DETECTION AND GENETIC CHARACTERISTICS OF RNA ISOLATES OF CRIMEAN-CONGO HAEMORRHAGIC FEVER VIRUS FROM THE HYALOMMA MARGINATUM TICKS COLLECTED IN THE ASTRAKHAN REGION (2016)

Full Text

Список иксодовых клещей (Ixodidae) - переносчиков вируса Крымской-Конго геморрагической лихорадки (ККГЛ) - насчитывает около 30 видов и подвидов, относящихся к 6 родам. Во всех эндемичных регионах основное значение в передаче вируса имеют взрослые особи клещей рода Hyalomma: в европейских очагах - главным образом Hyalomma marginatum. В период с 2005 по 2016 гг. сотрудниками отдела особо опасных инфекций Центра эпидемиологии и гигиены в Астраханской области с крупного рогатого скота было собрано 8512 экземпляров имаго иксодовых клещей 11 видов: Hyalomma marginatum (51,3%), H. supense (43,6%), Dermacenter niveus (2,2%), H. anatolicum (0,9%), Boophilus annulatus (0,8%), Rhipicephalus pumilio (0,5%), D. marginatus (0,4%), Rh. rossicus (0,3%), Haemaphisalis punctata (0,1%), H. detritum (0,01%) и H. asiaticum (0,002%). Видовой состав клещей, снятых в те же годы с людей, насчитывал 19 видов, включая Rh. pumilio - 1262 особи (57,9%), H. marginatum - 4327 (19,9%), Rh. sanguineus - 1898 (8,7%), D. niveus - 1499 (6,9%), Rh. turanicus - 507 (2,3%), Rh. rossicus - 388 (1,8%), I. ricinus - 322 (1,5%), H. detritum - 89 (0,4%), D. marginatum - 43 (0,2%), H. asiaticum - 23 (0,1%), Haem.punctata - 21 (0,1%), B. annulatus - 19 (0,1%). H. dromedarii, H. detritum, H. aegyptium, Rh. schulzei, D. reticulatus были представлены единичными экземплярами в количестве от 0,004 до 0,02%. В предыдущих публикациях, посвящённых изучению фауны иксодовых клещей в Астраханской области, упоминались единичные находки Ixodes crenulatus, Haem. impessum и Boophilis calcaratus [1, 2]. В 1967-1969 гг. методом заражения новорожденных белых мышей в Астраханской области было обследовано 817 экземпляров имаго H. marginatum и выделен 1 (0,1%) штамм вируса [3]. Среди 1076 клещей этого вида, снятых в 2006-2010 гг. после присасывания с людей, 10 экземпляров (0,9%) содержали РНК вируса КГЛ. Из 10 человек, покусанных инфицированными клещами, в трёх случаях на основании клинических данных и результатов обследования их сывороток в ОТ-ПЦР, ИФА-IgM и ИФА-IgG был поставлен диагноз КГЛ. У двух других наблюдались острые лихорадочные заболевания, но их обследование методами ОТ-ПЦР и ИФА не проводилось, поэтому связь этих случаев с вирусом КГЛ достоверно не установлена. По этим данным расчётные показатели инфицирования покусанных лиц, выраженного в развитии симптомов заболевания КГЛ, составили 0,3-0,4% [4]. По данным А.В. Топоркова и соавт. [5], при обследовании методом ОТ-ПЦР 207 пулов клещей, собранных в 4 районах Астраханской области, РНК вируса ККГЛ была обнаружена в 5 пробах (2,4%). В Ростовской области из 1429 особей клещей трех видов было изолировано 14 (1,0%) штаммов: 4 (0,3%) из H. marginatum, 9 (0.6%) из Rhipicephalus rossicus и 1 (0,1%) из Dermacentor marginatus. Среди 295 суспензий иксодовых клещей (28 537 экземпляров) методом ИФА антиген вируса ККГЛ был выявлен в 33 (1,1%) пробах. Вирусофорность H. marginatum и Rh. rossicus, снятых с КРС, составила соответственно 2,3 и 1,5%, D. marginatus H. marginatum, Rh. rossicus собранных на «флаг» - соответственно 0,9, 0,8 и 0,6%. В 66,7% случаев положительные результаты ИФА были подтверждены в ОТ-ПЦР [6]. С.В. Серегин и соавт. [7], на основании результатов множественного выравнивания нуклеотидных и выведенных аминокислотных последовательностей S-сегмента РНК, установили высокую степень гомологии трёх российских штаммов вируса ККГЛ и штамма из Болгарии (различия не превышали 1,25%). Ростовский штамм TI28044 оказался наиболее близким прототипному астраханскому штамму «Дроздов»: отличия в нуклеотидных и аминокислотных последовательностях составили 1,4/0,8%, нуклеотидные различия в кодирующей части S-сегмента между этими штаммами равнялись 1,2%. Различий между штаммом TI28044 и ставропольским штаммом HU12923 в нуклеотидных и аминокислотных последовательностях кодирующей части составили 1,5/0,8%. Полученные данные позволили авторам установить принадлежность исследованных штаммов к 1-й генетической группе вируса ККГЛ и сделать вывод об однородности популяции штаммов, циркулирующих в эндемичных регионах России на протяжении, как минимум, нескольких десятилетий. Результаты филогенетического анализа L-сег-мента в целом совпали с данными анализа малого сегмента. Характеристика последовательностей M-сегмента не представляет возможности четкой кластеризации российских штаммов по географическому принципу, так как у некоторых изолятов наблюдается переход из одной генетической группы в другую, что вероятно связано с реассортацией в средних геномах РНК. По данным Л.С. Карань и соавт. [8] уровень гомологии нуклеотидных последовательностей фрагмента S-сегмента РНК российских штаммов, штаммов из эндемичных стран южной Европы и Турции находится в пределах 94,3-100%. Среди них выделяются 2 кластера: 1-й содержит последовательности РНК, изолированные в Астраханской области, Ставропольском крае и частично в Ростовской области; 2-й - образцы из Волгоградской области и часть из других эндемичных регионов России. Изоляты из Косово, Албании и Турции обладают высоким уровнем гомологии и отличаются от болгарского штамма V-42. При анализе аминокислотных последовательностей фрагмента нуклеопротеина образуются 3 группы изолятов: 1-я включает все южнороссийские образцы (за исключением группы A-6 астраханских штаммов из клещей), 2-я - штамм M-42 из Болгарии, 3-я - группа A. Изоляты вируса ККГЛ, выделенные в разные годы в Ростовской области, не отличаются от штаммов волгоградской и астраханско-ставропольской группы. Штаммы своеобразной астраханской группы A и астраханско-ставропольской группы циркулируют одновременно на одних и тех же территориях. А.С. Волынкина и соавт. [9], в результате обследования методом ОТ-ПЦР 1300 пулов иксодовых клещей, собранных в 2012-2014 гг. в южном регионе Европейской части России, определили следующие показатели их заражённости вирусом ККГЛ: Hyalomma marginatum - 3,7%, H. scupense - 0,7%, Rhipicephalus rossicus - 0,3%, Boophilus annulatus - (0,1%). РНК-изоляты вируса ККГЛ были получены из 50-и ПЦР-позитивных проб H.marginatum, H. scupense, а также 225 проб сывороток крови больных ККГЛ. При частичном секвенировании S-, M- и L-сегментов РНК было установлено, что большинство из изолятов (270; 98,2%) относятся к генетической группе «Европа-1» (v), подразделяющуюся на 3 подгруппы: «Ставро-поль-Ростов-Астрахань-1» (Va), близкий штамму STV/29223 и кластеру «Волгоград-Ростов-Ставрополь» (Vb), а также ростовскому штамму ROS/TI/28044 и кластеру «Астрахань-2» (Vc) (KF496920, KF496921). Один изолят из сыворотки крови больного человека отнесён в группу «Африка» близкую штамму SPU415/85, а четыре, выделенные из H.marginatum, отличались от всех ранее охарактеризованных штаммов и сформировали новую группу «Kalmykia» (VIII). При сравнении полноразмерных геномов штаммов вируса ККГЛ, выделенных от больных в 1967 г. («Дроздов», Астрахань, «Кашманов», Ростов-на-Дону) и четырех штаммов, изолированных от больных людей в 2013 г., А.С. Климентовым и соавт. [10] установлена высокая степень их идентичности (98.5%) по S- и L-сегментам, что указывает на низкую эволюционную скорость накопления замен у вируса ККГЛ. При анализе последовательностей открытых рамок считывания M-сегментов идентичность новых астраханских штаммов со штаммом «Дроздов» составила около 98%, но всего 94% со штаммом «Кашманов» из Ростовской области, что сравнимо с генетическими дистанциями от штаммов из Турции и Косово. Эти результаты указывают на существование двух отдельных вариантов M-сегмента РНК внутри российской филогенетической группы вируса ККГЛ, которые могли возникнуть в результате реассортации. Настоящая работа посвящена изучению заражённости клещей Hyalomma marginatum, вирусом ККЛ и генотипированию РНК-изолятов штаммов вируса ККГЛ, циркулирующего в Астраханской области. Материалы и методы В 2016 г. ФКУЗ «Астраханской противочумной станции (ПЧС)» методом ОТ-ПЦР на наличие РНК вируса ККГЛ было обследовано 1746 экземпляров (171 пул) имаго клещей H. marginatum, снятых с крупного рогатого скота и объединённых в пулы по видам, полу, месту и времени сбора. Пулы голодных или полунапитавшихся клещей состояли из 10 экземпляров, напитавшихся особей обследовали индивидуально. Для обследования методом ПЦР пул клещей помещали в микроцентрифужную пробирку типа Эппендорф, добавляли 1 мл 70% этанола, встряхивали на вортексе, затем центрифугировали в течение 3-5 сек при 5000 об/мин на центрифуге MiniSpin («Eppendorf», Германия) после чего жидкость удаляли с помощью вакуумного отсасывателя. Затем в пробирку добавляли 1 мл 0,15 М раствора хлорида натрия, встряхивали на вортексе, снова центрифугировали и удаляли отмывочную жидкость. Для приготовления клещевых суспензий использовали стерильные охлаждённые фарфоровые ступки и пестики. В случае гомогенизации напитавшегося клеща, его предварительно прокалывали стерильной одноразовой иглой в нескольких местах для выхода крови. Индивидуальные пробы клещей растирали в 700 мкл или в 1-1,5 мл (если гомогенизировали пул клещей или напитавшегося клеща) охлажденного физиологического раствора хлорида натрия. Полученную суспензию центрифугировали 1 мин при 10 000 об/мин и отбирали 50 мкл надосадочной жидкости для выделения РНК. Выделение РНК вируса ККГЛ из суспензии клещей проводили с использованием комплекта реагентов «Рибо-преп» (производства ООО «ИнтерЛаб Сервис», Россия) в соответствии с инструкцией производителя. Проведение обратной транскрипции и ПЦР-амплификации с гибридизационно-флуорес-центной детекцией в режиме реального времени, анализ и учет результатов осуществляли на амплификаторе Rotor-Gene 6000 (Corbett Research, Австралия) с использованием набора реагентов «Ампли Сенс® CCHFV-FL» для выявления РНК вируса ККГЛ в биологическом материале (производства ООО «Интерлабсервис», Россия). В Ставропольском ПЧИ индикацию вируса ККГЛ в РНК-позитивных суспензиях клещей Hyalomma marginatum, полученных из Астраханской ПЧС, осуществляли методом ПЦР с использованием аналогичного набора реагентов для выявления РНК вируса ККГЛ «АмплиСенс® CCHFV-FL» (ООО «Интерлабсервис», Россия). Экстракцию РНК из образцов клинического и полевого материала и получение комплементарной ДНК производили с помощью наборов реагентов «РИБО-преп» и «РЕВЕРТА-L-100» (ООО «Интерлабсервис», Россия). Генетическую идентификацию вируса ККЛ проводили методом секвенирования трёх участков генома вируса: фрагментов 115-652 кодирующей области малого (S) сегмента генома (538 п.о), фрагмента 4620-5075 кодирующей области среднего (M) сегмента генома (435 п.о.) и фрагмента 105-541 кодирующей области большого (L-) сегмента генома (437 п.о.) с последующим филогенетическим анализом (позиции фрагментов приводятся по полноразмерным последовательностям S-, M-, и L-сегментов штамма ROS/HUVLV-100, GenBank DQ206447, DQ206448, AY995166, соответственно). Нуклеотидные последовательности фрагментов генома изолятов вируса ККГЛ, полученные в данной работе, сравнивали с имеющимися последовательностями штаммов вируса, полученными из базы данных GenBank. Анализ уровня генетического родства и построение филогенетических деревьев проводили в программе Mega 5.05 с использованием метода Neigboor joining, по алгоритму Kimura-2, статистическую достоверность топологии филогенетических деревьев проверяли с помощью Bootstrap-анализа, вычисления проводили для 1000 повторов. Генотип/субтип изолятов вируса ККГЛ определяли на основании сравнения кластеровой позиции изолята при проведении филогенетического анализа по фрагментам 3 сегментов (S-, M- и L-) генома вируса. Результаты и обсуждение Все 26 суспензий H. marginatum клещей (№№ 1-26), положительных на РНК вируса ККГЛ в Астраханской ПЧС, оказались позитивными при обследовании методом ОТ-ПЦР в Референс-центре по мониторингу ККГЛ в Ставропольском ПЧИ. Были установлены нуклеотидные последовательности участков генома 14 изолятов РНК, (№№ 2, 3, 4, 11, 13, 14, 15, 16, 20, 21, 23, 24, 25, 26) - фрагментов кодирующей области S-сегмента (538 п.н., 179 aa) M-сегмента (435 п.н., 145 aa) и L-сегмента (147 п.н., 147 aa). Секвенированные последовательности были использованы для проведения филогенетического анализа. Выполнить секвенирование фрагментов S-, M- и L- сегментов генома 12 изолятов вируса ККГЛ, выявленных в суспензиях клещей (№№ 1, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12 17, 18, 19, 22) не удалось вследствие низкой вирусной нагрузки в образцах. Филогенетический анализ по фрагментам S-, M- и L-сегментов генома вируса показал, что исследуемые образцы кластеризуются с ранее охарактеризованными образцами субтипов Va - «Ставрополь-Ростов-Астрахань-1» (типовой штамм STV/29233), Vb - «Волгоград-Ростов-Ставрополь» (типовой штамм ROS/T128044) и Vc (типовой изолят 5185-ASTR/HU-2011) генотипа «Европа-1» (V), характерного для территории юга России. Генотип/субтип изолятов вируса ККГЛ, определяли на основании сравнения кластеровой позиции изолята при проведении филогенетического анализа по фрагментам 3 сегментов (S-, M- и L-) генома вируса (см. таблицу). При проведении филогенетического анализа было установлено, что изоляты РНК вируса ККГЛ, выявленные в двух образцах суспензий клещей № 16, 26, по S-сегменту входят в подгруппу Vc «Астрахань-2», по M-сегменту - в подгруппу Vb «Волгоград-Ростов-Ставрополь», по L-сегменту - в подгруппу Va «Ставрополь-Ростов-Астрахань» и относятся к «реассортантному» генетическому варианту (S-Vc; M-Vb; L-Va;) генотипа «Европа-1». Для 6 изолятов вируса ККГЛ, выявленных в 5 пробах суспензий клещей №№ 2, 11, 20, 21, 24 не удалось секвенировать нуклеотидную последовательность фрагментов всех сегментов генома. Нуклеотидные последовательности фрагмента S-сегмента изолятов в пределах субтипа Vc, оказались практически идентичными, обнаружена лишь 1 нуклеотидная замена между изолятами этого субтипа. Изоляты, формирующие субтип Vc на филогенетическом дереве по фрагменту S сегмента, при анализе по фрагменту М-сегмента входили в группу Vb, при анализе по фрагменту L-сегмента - в группу Va. Средние различия нуклеотидных последовательностей фрагмента M-сегмента в пределах группы Vb составили 1,4 %, (диапазон 0,5-2,3 %), нуклеотидные различия изолятов 16-ASTR/TI-2016 и 26-ASTR/TI-2016 от остальных штаммов субтипа Vb - составили 1,6-2,3 %. Средние различия нуклеотидной последовательности фрагмента L-сегмента в пределах субтипа Va составили 0,9 % (диапазон 0-1,8 %), нуклеотидные различия изолятов 11-ASTR/TI-2016, 16-ASTR/TI-2016 и 26-ASTR/TI-2016 от остальных штаммов субтипа Va - составили 0,5-1,8 %. Средние различия нуклеотидных последовательностей в пределах субтипа Va составили по фрагменту S-сегмента - 1,1 % (диапазон - 0-2,2 %). по фрагменту M-сегмента - 1,6 % (диапазон - 0-2,3 %), по фрагменту L-сегмента - 0,9 % (диапазон 0-1,8 %). Различия нуклеотидных последовательностей между изолятами субтипов Va и Vc по фрагменту S-сегмента составили 4,5 %, (диапазон 3,3-4,5 %), между изолятами субтипов Va и Vb по фрагменту M-сегмента - 5,7 % (диапазон 4,6-6,4 %). Анализ выведенной аминокислотной последовательности фрагмента кодирующей области S-сегмента позволил выявить 4 аминокислотные замены между изолятами субтипов Va и Vc. Аминокислотных различий между изолятами субтипов Va и Vb не выявлено. Различия выведенной аминокислотной последовательности фрагмента кодирующей области M-сегмента между изолятами субтипов Va и Vb составили 3,4-6,9 % (5-10 аминокислотных замен). Изоляты 16-ASTR/TI-2016 и 26-ASTR/TI-2016 от остальных штаммов субтипа Vb по аминокислотной последовательности фрагмента M-сегмента отличались на 1,37-3,4 % (3-5 аминокислотных замен). Аминокислотных различий между изолятами субтипов Va и Vb при анализе выведенной аминокислотной последовательности фрагмента кодирующей области L-сегмента не обнаружено. Среди изолятов субтипа Va выявлены единичные аминокислотные замены. Уникальные аминокислотные замены, отличающих изоляты 11-ASTR/TI-2016, 16-ASTR/TI-2016 и 26-ASTR/TI-2016 от других изолятов субтипа Va, отсутствовали. Заключение По данным обследования методом ОТ-ПЦР 1746 экземпляров клещей H. marginatum, собранных в Астраханской области, их зараженность вирусом ККГЛ составила 1,5%, что сопоставимо с результатами более ранних исследований, выполненных в разные годы в Астраханской и Ростовской областях и свидетельствующих о таких показателях вирусофорности как 0,1; 0,9; 2,4; 0,6; 0,9 и 2,3% (4, 5, 6, 7). В результате секвенирования фрагментов генома (четырнадцати из 26 изолятов РНК установлена их принадлежность к генотипу «Европа-1». Семь изолятов из 14 относятся к субтипу Va «Ставрополь-Ростов-Астрахань», два представляют реассортантный генетический вариант S-Vc; M-Vb; L-Va.

About the authors

Elena V. Vakalova

Astrakhan anti-plague station of the Federal Service for the Oversight of Consumer Protection and Welfare

Author for correspondence.
Email: e.vakalova@yandex.ru

MD, the physician of the bacteriological laboratory of the Astrakhan anti-plague station of the Federal Service for the Oversight of Consumer Protection and Welfare Russia

3, Kubanskaya Street, 414000 Astrakhan, Russia

A. S Volynkina

Stavropol Scientific Research Anti-Plague Institute of the Federal Service for the Oversight of Consumer Protection and Welfare

Email: volyn444@mail.ru

науч. сотр. лаб. природно-очаговых инфекций ФКУЗ Ставропольский противочумный институт Роспотребнадзора

13-15, Sovetskaya Str., 355035 Stavropol, Russia

E. S Kotenev

Stavropol Scientific Research Anti-Plague Institute of the Federal Service for the Oversight of Consumer Protection and Welfare

Email: egor_kotenev@mail.ru

канд. биол. наук, зав. лаб. природно-очаговых инфекций ФКУЗ Ставропольский противочумный институт Роспотребнадзора

13-15, Sovetskaya Str., 355035 Stavropol, Russia

L. N Kulikova

The center of hygiene and epidemiology for the Astrakhan region of the Federal Service for the Oversight of Consumer Protection and Welfare

Email: info@eco-vector.com

энтомолог ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии» в Астраханской области»

122/89, Nikolaya Ostrovskogo Str., Astrakhan region, 414024 Astrakhan, Russia

N. V Viktorova

Astrakhan anti-plague station of the Federal Service for the Oversight of Consumer Protection and Welfare

Email: info@eco-vector.com

зоолог-паразитолог ФКУЗ «Астраханская противочумная станция» Роспотребнадзора.

3, Kubanskaya Street, 414000 Astrakhan, Russia

References

Supplementary files