Эксперименты проводили в трёхкратной повторности. Накопление, корректировку, систематизацию исходной информации и визуализацию полученных результатов осуществляли в электронных таблицах Microsoft Office Excel 2016, используя десятичный логарифм. Статистический анализ проводили с использованием программы Medstatistica.ru. Полученные данные объединяли в вариационные ряды, на основании которых проводили расчёт средних арифметических величин (M). В качестве ошибки среднего представляли стандартное отклонение (σ) и относительное стандартное отклонение (коэффициент вариации — CV) [19]. Статистическую значимость различий экспериментальных данных оценивали с помощью t-критерия Стьюдента, при уровне p ≤0,05 достоверность считали значимой. Если концентрация холерных вибрионов была в пределах одного порядка, то эти значения оценивали как идентичные.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Анализ результатов сохранения V. cholerae О1 и О139 серогруппы в микрокосмах состоял из определения в опытных и контрольных пробах их концентрации в планктонной или биоплёночной форме на разных субстратах и без них в присутствии клеток зелёной микроводоросли. Таким образом, каждый штамм холерных вибрионов анализировали в шести пробах. Результаты экспериментов представлены на рис. 1a–d.

 

Рис. 1. Концентрация V. cholerae O1/О39 серогрупп с разной генетической характеристикой, в разных условиях культивирования. Примечание. Обозначения цветовых линий: зелёная — V. cholerae+водоросль; оранжевая — V. cholerae+водоросль+пластик/планктон; серая — V. cholerae+водоросль+пластик/биоплёнка; жёлтая — V. cholerae+водоросль+хитин/планктон; синяя — V. cholerae+водоросль+хитин/биоплёнка; чёрная — V. cholerae контроль (без субстратов). / Fig. 1. Concentration of V. cholerae O1/O39 serogroups with different genetic characteristics under different cultivation conditions. Note: Designations of color lines: green — V. cholerae+algae; orange — V. cholerae+algae+plastic/plankton; gray — V. cholerae+algae+ plastic/biofilm; yellow — V. cholerae+algae+chitin/plankton; blue — V. cholerae+algae+chitin/biofilm; black — V. cholerae control (without substrates).

 

Культивируя микрокосмы в пробах с хитиновым субстратом при температуре 23±2℃, имитирующей летнюю температуру воды водоёмов, концентрация V. cholerae О1 и О139 серогруппы в биоплёночных формах за сутки выросла до 6 Lg, в планктоне над хитином концентрация увеличилась на два порядка, т.е. адгезия клеток холерных вибрионов к хитину и их размножение произошли с начала эксперимента. Через неделю в пробах с хитиновым субстратом в биоплёнках концентрация холерных вибрионов всех штаммов достигла значений 9 Lg. На пластиковом субстрате также регистрировали формирование биоплёнки, но концентрация холерных вибрионов в планктонной и биоплёночных формах была на два порядка ниже, чем в микрокосмах с хитином. В течение первых четырёх недель (рис. 1c, 1d) концентрация V. cholerae О1 в биоплёночных и планктонных формах в пробах на хитине варьировала на уровне значений 8–9 Lg. В это же время в пробах с пластиковым субстратом концентрация холерных вибрионов всех штаммов в биоплёнках и планктоне была на два порядка ниже и колебалась в пределах 6,5–6,8 Lg. Аналогичной была концентрация холерных вибрионов в пробах с зелёными водорослями без субстратов. Через месяц концентрация биоплёночных форм V. cholerae О139 17 918 и 17 259 на хитиновом субстрате была 8,2 и 9,1 Lg, а в образцах планктона — 9,3 Lg соответственно (рис. 1a, 1b). Скорость образования биоплёнок V. cholerae всех штаммов на пластиковом субстрате была ниже, чем на хитиновом, и через месяц их концентрация в биоплёнках была равна 6,8–6,3 Lg, в планктонной форме — 6,9–6,8 Lg соответственно. Концентрация холерных вибрионов в пробах с водорослями без субстратов равнялась 6,4–6,7 Lg. Во всех опытных пробах произошло увеличение концентрации зелёной микроводоросли D. communis, о чём свидетельствовало появление визуально наблюдаемого характерного зеленоватого оттенка в толще воды, через месяц толща воды приобрёла насыщенный зелёный цвет. При микроскопическом исследовании в конце первой недели концентрация водоросли составила 5×10⁴ кл/мл, а к концу первого месяца — до 10⁵ кл/мл.

В контрольных пробах концентрация холерных вибрионов всех испытуемых штаммов через неделю от начала эксперимента возросла на два порядка и сохранялась в течение месяца при 23±2℃. Как видно на графиках (рис. 1a–d), концентрация холерных вибрионов несколько ниже, чем в экспериментальных пробах или такая же. Культура холерных вибрионов во всех экспериментальных и контрольных пробах была жизнеспособной, колонии имели характерный рост на агаре Мартена.

Для имитации осеннего периода, когда температура в поверхностных водоёмах снижается, пробы всех микрокосмов с пятой недели (со второго месяца) поместили в новые условия культивирования: температура 14±2℃ и освещённость «день/ночь». На рис. 1a–d концентрация клеток холерных вибрионов во всех опытных и контрольных пробах оставалась на прежнем уровне, когда культивирование происходило при 23±2℃. Через месяц культивирования в условиях, имитирующих осенний период, концентрация клеток штаммов V. cholerae О1 El Tor 20 000 и 19 613 в биоплёночных пробах на хитине сохранялась и составляла 8,1 Lg, в планктонных (над хитином) — колебалась в пределах 8,7–8,1 Lg (рис. 1c, 1d). Аналогично в пробах со штаммами О139 серогруппы в биоплёнках на хитине концентрация клеток была в пределах 8,5–8,1 Lg, в планктоне — 8,6 Lg (рис. 1a, 1b). В биоплёночных формах на субстрате из пластика концентрация клеток V. cholerae El Tor 20 000 и 19613 также оставалась на прежнем уровне и составляла 6,2–7,5 Lg, при этом штаммы оставались жизнеспособными (рис. 1c, 1d). Концентрация клеток V. cholerae О139 серогруппы 17 918 и 17 259 была равна в биоплёнках 6,1–5,9 Lg и в планктоне 6,2–6,4 Lg, в этом же диапазоне была концентрация холерных вибрионов в пробах с водорослями без биотических и абиотических субстратов (рис. 1a, 1b). Концентрация клеток холерных вибрионов в контрольных пробах оставалась на прежнем уровне у штаммов V. cholerae El Tor 20 000 (рис. 1c), у остальных штаммов отмечено снижение на один порядок (рис. 1a, 1b, 1d).

Концентрация зелёной микроводоросли D. communis также оставалась на прежнем уровне, придавая насыщенный зелёный оттенок всему объёму воды.

Имитируя дальнейшее снижение температуры в водоёмах, с третьего месяца (десятая неделя) от начала культивирования все экспериментальные и контрольные пробы поместили в условия низкой температуры 8±2℃ и без освещения. На протяжении двух месяцев во всех биоплёночных формах с хитиновым субстратом концентрация клеток V. сholerae О1 и О139 серогрупп колебалась в пределах 8,0–8,9 Lg. Исключение составил штамм V. cholerae El Tor 19 613: его концентрация была на порядок ниже и колебалась в пределах 7,0–7,6 Lg (рис. 1d). В планктонных пробах над хитином отмечен подъём концентрации на один порядок в пробах у всех штаммов. К этому моменту исходный хитиновый субстрат полностью деградировал до мельчайших хитиновых крупинок, которые распадались под браншами пинцета, поэтому легко попадали с током жидкости в пипетку при манипуляциях для определения концентрации клеток. Возможно, этим объясняется увеличение концентрации V. cholerae в планктонной форме над хитиновым субстратом. Через три месяца при температуре 8±2℃ концентрация клеток штаммов V. cholerae О139 17 918 и 17 259 колебалась в пределах 7,2–8,2 и 8,3–10,3 Lg соответственно (рис. 1a, 1b); V. cholerae О1 20 000 и 19 613 была в пределах 8,5 и 6,7–8,2 Lg соответственно (рис. 1c, 1d). При высевах на питательный агар культура холерных вибрионов оставалась жизнеспособной с характерным ростом колоний холерных вибрионов на агаре Мартена. Отмечены разные сроки сохранения штаммов холерных вибрионов в жизнеспособном состоянии: V. cholerae О139 17 918 — в течение одного месяца, V. cholerae О139 17 259 и V. cholerae О1 El Tor 19 613 — один месяц и две недели (срок наблюдения), V. cholerae О1 El Tor 20 000 — более трёх месяцев (срок наблюдения).

В биоплёночной форме с пластиковым субстратом и в пробах с водорослями, но без субстратов при снижении температуры до 8±2℃ отмечалось снижение концентрации клеток V. cholerae О1 и О139 серогруппы. Концентрация V. cholerae О139 17 918 колебалась в пределах 4,9–5,5, у V. cholerae О139 17 259 — 4,5–6,1, у V. cholerae О1 El Tor 20 000 — 4,5, у V. cholerae О1 El Tor 19 613 — 4,5–5,8 Lg. При высевах на агар Мартена наблюдали рост штамма V. cholerae О139 17 918, находящегося в планктонной форме в течение двух недель, тогда как в биоплёночной форме отмечен рост в течение двух месяцев, у штамма V. cholerae О139 17 259 в биоплёночной форме и в пробе с водорослями без субстратов рост отмечен в течение двух месяцев. В пробах со штаммами V. cholerae О1 El Tor 20 000 и 19 613 отмечен рост в течение трёх месяцев в биоплёночной и планктонной форме (срок наблюдения).

В контрольных пробах (без субстратов и водорослей) концентрация холерных вибрионов с уменьшением температуры культивирования до 8±2℃ уменьшилась на 1–2 порядка в течение двух недель и составила 5,2–4,0 Lg (рис. 1a–d). После двух недель при низкой температуре жизнеспособных холерных вибрионов не обнаружено, что проявилось в отсутствии роста колоний на агаре Мартена во всех контрольных пробах.

Полученные результаты изменения концентраций холерных вибрионов в опытных и контрольных микрокосмах со штаммами V. cholerae О1 El Tor 19 667 ctxАВ⁺tcpА⁺csh1^–, 19 670 ctxА^–tcpА^–csh1⁺, штаммом водоросли А-241 Ankistrodesmus falcatus были идентичны вышеописанным.

В результате экспериментальной работы при изменении температуры культивирования от 23±2 до 8±2℃ у исследуемых штаммов V. cholerae О1 и О139 серогрупп наблюдали нарастание, выход на плато и уменьшение концентрации холерных вибрионов в присутствии зелёных микроводорослей в биопленочной и планктонной форме и без них (контрольная проба) в разные сроки. Концентрация V. cholerae О1 и О139 серогрупп в контрольных пробах, т.е. без субстратов сохранялась в течение трёх месяцев, включая один месяц при температуре 8±2℃, с падением до нулевых значений с четвёртой недели. При этом в опытных пробах концентрация холерных вибрионов сохранялась более шести месяцев (срок наблюдения), включая 14 недель при температуре 8±2℃. Все исследуемые штаммы холерных вибрионов независимо от серогруппы и токсигенности были способны к адгезии и формированию биоплёнок на абиотических и биотических субстратах, а также к размножению в планктонных пробах с микроводорослями без субстратов. Вероятно, некоторые штаммы V. cholerae О139 серогруппы в пробах с пластиковым субстратом при температуре 8±2℃ переходят в некультивируемое состояние, находясь в планктонной форме.

При формировании биоплёнки все исследуемые штаммы проходили все стадии её формирования, описанные нами раннее [13]: адгезия клеток, формирование монослоя и зрелой биоплёнки, клетки холерных вибрионов окружали клетки зелёных водорослей со всех сторон, формируя крупные агрегаты, при микроскопии был хорошо виден экзополисахарид розового цвета, клетки холерных вибрионов красного цвета и клетки зелёных водорослей зелёного цвета.

Статистический анализ сравнения значений средней концентрации и стандартного отклонения V. cholerae обеих серогрупп в биоплёночных и планктонных пробах в динамике при разных температурах культивирования представлен в табл. 1. При сравнении результатов динамики увеличения/уменьшения концентрации холерных вибрионов О1 и О139 серогрупп в биоплёночных и планктонных пробах при температуре культивирования от 23±2 до 14±2℃ и с дальнейшим уменьшением до 8±2℃ (первые две недели) значение t-критерия Стьюдента, рассчитанное по экспериментальным данным, для проб 1–4 (t_эксп=0,31; 0,03; 0,31; 1,03 соответственно) не превышает табличное значение t_табл=2,306 при уровне значимости р=0,05 и числе степеней свободы f=8.

 

Таблица 1. Результаты средней концентрации клеток в биоплёнках штаммов V. cholerae O1 и О139 серогрупп в опытных пробах с субстратами и контрольных пробах без субстратов, М±σ, м.к./мл; CV, % / Table 1. Results of the average concentration of cells in biofilms of strains of V. cholerae O1 and O139 serogroups in experimental samples with substrates and control samples without substrates, М±σ, mc/ml; CV, %

Время, нед.	t, ℃	Проба 1 (+водоросль)		Проба 2 (+водоросль+пластик)		Проба 3 (+водоросль+хитин)		Проба 4 (контроль)
		V. cholerae О1	V. cholerae О139	V. cholerae О1	V. cholerae О139	V. cholerae О1	V. cholerae О139	V. cholerae О1	V. cholerae О139
1	23±2	7,01±0,09 1,31%	6,71±0,09 1,37%	7,30±0,28 3,86%	7,27±0,40 5,46%	8,87±0,14 1,58%	8,93±0,18 1,98%	6,64±0,06 0,85%	6,69±0,14 2,11%
3		6,69±0,08 1,16%	6,60±0,23 3,43%	6,72±0,12 176%	6,73±0,26 3,8%	9,13±0,49 95,41%	9,03±0,52 5,73%	6,52±0,32 4,88%	6,04±0,54 9,01%
4		6,63±0,18 2,77	6,60±0,23 3,43%	6,59±0,08 2,17%	6,73±0,26 3,8%	8,82±0,28 3,18%	9,03±0,52 5,73%	6,39±0,15 2,32%	6,04±0,54 9,01%
6	14±2	5,76±0,44 7,61	5,64±0,08 1,38%	5,88±0,24 4,05%	5,74±0,31 5,40%	8,09±0,48 5,96%	8,18±0,46 5,65%	5,51±0,30 5,39%	5±0,01 0,14%
8		6,17±0,23 3,78%	6,18±0,27 4,35%	6,17±0,33 5,42%	6,21±0,19 3,10%	8,27±0,33 3,93%	8,49±0,27 3,13%	5,94±0,52 8,81%	5
∑		6,45±0,49 7,59%	6,35±0,44 6,99%	6,53±0,54 8,33%	6,54±0,58 8,90%	8,64±0,44 5,06%	8,73±0,38 4,36%	6,20±0,47 7,55%	5,75±0,74 12,82%
tСт, р		0,31 0,767667		0,03 0,980570		0,31 0,765871		1,03 0,336004
10	8±2	5,74±0,40 6,9%	5,25±0,64 12,27%	5,31±0,52 9,88%	5,59±0,18 3,27%	8,49±0,71 8,35%	8,59±0,36 4,25%	5,19±0,05 0,95%	0
12		5,50±0,71 12,86%	5,0±0,71 14,14%	5,25±0,5 9,52%	5,13±0,25 4,88%	8,13±0,85 10,51%	8,5±0,58 6,79%	5	0
∑		5,62±0,17 3,02%	5,13±0,18 3,45%	5,28±0,04 0,8%	5,36±0,33 6,07%	8,31±0,25 3,06%	8,54±0,06 0,74%	–	0
tСт, р		1,98 0,297852		0,24 0,849649		0,89 0,535381		–	–

Примечание. М±σ — средняя концентрация клеток V. cholerae и стандартное отклонение; CV — коэффициент вариации V. cholerae за 8–12 недель; ∑ — среднее количество концентрации клеток; t_Ст — t-критерий Стьюдента; р — уровень значимости.

Note: M±σ — average V. cholerae cell concentration and standard deviation; CV — coefficient of variation V. cholerae in 8–12 weeks; ∑ — average amount of cell concentration; t_Ст — Student’s criterion; p — significance level.

 

При еженедельном сравнении динамики изменения концентрации холерных вибрионов в биоплёночном и планктонном состоянии в пробах с хитиновым и пластиковым субстратом и зелёной микроводорослью установлено, что значение критерия Стьюдента t_эксп превышает табличное значение t_табл при уровне значимости α=0,05. Это означает, что в пробах с хитиновым субстратом размножение клеток холерных вибрионов происходит с первых дней, и до конца эксперимента их концентрация выше, чем в пробах с пластиковым субстратом. Результаты представлены в табл. 2.

 

Таблица 2. Результаты средней концентрации клеток V. cholerae в опытных пробах с разными субстратами и контрольных пробах без субстратов, при температуре 23±2, 14±2 и 8±2℃, М±σ, м.к./мл; CV, % / Table 2. The results of the average concentration of V. cholerae cells in experimental samples with different substrates and control samples without substrates, at a temperature of 23±2, 14±2, and 8±2℃, М±σ, mc/ml; CV, %

Время, нед.	t, ℃	V. cholerae+водоросли					Контроль
		+водоросль	Пластик		Хитин
			БП	Планктон	БП	Планктон
1	23±2	7,11±0,38 5,33%	7,39±0,43 5,88%	7,19±0,15 2,06%	8,96±0,18 2,02%	8,83±0,09 1,06%	6,66±0,09 1,39%
3		6,64±0,15 2,21%	6,63±0,22 3,29%	6,82±0,09 1,33%	8,80±0,40 4,54%	9,31±0,47 5,04%	6,28±0,45 7,23%
4		6,65±0,15 2,20%	6,59±0,18 2,79%	6,77±0,19 2,78%	8,75±0,43 4,90%	9,10±0,32 3,55%	6,22±0,38 6,16
6	14±2	5,70±0,27 4,66%	5,74±0,34 5,92%	5,87±0,20 3,32%	7,82±0,26 3,36%	8,42±0,42 5,00%	5,26±0,34 6,43%
8		6,17±0,21 3,33%	6,01±0,16 2,58%	6,36±0,21 3,33%	8,21±0,21 2,56%	8,52±0,34 4,05%	5,47±0,62 11,36%
10	8±2	5,49±0,52 9,49%	5,21±0,29 5,60%	5,70±0,34 5,91%	8,19±0,4 4,89%	8,91±0,39 4,37%	0
12		5,25±0,65 12,30%	5	5,38±0,48 8,91%	7,88±0,63 7,99%	8,88±0,25 2,82%	0
∑ CV m		6,14±0,69 11,24 0,28	6,08±0,85 13,96 0,35	6,30±0,67 10,61 0,27	8,37±0,46 5,51% 0,19	8,85±0,31 3,49% 0,13	–

Примечание. М±σ — средняя концентрация клеток V. cholerae и стандартное отклонение; CV — коэффициент вариации; ∑ — среднее количество концентрации клеток; m — средняя ошибка средней арифметической V. cholerae за 12 недель.

Note: M±σ — average V. cholerae cell concentration and standard deviation; CV — coefficient of variation; ∑ — average amount of cell concentration; m — the average error of the arithmetic mean V. cholerae for 12 weeks.

 

ОБСУЖДЕНИЕ

Из полученных результатов сравнения средней концентрации клеток штаммов V. cholerae O1и О139 серогрупп в экспериментальных пробах с субстратами в биоплёнках и контрольных пробах без субстратов следует, что наблюдаемые различия статистически незначимы и концентрация клеток холерных вибрионов О1 и О139 серогрупп между собой в экспериментальных и контрольных пробах находится в пределах одного порядка. Это означает, что холерные вибрионы О1 и О139 серогрупп образуют биоплёнки однотипно и способны выживать на биотическом и абиотическом пластиковом субстрате в условиях, моделирующих летнюю и осенне-зимнюю температуру.

Согласно полученным результатам, в пробах в присутствии зелёных микроводорослей и биотического субстрата хитина статистически подтверждено выраженное повышение концентрации клеток холерных вибрионов. При еженедельном сравнении результатов значений концентрации холерных вибрионов в биоплёночных и планктонных пробах с зелёной водорослью и хитиновым субстратом с такими же пробами, но с пластиковым субстратом и без субстратов получили статистически значимые различия (от p=0,000 018 до p=0,054 067), при этом значение t-критерия Стьюдента, рассчитанное по экспериментальным данным, превышает критическое (табличное) при уровне значимости α=0,05 и числе степеней свободы f=6.

При сравнении суммарного значения концентрации холерных вибрионов за 12 недель в условиях температурных изменений в биоплёнках на хитиновом субстрате с биоплёнками на пластиковом субстрате и в планктонных формах в присутствии зелёной водоросли получили статистически значимые результаты при p=0,000 128 и p=0,000 004 соответственно. При сравнении проб только с зелёной водорослью с биоплёночными и планктонными пробами с хитиновым субстратом результаты также были статистически значимыми при p=0,000 039 и p=0,000 003 соответственно, а при сравнении их с пробами с пластиковым субстратом результаты были не значимы — p=0,688 724 и p=0,895 928 соответственно. Полученные результаты означают, что присутствие хитинового субстрата во всех пробах приводит к размножению клеток холерных вибрионов, как это было установлено ранее [20]. При оценке размножения клеток зелёных микроводорослей на один порядок визуально установлено, что в присутствии хитина вся толща жидкости становится насыщенно зелёного цвета. Данное наблюдение может свидетельствовать о том, что хитин является субстратом для размножения не только вибрионов, но и водорослей.

Нами установлена способность холерных вибрионов находиться в жизнеспособном состоянии в течение длительного времени при низких температурах культивирования в пробах, где одним из компонентов были клетки зелёных микроводорослей. Возможно, способность холерных вибрионов продуцировать фермент муциназу, разрушающий муциноподобные компоненты клеток водорослей [21], обеспечивает длительное сохранение клеток холерных вибрионов. Отмеченное размножение зелёных микроводорослей в присутствии хитинового субстрата, вероятно, является одним из этапов пищевой цепи в экологии водоёмов и, соответственно, может быть резервуаром для биоплёночных форм холерных вибрионов [10, 22–25].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, показано, что сохранение токсигенных и нетоксигенных штаммов V. cholerae О1 и О139 серогрупп (ctxАВ⁺tcpА⁺csh1^– и ctxА^–tcpА^–csh1⁺ и ctxА^–tcpА^–csh1^–) в течение шести месяцев, в том числе три месяца при температуре, имитирующей осенне-зимний период, возможно в составе биоплёнок на биотическом и абиотическом субстрате в микрокосмах, где одним из компонентов являются зелёные микроводоросли. Концентрация холерных вибрионов в пробах с хитиновым субстратом и клетками водорослей на два порядка выше, чем в пробах с пластиковым субстратом и клетками водорослей и сохраняется весь срок наблюдения. Более продолжительное сохранение V. cholerae О1 El Tor нетоксигенного штамма с наличием гена csh1⁺ [26] в жизнеспособном состоянии в составе биоплёнок на пластике при уменьшении температуры до 8±2℃, возможно, связано с наличием в его геноме гена холодового шока, что требует дальнейших исследований для экспериментальной проверки. Без субстрата для адгезии, колонизации и формирования биоплёнок холерные вибрионы не способны к длительной персистенции при пониженной температуре.

ДОПОЛНИТЕЛЬНО

Источник финансирования. Работа проведена в рамках отраслевой научно-исследовательской программы Роспотребнадзора.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Вклад авторов. Все авторы подтверждают соответствие своего авторства международным критериям ICMJE (все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции, проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией). Наибольший вклад распределён следующим образом: С.В. Титова — концепция и дизайн исследования, сбор и обработка материала, статистическая обработка материала, написание текста, утверждение окончательного варианта статьи, ответственность за целостность всех частей статьи; Е.А. Меньшикова — концепция и дизайн исследования, сбор, обработка материала, редактирование текста, утверждение окончательно варианта статьи, ответственность за целостность всех частей статьи; С.О. Водопьянов — концепция и дизайн исследования, сбор и обработка материала, редактирование текста, утверждение окончательно варианта статьи, ответственность за целостность всех частей статьи; О.В. Бородина, А.А. Герасименко, И.П. Олейников, Н.А. Селянская — сбор и обработка материала.

ADDITIONAL INFORMATION

Funding source. The study was carried out within the framework of the industry research program of Rospotrebnadzor.

Competing interests. The authors declare that they have no competing interests.

Authors’ contribution. All authors made a substantial contribution to the conception of the work, acquisition, analysis, interpretation of data for the work, drafting and revising the work, final approval of the version to be published and agree to be accountable for all aspects of the work. The largest contribution is distributed as follows: S.V. Titova — concept and design of research, collection and processing of material, statistical processing of material, writing of the text, approval of the final version of the article, responsibility for the integrity of all parts of the article; E.A. Menshikova — the concept and design of the study, the collection and processing of the material, the editing of the text, the final approval of the version of the article, responsibility for the integrity of all parts of the article; S.O. Vodopyanov — the concept and design of the study, the collection and processing of the material, the editing of the text, the final approval of the version of the article, responsibility for the integrity of all parts of the article; A.A. Gerasimenko, O.V. Borodina, I.P. Oleynikov, N.A. Selyanskaya — collection and processing of material.

About the authors

Svetlana V. Titova

Rostov-on-Don of the Order of the Red Banner of Labor Research Anti-Plague Institute

Author for correspondence.
Email: titova_sv@antiplague.ru
ORCID iD: 0000-0002-7831-841X
SPIN-code: 5695-2103

MD, Cand. Sci. (Med.)

Russian Federation, Rostov-on-Don

Elena A. Menshikova

Rostov-on-Don of the Order of the Red Banner of Labor Research Anti-Plague Institute

Email: menshikova_ea@antiplague.ru
ORCID iD: 0000-0002-6003-4283
SPIN-code: 6367-4404

Cand. Sci. (Biol.)

Russian Federation, Rostov-on-Don

Sergei O. Vodopyanov

Rostov-on-Don of the Order of the Red Banner of Labor Research Anti-Plague Institute

Email: serge100v@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-4336-0439
SPIN-code: 4672-9310

MD, Dr. Sci. (Med.)

Russian Federation, Rostov-on-Don

Tamara N. Borodina

Rostov-on-Don of the Order of the Red Banner of Labor Research Anti-Plague Institute

Email: borodina_tn@antiplague.ru
ORCID iD: 0000-0001-6222-4331
Russian Federation, Rostov-on-Don

Artem A. Gerasimenko

Rostov-on-Don of the Order of the Red Banner of Labor Research Anti-Plague Institute

Email: gerasimenko_aa@antiplague.ru
ORCID iD: 0000-0002-7700-3483
Russian Federation, Rostov-on-Don

Igor P. Oleynikov

Rostov-on-Don of the Order of the Red Banner of Labor Research Anti-Plague Institute

Email: selyanskaya_na@antiplague.ru
ORCID iD: 0000-0002-2390-9773
Russian Federation, Rostov-on-Don

Nadezhda A. Selyanskaya

Rostov-on-Don of the Order of the Red Banner of Labor Research Anti-Plague Institute

Email: selyanskaya_na@antiplague.ru
ORCID iD: 0000-0002-0008-4705
Russian Federation, Rostov-on-Don

References

Supplementary files