Application of immunoassay systems for diagnosis of dengue fever

Full Text

За последние 10 лет заболеваемость лихорадкой Денге (ЛД) выросла примерно в 30 раз. Среди 2,5 млрд человек, проживающих в эндемичных районах мира, ежегодно регистрируется до 100 млн больных классической формой этого заболевания и 500 тыс. больных ЛД с геморрагическим синдромом (ГЛД) [1]. В связи с развитием массового туризма участились случаи завоза этого заболевания на неэндемичные территории, в том числе и в РФ [2]. За последние годы среди больных, госпитализированных в Инфекционную клиническую больницу № 1 нами верифицировано 157 случаев ЛД [3]. Имеется информация о случаях ЛД в Тюмени, Санкт- Петербурге, Новосибирске, Омске, Хабаровске и Приморском крае [4, 5]. Эти данные указывают на необходимость создания отечественных ИФА тест- систем для ранней диагностики ЛД. Метод ИФА- IgM при обследовании пациентов в острый период ЛД является основным в серологической экспресс- диагностике и позволяет проводить дифференциальную диагностику родственных флавивирусных инфекций [6, 7]. Согласно основной версии, ГЛД развивается вследствие последовательного инфицирования ге- терологичными вирусами Денге или обусловливается присутствием в крови больного анамнестических антител к другим флавивирусам, например желтой лихорадки (ЖЛ), лихорадки Западного Нила (ЛЗН), японского энцефалита (ЯЭ) и др. [8, 9]. В подобных случаях группоспецифические IgG- антитела могут быть обнаружены начиная с острого периода болезни, что является важным маркером возможного развития ГЛД [9, 10]. Цель исследования заключалась в определении эффективности использования наших экспериментальных ИФА-тест-систем для диагностики ЛД и дифференциации этого заболевания от других фла- вивирусных инфекций. геометричное титров (MX) и среднеквадратического отклонения (оД рассчитывали по формулам: - Mxl п -1 Материалы и методы Сыворотки крови больных ЛД, КЭ, ЛЗН. Сыворотки больных КЭ получены из ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Вологодской области»; сыворотки крови от больных ЛЗН - из вирусологической лаборатории ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Астраханской области», Астрахань; сыворотки больных ЛД - из Инфекционной клинической больницы № 1, Москва. Выражаем благодарность сотрудникам этих учреждений за предоставление материалов. Метод ИФА-IgM. Определение специфических IgM-антител к вирусам Денге, ЗН, КЭ проводили методом MAC-ELISA [2]. В каждом опыте использовали специфические или нормальные (контрольные) антигены, а также контрольные, позитивные на IgM-антитела, сыворотки больных. Реакцию считали положительной, если отношение экстинк- ции опытных и контрольных образцов составляло не менее 3,0 (при оптической плотности (ОП) не ниже 0,3 для опытных образцов и не выше 0,1 в контроле). Метод ИФА-IgG. Определение специфических IgG-антител к вирусам Денге, ЗН, КЭ проводили методом ИФА-IgG [11] в 96-луночных полистироло- вых планшетах с сорбированными поликлональными мышиными противовирусными антителами IgG. Остальные реагенты вносили в следующей последовательности: блокирующий раствор 1% бычьего сывороточного альбумина, специфичный вирусный антиген (или нормальный контрольный антиген), обследуемые сыворотки и мышиные антитела иммуноглобулинам IgG человека, меченные перокси- дазой хрена. Реакцию учитывали также как при постановке MAc-ELISA. ЛД (n = 117) КЭ (n = 24) ЛЗН (n = 24) ЛД (n = 117) КЭ (n = 24) ЛЗН (n = 24) ЛД (n = 117) КЭ (n = 24) ЛЗН (n = 24) Положительные 117 - - - 24 2 - - 24 Слабоположительные - - 1 2 - - 4 2 - Отрицательные - 24 23 115 - 22 113 22 - Категория ИФА-^М-денге ИФА-^М-КЭ ИФА-^М-ЗН исследованные сыворотки больных Таблица 1 Данные исследования сывороток крови больных ЛД, КЭ и ЛЗН в ИФА-IgM в гомологичных и гетерологичных тест-системах Тест-система Статистические методы. Статистическую обработку результатов исследований проводили по стандартным методикам (Прохоров Ю.В., 1973; Ту- тубалин В.Н., 1992; Ширяев А.Н.,1989). Среднее где , x1, xT.., xn - это n реализаций случайной величины X. Поскольку титры специфических антител, выявляемых у больных методом ИФА, не подчиняются нормальному (гауссовому) распределению. для непараметрической оценки достоверности различий двух статистических выборок использовали метод Манна-Уитни. Уровень значимости был принят p < 0,05. Математическая и статистическая обработка результатов проводилась при помощи программ Microsoft Office Excel 2003 и Microsoft Office Access 2003. Результаты исследования В МАС-ELISA были обследованы сыворотки крови больных, содержащие специфические IgM антитела: 117 образцов от 110 больных ЛД и по 24 сыворотки больных КЭ и ЛЗН для определения возможности дифференциальной диагностики этих инфекций. При исследовании сывороток в гомологичных тест-системах специфические антитела выявлялись в 100% случаев. В тест-системе ИФА-^М-денге слабоположительной оказалась только одна сыворотка от больного ЛЗН (4,2%). В тест-системе ИфА-^М-КЭ среди гетерологичных сывороток крови положительными оказалось 2 образца от больных ЛЗН (8,3%) и слабоположительными 2 сыворотки больных ЛД (1,7%). Результаты тестирования сывороток в тест-системе ИФА-^М-ЗН оказались следующими: 4 слабоположительных пробы больных ЛД (3,4%) и 2 слабоположительные пробы больных КЭ (8,3%) (табл. 1). Эти данные свидетельствуют о возможности использования метода ИФА-IgM для дифференциальной диагностики флавивирусных заболеваний c использованием качественной и количественной оценки результатов. Таблица 2 Данные исследования в ИФА-IgM сывороток крови больных ЛД Дни от начала заболевания Число положительных сывороток крови больных ЛД Средние значения титров log±a абс. 1-3-й 12 7,4±1,0 1:167 4-6-й 34 10,6±1,8 1:1609 7-9-й 50 11,5±1,6 1:2862 10-25-й 21 12,2±1,2 1:4781 Всего 117 10,4±1,4 1:2355 Таблица 3 Данные исследования в ИФА-IgG сывороток крови больных ЛД Дни от начала заболевания Число обследованных сывороток крови больных ЛД Положительные результаты по IgG Средние значения титров % абс. log±a абс. 1-3-й 12 8,3 1 6,6 1:100 4-6-й 34 17,6 6 8,9±1,4 1:717 7-9-й 50 34,0 17 10,2±1,6 1:1913 10-25-й 21 100,0 21 11,7±1,0 1:4210 Всего 117 38,5 45 9,3±1,0 1:1735 Средние геометрические значения титров антител IgM в сыворотках больных ЛД составляли 7,4±1,0 log2 (1:167) на 1-3-й день (p < 0,001), резко возрастая до 10,6±1,8 log2 (1:1609) к концу первой недели (p < 0,04). После 10-го дня от начала заболевания этот показатель оказался выше, чем на 7-9-й день, и составлял 12,2±1,2 log2 (1:4781) (p < 0,02). В этот период в 11 из 21 образца были получены высокие значения титров ^М 1:1600-1:12 800. Наиболее демонстративной выглядит практически троекратная разница в титрах при обследовании сывороток крови, взятых на 4-6-й и 10-25-й день заболевания (p < 0,002). Средний показатель титров 1: 4781 сохраняется до конца месяца, на более высоком уровне (p < 0,01 иp < 0,005), чем на 4-6-й и 7-0-й день (табл. 2). При обследовании парных сывороток от 7 больных, у 4 наблюдалась выраженная сероконверсия антител от 1:100 до 1:800 (7-й день); 1:1600 (9-й день); 1:1600 (10-й день) и 1:6400 (19-й день). В двух случаях обнаружены устойчивые титры IgM, в одном - незначительное снижение титров. В тест-системе ИФА-денге-IgG были протестированы те же 117 сывороток. Специфические IgG в периоды на 1-3, 4-6, 7-9-й и 10-25-й дни от начала заболевания были обнаружены соответственно в 8,3; 17,6; 34 и 100% случаев. Средние геометрические значения титров IgG в эти сроки составляли 6,6 log2 (1: 100);8,9±1,4 log2 (1:717); 10,2±1,6 log2 (1:1913) и 11,7±1,0 log2 (1:4210). Титры IgG на 10-25-й день от начала заболевания оказались достоверно выше, чем на 4-6 и 7-9-й дни (p < 0,001), достигая у некоторых пациентов значений 1:12 800 и 1:25 600, Положительный результат обследования одного больного на 3-й день болезни, возможно, связан со вторичной инфекцией Денге либо с присутствием анамнестических антител к гетерологичному флавивирусу (табл. 3). Отсутствие IgG в острой фазе заболевания обычно является признаком первичной инфекции Денге. Обнаружение специфических IgG в крови на 3-й день болезни может указывать на возможность развития ГЛД. Сопоставление значений ОП (для разведения 1:100)с титрами IgG-антител к вирусам денге, ЗН, КЭ указывает на прямую зависимость этих величин. Так, ОП 0,5 соответствует титру антител 1:200; ОП 0,6-0,7 - титрам 1:400-1:800; при ОП 1,7-2,2 титры IgG-антител достигают значений 1:12 800, 1:25 600, 1:51 200. Установленная корреляция определяет возможность использования значения ОП для количественной оценки концентрации специфических IgG- антител в сыворотках крови больных ЛД, ЛЗН и КЭ (рис. 1). Рис. 1. Зависимость оптической плотности (ОП) образцов сывороток крови больных ЛЗН (а), КЭ (б), ЛД (в) в разведении 1:100 от титра антител в гомологичных тест-системах. 2-| on 1 - ИФА-денге-lgG 0 2 on ИФА-КЭ-lgG ИФА-ЗН-lgG 1 cj i- h- от со i- C\J см ю со су о со та- со to ю ет со oo ю ih- O T- O) CM CVJ 01- CM CD ID CO OOJCOOCOtO CD (О О 00 О '-OOO'-OOi-OO'-i-OOOOCOOOOi-'-ОШ t- CVJ CM CVJ1- CVJ CVJ CVJ CVJ CVJ i- *- C\J CVJ CVJ CM i- CM CVJ CM i- CM CVJ i- Больные ЛД соотт-ои^ютг'-г-.сосоетоососоюсчюцэ юо)’Ф<осмг--0)1-о)1-сою N. Г- СО СО СО 00 00 СО СО ID CVJ О «ten СО СО CM CM COCVJOOOOOOi-l'-f'-CO S.'«SSSSSSNSSSNNSSSSS см см с» со со со оо со см см см см Больные ЛЗН Больные КЭ Рис. 2. ОП сывороток крови больных Денге, ЛЗН и КЭ в гомологичных и гетеро- логичных тест-системах ИФА-IgG. Линия тренда отображает значение ОП 0,3, выше которого сыворотки считаются положительными. Для определения дифференциальной способности тест-систем ИФА-IgG-денге, ИФА-IgG-^ и ИФА-IgG-ЗН мы обследовали образцы сывороток крови больных ЛД (n = 24), КЭ (n = 12) и ЛЗН (n = 19), содержащие специфические IgG-антитела, выявляемые в гомологичных и гетерологичных тест- системах. В тест-системе ИФА-IgG-денге положительными оказались 6 (31,6%) сывороток больных ЛЗН и 4 (33,3%) сыворотки больных КЭ. Слабоположительными - по 2 сыворотки из гетерологичных групп. При обследовании тех же образцов в тест-системе ИФА-IgG-^ положительными оказались 16 (66,7%) сывороток от больных ЛД и слабоположительными 2 сыворотки больных ЛД и 1 образец от больного КЭ (8,3% в обоих случаях). В результате тестирования в тест-системе ИФА- IgG-ЗН обнаружено18 положительных сывороток крови от больных ЛД и 9 сывороток больных КЭ (75% в обоих случаях) и 1 слабоположительная проба больного ЛД (4,2%). В большинстве случаев количество сывороток, выявляемых в гомологичной тест-системе, превалирует над числом сывороток, выявляемых в гете- рологичных тест-системах. Особенно это касается сывороток от реконвалесцентов ЗН и КЭ, однако в гетерологичных тест-системах они нередко учитываются как положительные и слабоположительные. Например, в тест-системе ИФА-денге-IgG среди гетерологичных образцов положительными и слабоположительными оказались 45% сывороток, в тест- системе ИФА-КЭ-IgG этот показатель составил 44,2%, а в ИФА-ЗН- IgG - 77,8% (рис. 2). Метод ИФА-IgG практически не пригоден для дифференциальной диагностики флавивирусных инфекций по причине выраженного перекрестного взаимодействия гетерологичных IgG-антител. Например, сыворотка больного КЭ (№ 1271/черный столбец) наиболее активно реагировала в тест-системе ИФА-ЗН-IgG. Подобные результаты наблюдались и при обследовании ряда сывороток от больных ЛД в тест-системе ИФА-ЗН-IgG. Результаты исследований, представленные в настоящей статье, совпадают с аналогичными данными других авторов [12-15] и свидетельствуют о высокой специфичности IgM-антител при обследовании больных ЛД, ЛЗН, КЭ и других родственных флавивирусных инфекций, что позволяет с успехом использовать метод ИФА-IgM (MAC-ELISA) для их дифференциальной серологической диагностики. При наличии перекрестных реакций, выявляемых у ряда больных в тест-системах ИФА-IgM-денге, ИФА-^-ЗН и ИФА-IgM-КЭ: адекватный вывод об этиологическом значении этих вирусов может быть сделан на основании сравнения титров антител, выявляемых антигенами гомологичных или гетерологичных вирусов, а также по показателям ОП обследуемых сывороток. Таким образом, применение тест-систем ИФА- IgG, как правило, не обеспечивает дифференцирующего результата. На основании обследования значительного числа сывороток крови больных ЛД, а также других флавивирусных инфекций в ИФА-IgM тест-системах, разработанных в лаборатории биологии и индикации флавивирусов, можно сделать вывод об их специфичности, чувствительности и пригодности для диагностики лихорадки денге.

About the authors

Yu. A Akinshina

ZAO "ECOlab"

Email: akinshina.opr@mail.ru
1, Budennogo Str., Electrogorsk, Moscow Region, Russian Federation, 142530

V. F Larichev

Research Center of Epidemiology and Microbiology Center named after Academician N.F. Gamaleya

Email: arboelisa@mail.ru
D.I. Ivanovsky Institute of Virology 16, Gamalei Str., Moscow, Russian Federation Russian, 123098

S. G Mardanly

ZAO "ECOlab"

Email: ekolab-sekretar@mail.ru
1, Budennogo Str., Electrogorsk, Moscow Region, Russian Federation, 142530

A. M Butenko

Research Center of Epidemiology and Microbiology Center named after Academician N.F. Gamaleya

Email: arboelisa@mail.ru
D.I. Ivanovsky Institute of Virology 16, Gamalei Str., Moscow, Russian Federation Russian, 123098

N. V Khutoretskaya

Research Center of Epidemiology and Microbiology Center named after Academician N.F. Gamaleya

D.I. Ivanovsky Institute of Virology 16, Gamalei Str., Moscow, Russian Federation Russian, 123098

M. A Saifullin

Infectious Clinical Hospital №1

Email: dr_saifullin@mail.ru
63, Volokolamskoye Sh., Moscow, Russian Federation , 123367

References

Supplementary files