ANTIBIOTIC RESISTANCE OF VIBRIO CHOLERAE O1 EL TOR ISOLATED ON THE TERRITORY OF THE RUSSIAN FEDERATION IN 2006-2015

Full Text

Холера - особо опасная инфекция, и в новом тысячелетии продолжает уносить миллионы жизней. По данным ВОЗ [1], с 2006 по 2015 гг. в мире зарегистрировано 2 408 256 случаев этого заболевания в 115 странах. Завозы холеры с выделением холерных вибрионов O1 биовара Эль Тор от больных и из объектов окружающей среды имеют место и в России [2]. Во всем мире наблюдают увеличение числа холерных вибрионов, обладающих множественной устойчивостью к антибактериальным препаратам [3]. Постоянное изучение антибиотикорезистентности и молекулярных механизмов ее реализации может помочь в разработке мероприятий, предупреждающих рост количества устойчивых штаммов. Цель исследования - анализ антибиотикорезистентности и молекулярных механизмов устойчивости штаммов холерных вибрионов О1 Эль Тор, выделенных от больных и из объектов окружающей среды на территории Российской Федерации в 2006-2015 гг. Материал и методы Штаммы. Из музея живых культур Ростовского-на-Дону противочумного института были взяты штаммы Vibrio cholerae О1 El Tor, выделенные на территории Российской Федерации в 2006-2015 гг.: от людей - 8 штаммов ctxA+ tcpA+; из объектов окружающей среды - 2 штамма ctxA+ tcpA+ и 24 штамма ctxA- tcpA+. Антибиотикочувствительные штаммы V. cholerae О1 Р-5879 ctx+tcpA+toxR+ (1972 г., Таганрог) и V. cholerae non О1/ non О139 Р-9741 (КМ 162) (ctxA- tcpA-) использовали в качестве контроля. Чувствительность/устойчивость изучаемых штаммов к антибактериальным препаратам определяли методом серийных разведений в плотной питательной среде [агар Мюллера-Хинтона, рН 7,5 (HIMEDIA, Индия)] в соответствии с МУК 4.2.2495-09 [4]. В работе использовали следующие антибактериальные препараты: доксициклин, тетрациклин, левомицетин (хлорамфеникол), рифампицин, стрептомицин, ампициллин, фуразолидон - препараты отечественного производства; налидиксовую кислоту (невиграмон, Chinoin, Венгрия), ципрофлоксацин (квинтор, ТоррентФарм.Лтд, Индия), триметоприм/сульфаметоксазол (бикотрим, Adgio, Индия), цефтриаксон (офрамакс, Ranbaxy, Индия) [5]. Доверительные интервалы для частот и долей рассчитывали по методу Вальда с коррекцией по Агрести-Коуллу с вероятностью 95% [6]. Изучение молекулярных механизмов устойчивости холерных вибрионов проводили с помощью типирования в мультилокусной ПЦР по методике, описанной ранее [7]. Результаты Все изученные штаммы были чувствительны к тетрациклинам (МПК = 0,25-1 мг/л), канамицину (МПК = 4-8 мг/л), гентамицину (МПК = 2,0-4,0 мг/л), ампициллину (МПК = 4-8 мг/л), цефтриаксону (МПК = 1-2 мг/л), рифампицину (МПК = 1-4 мг/л) (табл. 1). В 2006 г. в Мурманской области, в 2010, 2012, 2014 гг. в г. Москве от больных холерой, прибывших из Индии, были выделены штаммы V. cholerae El Tor. Эти культуры имели ПЦР-генотип, соответствующий таковым большинства токсигенных штаммов холерных вибрионов, циркулирующих в эндемичных очагах, в том числе в Индии [8]. Антибиотикограммы этих штаммов показали устойчивость к стрептомицину (МПК = 64-128 мг/л), фуразолидону (МПК = 64 мг/л), триметоприму/сульфаметоксазолу (МПК = 64/320-128/640 мг/л), налидиксовой кислоте (МПК = 64-256 мг/л) с повышением значений МПК фторхинолонов на 1-2 порядка в сравнении с контрольными штаммами (табл. 1). Результаты исследований в Индии показали, что большинство штаммов V. cholerae О1, выделенных в указанные годы, проявляют резистентность к данным антибактериальным препаратам [9]. Так, штаммы V. cholerae O1, выделенные от госпитализированных диарейных больных в штате Орисса (Индия) в 2004-2006 гг., имели устойчивость к триметоприму/сульфаметоксазолу, фуразолидону и налидиксовой кислоте [10]. Анализ антибиотикограмм клинических штаммов V. cholerae, выделенных в Индии в 2009 г. (Калькутта) и в 2010 г. (Орисса), показал резистентность большинства штаммов к триметоприму/сульфаметоксазолу, налидиксовой кислоте и стрептомицину. Также встречались культуры устойчивые к стрептомицину, тетрациклину, хлорамфениколу, ампициллину и ципрофлоксацину [11-13]. Все штаммы, выделенные из объектов окружающей среды (100%), несущие гены холерного токсина и пилей адгезии (ctxA+ tcpA+), обладали устойчивостью к левомицетину (МПК = 8,0 мг/л), стрептомицину (МПК = 128,0 мг/л), фуразолидону (МПК = 64,0 мг/л), триметоприму/сульфаметоксазолу (МПК = 64,0/320,0), налидиксовой кислоте (МПК = 64,0-256,0 мг/л) с повышением значений МПК фторхинолонов (табл. 1). Среди штаммов, выделенных из объектов окружающей среды и лишенных генов холерного токсина, но содержащих гены пилей адгезии tcpA (ctxA- tcpA+), 4,1% (< 0,01-22%), обладали устойчивостью к левомицетину и стрептомицину (МПК = 8 и 32 мг/л соответственно), 8,3% (1,2-27%) - к налидиксовой кислоте (МПК = 16-64 мг/л), 41,6% (24,4-61,2%) - к триметоприму/сульфаметоксазолу (МПК = 16/80 мг/л), 83,3% (63,5-94%) - к фуразолидону (МПК = 64 мг/л). Штаммы с такой генетической характеристикой способны вызывать эпидемические осложнения, как это было в 2005 г. в Ростовской области [14], и требуют пристального внимания при проведении мониторинга. Анализ профилей антибиотикорезистентности изученных штаммов продемонстрировал, что холерные вибрионы ctxA+ tcpA+, выделенные от человека и из объектов окружающей среды, характеризовались множественной антибиотикорезистентностью, спектр которой включал от 4 до 5 маркеров устойчивости. Холерные вибрионы, лишенные гена холерного токсина, в 41,6 (24,4-61,2)% и 33,4 (17,8-53)% случаев были устойчивы к 1 и 2 препаратам соответственно, а 8,4 (1,2-27)% этих микроорганизмов обладали множественной антибиотикорезистентностью и содержали 3-5 маркеров устойчивости. При этом 16,6 (6-36,5)% культур обладали чувствительностью ко всем изученным антибактериальным препаратам (см. табл. 2). Таким образом, антибиотикограммы штаммов холерных вибрионов Эль Тор свидетельствуют о встречаемости различных r-детерминант резистентности и разнообразии их сочетаний. Выделялись культуры, как устойчивые всего к одному препарату (фуразолидону), так и имеющие множественую антибиотикорезистентность (3-5 антибактериальных препаратов), включающую еще и стрептомицин, левомицетин, триметоприм/сульфаметоксазол, налидиксовую кислоту (табл. 2). В литературе немало сообщений о выделении антибиотикоустойчивых культур возбудителя холеры в различных странах мира. Штаммы V. cholerae О1, резистентные к триметоприму/сульфаметоксазолу, фуразолидону, налидиксовой кислоте, стрептомицину и с умеренной устойчивостью к левомицетину (хлорамфениколу), были выделены в 2001 г. в Киншасе (запад Конго) [15]. В Кении в 2007-2008 гг. выделялись штаммы холерных вибрионов, резистентные к триметоприму/сульфаметоксазолу, стрептомицину и с промежуточной устойчивостью к налидиксовой кислоте, хлорамфениколу и имипенему [16]. В Карнатаке в 2013 г. были зарегистрированы штаммы V. cholerae с устойчивостью к 4-5 группам препаратов, к которым относились ампициллин, триметоприм/сульфаметоксазол, нитрофурантоин, карбенициллин, цефалоспорины 3-го поколения [17]. В Иране более половины холерных вибрионов, выделенных в 2012-2013 гг., обладали множественной антибиотикорезистентностью и были устойчивы к стрептомицину, эритромицину, триметоприму/сульфаметоксазолу и тетрациклину [18]. В Китае холерные вибрионы О1 Эль Тор имели гены устойчивости к 4-6 антибактериальным препаратам, в том числе к налидиксовой кислоте, тетрациклину и триметоприму/сульфаметоксазолу [19]. Штаммы, выделенные в Мексике в 2013 г., имели промежуточную устойчивость к ампициллину и хлорамфениколу, пониженную чувствительность к ципрофлоксацину и были устойчивы к фуразолидону и триметоприму/сульфаметоксазолу [20]. В Гане холерные вибрионы, выделенные в 2011, 2012 и 2014 гг., были устойчивы к триметоприму/сульфаметоксазолу, ампициллину и имели пониженную чувствительность к ципрофлоксацину [21]. Разнообразие маркеров резистентности и высокая их вариабельность показаны нами ранее в отношении холерных вибрионов, выделенных в 1983-2005 гг. [22]. В этот период клинические изоляты V. cholerae О1 El Tor имели от 1 до 10 r-детерминант устойчивости в разных сочетаниях. Среди V. cholerae El Tor, выделенных до 2001 г., отсутствовали штаммы, резистентные к налидиксовой кислоте. Впервые такие штаммы V. cholerae El Tor на территории России были зарегистрированы в 2001 г. во время вспышки холеры в г. Казани [23]. Настоящее исследование продемонстрировало, что с 2006 г. все выделенные штаммы обладали устойчивостью к налидиксовой кислоте и повышенными значениями фторхинолонов. В последние годы холерные вибрионы, устойчивые к налидиксовой кислоте и фторхинолонам, выделяются во всем мире. Такие штаммы выделены от больных диареей в 2006-2009 гг. в Ю. Индии [24], в 2007-2010 гг. в Непале [25], в 1961-2010 гг. в Китае [26], в 2010 г. в Нигерии [27] и др. Резистентность к налидиксовой кислоте может сопровождаться снижением эффективности in vivo фторхинолонов, что затрудняет выбор средств этиотропной терапии и профилактики холеры, вызванной штаммами с множественной антибиотикорезистентностью [23]. Следующий этап работы - выяснение молекулярных механизмов устойчивости штаммов V. cholerae. Известно, что одним из путей формирования множественной устойчивости к антибиотикам у этих возбудителей служит аккумуляция индивидуальных генов антибиотикорезистентности в составе специализированных генетических структур - интегронов, плазмид, трансмиссивных ICEs-элементов [7]. На сегодняшний день основную роль в приобретении и распространении детерминант лекарственной устойчивости играют SXT-элементы [28], поиск которых в штаммах V. cholerae мы и предприняли. С этой целью отобрали множественно резистентные культуры V. cholerae El Tor Ogava (ctxA+ tcpA+): № 19241 (выделен из морской воды в Таганроге Ростовской области в 2011 г.) с устойчивостью к налидиксовой кислоте, стрептомицину, фуразолидону, триметоприму/сульфаметоксазолу, промежуточной устойчивостью к левомицетину (хлорамфениколу) и № 19243 (выделен от больного в Москве в 2012 г.) с устойчивостью к налидиксовой кислоте, стрептомицину, фуразолидону, триметоприму/сульфаметоксазолу. Типирование указанных штаммов в мультилокусной ПЦР продемонстрировало, что они несут в составе генома интегративный конъюгативный элемент SXTET типа, обозначенный ICEVchRus3, вариабельный регион VR III которого содержит гены резистентности к стрептомицину (strB) и сульфометаксазолу (sulII), горячая точка HS3 - ген резистентности к триметоприму (dfrА1). По данным литературы, в настоящее время большинство штаммов V. cholerae содержат данные элементы [9, 13, 27]. Методом сравнительной геномики SXT-элементы были разделены на 5 основных групп с определенным генетическим составом, что свидетельствует о высокой частоте рекомбинационных событий в пределах данной генетической структуры [29]. Заключение Таким образом, у изученных культур выявлена устойчивость к традиционно применяемым для лечения холеры антибактериальным препаратам. Штаммы содержали от 1 до 5 маркеров антибиотикорезистентности, при этом большинство из них обладали множественной антибиотикоустойчивостью и были резистентны к стрептомицину, фуразолидону, триметоприму/ульфаметоксазолу. Все клинические изоляты, а также эпидемиологически значимые штаммы, выделенные из объектов окружающей среды, обладали устойчивостью к налидиксовой кислоте и имели повышенные значения МПК фторхинолонов, что могло приводить к снижению или утрате их эффективности. Появление хинолонорезистентности у штаммов V. cholerae El Tor с сопутствующей множественной лекарственной устойчивостью ограничивает выбор средств этиотропной терапии и усугубляет неблагоприятный прогноз по холере. Исследование молекулярных механизмов устойчивости штаммов V. cholerae показало наличие в них SXT-элементов с генами резистентности к стрептомицину, триметоприму и сульфометоксазолу. Регулярное исследование антибиотикочувствительности холерных вибрионов позволяет выявить тенденции в ее изменении, дает возможность осуществлять правильный подбор средств для лечения холеры и использовать результаты в эпидемиологическом надзоре. Для предупреждения роста количества устойчивых штаммов назначение антибактериального препарата для этиотропной терапии необходимо проводить с учетом антибиотикограммы выделенной от конкретного больного культуры с бактериологическим контролем в ходе лечения.

About the authors

L. A Egiazaryan

Rostov-on-Don Research Institute for Plague Control of the Federal Service on Consumer Rights Protection and Human Welfare Supervision

117, Maksima Gorkogo str., Rostov-on-Don, 344002, Russian Federation

N. A Selyanskaya

Rostov-on-Don Research Institute for Plague Control of the Federal Service on Consumer Rights Protection and Human Welfare Supervision

Email: labbiobez@mail.ru
117, Maksima Gorkogo str., Rostov-on-Don, 344002, Russian Federation

I. B Zakharova

Volgograd Research Institute for Plague Control of the Federal Service on Consumer Rights Protection and Human Welfare Supervision

7, Golubinskaya str., Volgograd, 400131, Russian Federation

M. V Podshivalova

Volgograd Research Institute for Plague Control of the Federal Service on Consumer Rights Protection and Human Welfare Supervision

7, Golubinskaya str., Volgograd, 400131, Russian Federation

E. A Bereznyak

Rostov-on-Don Research Institute for Plague Control of the Federal Service on Consumer Rights Protection and Human Welfare Supervision

117, Maksima Gorkogo str., Rostov-on-Don, 344002, Russian Federation

L. M Verkina

Rostov-on-Don Research Institute for Plague Control of the Federal Service on Consumer Rights Protection and Human Welfare Supervision

117, Maksima Gorkogo str., Rostov-on-Don, 344002, Russian Federation

A. V Trishina

Rostov-on-Don Research Institute for Plague Control of the Federal Service on Consumer Rights Protection and Human Welfare Supervision

117, Maksima Gorkogo str., Rostov-on-Don, 344002, Russian Federation

References

Supplementary files