Investigation of erythrocyte membrane lipid profile and phospholipids peroxidation process in liver echinococcosis

Full Text

Эхинококкоз печени (ЭП) является одним из наиболее распространенных и тяжелых паразитарных заболеваний, лечение которого остается весьма актуальной проблемой. ЭП вызывает глубокие функциональные изменения в печени, приводящие к местным и общим осложнениям [1, 8]. Вследствие сдавливания эхинококковыми цистами ткани печени происходит ишемия ткани печени, приводящая к нарушению обменных процессов в ней. Многочисленными исследованиями установлено, что ишемия оказывает многогранный эффект на внутриклеточные процессы: способствует развитию дефицита энергии, окислительного стресса, активизирует механизмы повреждения мембранных структур клетки [2]. Одним из главных структурных элементов мембран являются фосфолипиды, учавствующие почти во всех процессах, обусловливающих и поддерживающих нормальный уровень клеточной активности. Процессы гидролиза, ресинтеза и окисления фосфолипидов обеспечивают динамическое равновесие обменных процессов в клеточных мембранах, нарушение которых лежат в основе развития патологических процессов [13]. В настоящее время установлено, что мембрана эритроцитов по своей структуре и функциям идентична мембранам клеток организма в целом и что ей присущи общие принципы молекулярной организации плазматических мембран. Публикации некоторых исследователей позволяют утверждать, Для корреспонденции: Овсепян Лаура Михайловна, канд. биол. наук, зав. лаб. молекулярной микробиологии, e-mail: lhovser@mail.ru что эритроциты не только вовлекаются в патологический процесс при гематологических заболеваниях, но и претерпевают серьезные изменения структуры и функции при болезнях разного генеза [5, 7]. Целью исследования явилось исследование содержания фосфолипидов и процесса перекисного окисления липидов в мембранах эритроцитов больных эхинококкозом. Материалы и методы Исследование проводили на больных эхинококко-зом печени людей, поступивших в стационар. Всем пациентам в период предоперационного обследования с целью уточнения диагноза, размеров, локализации очаговых образований выполнялись КТ и УЗИ брюшной полости. Пробы крови брались за 1 день до операции и после операции на 3, 5, 10-й день. Контролем были доноры. Мембраны эритроцитов выделяли центрифугированием с использованием буфера (смесь бикарбоната натрия, этилендиаминтетраацетата и хлористого натрия) [11]. Экстракцию липидов проводили по методу Фол-ча. Фракционирование индивидуальных фосфолипидов проводили методом одномерной хроматографии в тонком слое силикагеля ("Мерк", Германия) в системе растворителей хлороформ: метанол: аммиак в соотношении (65:35:5). Минерализацию липидного фосфора осуществляли в среде серной и азотной кислот с последующим расчетом количества неорганического фосфора в 1 мкг сухой ткани [4]. Об активности перекисного окисления липидов судили по количеству образования малонового ди 21 ЭПИДЕМИОЛОГИЯ И ИНФЕКЦИОННЫЕ БОЛЕЗНИ, № 4, 2012 альдегида (МДА), который определяли по реакции с тиобарбитуровой кислотой [6]. Количество белка определяли по Лоури [12]. Полученные данные обрабатывали статистически с использованием /-критерия Стьюдента. Результаты и обсуждение Kax показали результаты исследования (см. таблицу) фосфолипидный спектр мембран эритроцитов доноров состоит из 7 фракций — фосфатидилхо-лины (ФХ), фосфадидилэтаноламины (ФЭ), фосфа-тидилсерины (ФС), лизофосфатидилхолины (ЛФХ), фосфоинозитиды (ФИ), сфингомиелины (СФМ), кардиолипины (КЛ). Особого внимания заслуживают обнаруженное нами уменьшение содержания ФХ, при параллельном увеличении количества ЛФХ в мембранах эритроцитов пациентов больных ЭП до операции. ФХ является основным фосфолипидом мембран клеток (содержание его в мембранах различных клеток составляет 25—40% суммы фосфолипидов). Помимо основной структурообразующей функции ФХ служит источником целого ряда липидных мессенджеров и биоактивных соединений, таких как лизо-ФХ, диглицеридов, фактора активации тромбоцитов [10].Уменьшение ФХ в мембранах эритроцитов приводит к нарушению структурной целостности мембраны и связанных с этим функций нормального метаболизма. Исследование ЛФХ позволило обнаружить увеличение его содержания в мембранах эритроцитах людей с ЭП, в особенности до операции и в первые дни после операции. Высокие концентрациии ЛФХ нарушают целостность мембраны воздействуют на активности многих мембранных ферментов и могут даже приводить к лизису клеток. ЛФХ образуется при гидролизе ФХ фосфолипазой А2. Вследствие сдавливания эхинококковыми цистами ткани печени поисходит ишемия ткани печени, приводящая к недостаточности работы дыхательной цепи и уменьшению образования АТФ, что приводит к нарушению активности Ка, К-АТФаз, в результате чего в клетках накапливается ионы Са, которые являются активаторами фосфолипазы А2. Иследование ФС и ФЭ также обнаружило уменьшение их содержания в эритроцитарной мембране. В состав указанных фосфолипидов входят в основном ненасыщенные жирные кислоты, которые легко подвергаются окислению под действием свободных радикалов. Заслуживает внимания увеличение содержания ФИ, которые являются предшественниками вторичных мессенджеров, таких как инозинтрифос-фат-1,4,5 и диглицерид в процессах трансдукции сигнала. Присутствуя в мембране в минорных ко -личествах, они обладают активным метаболизмом, строго контролирущим и реагирущим на внеклеточные воздействия, поэтому дисфункции в контроле их уровня часто ведут к патологиям. Большую роль в индукции апоптоза в митохондриях играют КЛ, содержание которых заметно уменьшается в мембранах эритроцитов при эхино-коккозе, что связано с окислительной модификацией этих липидов. Исследование СФМ позволило обнаружить увеличение их содержания при развитии эхинококкоза. В молекуле СФМ присутствуют в основном остатки насыщенных жирных кислот. Вследствие этого он наряду с холестерином способствует повышению микровязкости липидного бислоя мембраны, его ре-гидности, что сказывается на работе мембранозависимых ферментов. Результаты исследования выявили, что отмеченные изменения в содержании фосфолипидов пациентов с ЭП имеют место до операции и на 3-й день после операции. К 10-му дню обнаруживалась тенденция к нормализации показателей содержания фосфолипидов к показателям доноров. Многочисленными исследованиями установлено, что изменение состава липидов в мембране клеток наряду с метаболическими изменениями чаще всего вызвано процессами свободнорадикального окисления [3, 9]. Исходя из этого, нами проведено исследование по определению содержания свободнорадикальных процессов в мембранах эритроцитов больных эхинококкозом. Образование перекисей липидов регулируется каталитическими системами. Аскорбатзависимая система перекисного окисления использует в качестве восстановителя аскорбиновую кислоту. Другая, НАДФН-зависимая ферментная система является характерной для митохондрий и эн- Содержание фосфолипидов (% от общего количества фосфолипидов) в мембранах эритроцитов больных эхинококкозом печени (n = 10) Показатель Контрольная группа (доноры) Больные ЭП до операции 3-й день после операции 5-й день после операции 10-й день после операции ЛФХ 10,0 ± 0,5 16,7 ± 0,8* 15,3 ± 1,0** 13,3 ± 1,1** 12,2 ± 0,4 СФМ 18,8 ± 1,5 25,8 ± 1,8** 24,1 ± 1,7*** 24,3 ± 1,1*** 22,5± 2,1 ФИ 8,6 ± 1,2 16,6 ±1,5* 15,8 ± 1,8** 14,7 ± 1,3** 10,8 ± 0,7 ФХ 28,3 ± 1,8 18,8 ± 1,6*** 20,1 ± 1,7*** 20,3 ± 1,8*** 22,7 ± 2,0 ФС 14,3 ± 1,4 9,6 ± 1,1** 10,8 ± 1,2 12,2 ± 1.1 13,5 ± 1,3 ФЭ 8,5 ± 0,7 6,0 ± 0,8** 7,7 ± 0,6 7,8 ± 0,8 8,4 ± 0,7 КЛ 11,5 ± 0,5 7,1 ± 0,6* 7,3 ± 0,7 * 7,4 ± 0,8* 9,3 ± 0,8 Примечание: Достоверность отличий по сравнению с контрольной группой: * — р < 0,001, ** — р < 0.01, *** — р < 0,05. 22 доплазматического ретилукума и использует в качестве донора электронов восстановленный НАДФН. Исследование содержания продуктов перекис-ного окисления липидов у больных эхинококкозом показало их увеличение (см. рисунок). Существенно выше были показатели МДА за день до операции, что составило в аскорбатзависимой системе окисления 8,6 нмоль на 1 мг белка, а в НАДФН-зависимой составило 6,3 нмоль на 1 мг белка, что почти в 2,5 раза превышает их содержание в контрольной группе. На 3-й день после операции наблюдался также повышенный уровень МДА, который снизился на 10-й день после операции. МДА является продуктом окислительного распада полиненасыщенных жирных кислот (линолевой, линоленовой, арахидоно-вой) - важнейших компонентов фосфолипидов биологических мембран. При окислении ненасыщенных жирнокислотных цепей фосфолипидов в области сопряженных двойных связей образуются поры, которые нарушают целостность мембраны, следствием чего является нарушение нормального функциони-ривания обменных процессов. При избыточной генерации АФК процесс принимает каскадный характер, что приводит к липидным и белковым нарушениям в структуре клеточных мембран, изменению микровязкости липидного бислоя, конформации мембранных белков, что отражается на функционировании ионных каналов и работе ферментов, приводящих к повреждению гепатоцитов. Таким образом, полученные нами данные показывают, что ЭП сопровождается изменением содержания различных категорий липидов и активированием свободнорадикальных преоцессов в мембранах эритроцитов до операции и на 3-й день после операции. К 10-му дню после операции наблюдается частичная нормализации изученных процессов.

About the authors

L. M Ovsepyan

Email: lhovser@mail.ru

A. V Zanginyan

Email: hzang@mail.ru

G. S Kazaryan

Email: gaykaz70@mail.ru

References

Supplementary files