Экспериментальная модель эхинококкоза печени у лабораторных крыс для изучения эффективности антигельминтных препаратов

Полный текст

ОБОСНОВАНИЕ

Ежегодно в мире регистрируется более 2 миллионов новых случаев заражения эхинококкозом, что составляет от 0,05 до 1,5% в структуре инфекционной патологии, при этом в последние годы отмечается значительный рост заболеваемости этим гельминтозом, распространённость которого в ряде стран составляет от 30 до 95%. Возрастает число случаев с осложнёнными формами, доля которых достигает 35–40% [1, 2] с летальностью 2–5% [3]. В этой связи решением Всемирной организации здравоохранения эхинококкоз включён в список наиболее распространённых гельминтозов человека, требующих первоочередной ликвидации [4–6].

Эпидемическая ситуация по паразитарным заболеваниям в России, в том числе по эхинококкозу, остаётся сложной. Ежегодно в стране регистрируется свыше 500 случаев впервые выявленного этого ларвального гельминтоза. В 2021 году заболеваемость увеличилась на 18,75% по сравнению с 2020 годом и составила 0,19 на 100 тыс. населения [7].

Клиническая диагностика эхинококкоза затруднена по причине его длительного латентного течения, в связи с этим в постановке окончательного диагноза в настоящее время ведущая роль отводится инструментальным (ультразвуковое исследование, компьютерная томография и др.) и серологическим методам, диагностическая значимость которых повышается при их совместном использовании [8, 9].

До настоящего времени основным методом лечения эхинококкозов остаётся хирургический, возможности которого резко ограничены в случаях множественной инвазии или неоперабельности [10]. Первые попытки разработки метода специфической химиотерапии эхинококкозов на основе мебендазола (препарат группы карбаматбензимидазолов) были предприняты еще в 80-х годах прошлого века. В конце 90-х годов широко стал использоваться структурный аналог мебендазола — албендазол. Недостаточная эффективность обоих препаратов перорального применения во многом обусловлена их относительно низкой биодоступностью. Попытки повысить биодоступность этих препаратов путём создания экспериментальных масляных лекарственных форм не дали ожидаемых результатов. Использование празиквантела в качестве тканевого антигельминтного препарата ограничивается особенностями его фармакокинетики, в частности коротким периодом полувыведения, а также существенным спектром побочных реакций при длительном применении [11].

На сегодняшний день у хирургов, инфекционистов и врачей других специальностей отсутствуют единые подходы к лечебной тактике ведения пациентов с эхинококкозом. Внедрение в клиническую практику лекарственной терапии препаратами антигельминтного действия из группы карбаматбензимидазолов снизило потребность в агрессивных хирургических вмешательствах на начальных стадиях развития паразитарных кист. Однако до сих пор нет единого мнения, в каких случаях и при каких размерах кист будет достаточным применение монотерапии карбаматбензимидазолами, а в каких необходима комбинация хирургического и терапевтического методов лечения. По данным ряда авторов, основными причинами неэффективности монотерапии является невозможность проведения полноценного курса лечения албендазолом в связи с выраженным полиморфизмом генов, кодирующих ферменты биотрансформации албендазола, а также с различными побочными действиями препарата. Также известно, что после оперативного вмешательства, не сопровождающегося последующим проведением терапии карбаматбензимидазолами, часто развиваются рецидивы заболевания.

В настоящее время данные клинических исследований и предложенные экспериментальные модели на лабораторных животных не позволяют в полной мере оценить гистологические изменения структуры эхинококковых кист и жизнеспособность паразита на фоне этиотропной терапии в динамике [12]. В этой связи нами была разработана новая, более простая в техническом исполнении модель эхинококкоза печени у экспериментальных животных, позволяющая оценить динамику гистологических изменений на фоне проводимой терапии антигельминтными препаратами.

Цель исследования — на основе разработанной экспериментальной модели эхинококкоза печени у лабораторных животных оценить приближённость разработанной авторами экспериментальной модели эхинококкоза печени к реальной клинической практике, в том числе реакцию на применение карбаматбензимидазолов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Экспериментальная работа на животных была одобрена независимым этическим комитетом при Военно-медицинской академии имени С.М. Кирова (протокол № 258 от 21.12.2021). Содержание и уход за экспериментальными животными осуществлялись в соответствии с требованиями Закона Российской Федерации от 14.05.1993 № 4979-1 «О ветеринарии» и «Рекомендациями комитета по этике проводящим экспертизу в биомедицинских исследованиях».

В исследование включены 30 самцов крыс линии Wistar, массой 250±50 г, у которых был смоделирован эхинококкоз печени согласно разработанной методике. Формирование экспериментального эхинококкоза печени выполнялось следующим образом. В условиях операционной вводился общий анестетик диссоциативного действия Zoletil 100 (тилетамина гидрохлорида и золепама гидрохлорида по 250 мг) в дозе 20 мг/кг массы тела. После наступления анестезии у животного сбривалась шерсть в области брюшка и грудной клетки, после чего осуществлялась фиксация на операционном столе. Операционное поле обрабатывалось антисептическим раствором по Филончикову–Гроссиху. Пальпаторно определялся мечевидный отросток грудины и край правой рёберной дуги. При помощи скальпеля производилась срединная лапаротомия. На капсулу правой доли печени укладывалась часть стенки эхинококкового пузыря, полученного от поражённых эхинококком овец, таким образом, чтобы герминативный слой примыкал к капсуле. Эта часть ларвоцисты размером около 10×10 мм фиксировалась к печени с помощью лигатуры одним швом. Затем рана брюшной полости наглухо зашивалась.

На 60-е сутки эксперимента методом ультразвукового исследования у всех животных было подтверждено формирование кисты печени. После этого крысы путём случайной выборки были разделены на три группы: первая контрольная группа (10 крыс) и две опытные группы по 10 крыс. Животным второй группы в течение 28 дней через зонд интрагастрально вводилась суспензия албендазола в суточной дозе 5 мг, которая разбивалась на два приёма. Для увеличения биодоступности к препарату добавлялось 100 мг жидкого сливочного масла. Животные третьей группы получали празиквантел в виде суспензии, которую готовили из таблетированной формы препарата. Препарат вводился с помощью интрагастрального зонда в суточной дозе 15 мг в два приёма в течение 15 дней. Дизайн исследования представлен на рис. 1.

 

Рис. 1. Дизайн работы.

Fig. 1. Work design.

 

В ходе эксперимента все животные получали стандартный корм для грызунов (Nuvilab CR1s, Бразилия), в состав которого входили 22% белка, 4% жира, 4% сырого волокна, что соответствовало 290 ккал/100 г. Каждое животное получало 12 г корма в течение суток.

По окончании эксперимента животные умерщвлялись, печень извлекалась для дальнейшего исследования. Её фрагменты с паразитарными кистами фиксировались в растворе 10% нейтрального формалина в течение 24 ч. После фиксации они подвергались дегидратации путём инкубации в изопропиловых спиртах, а затем пропитывались парафином по общепринятой методике. Из парафиновых блоков изготавливались срезы ткани толщиной 4 мкм, которые окрашивались гематоксилином-эозином и пикрофуксином по Ван-Гизону, после чего помещались под покровные стёкла. Изучение гистологических препаратов осуществлялось с помощью бинокулярного микроскопа в проходящем свете при суммарном увеличении ×50, ×200 и ×2000.

РЕЗУЛЬТАТЫ

У животных первой группы (n=10, контроль), которым не назначался антигельминтный препарат, при микроскопии гистологических срезов наблюдалась наружная фиброзная оболочка специфического строения с органоподобной структурой, которая содержала кровеносные сосуды, обеспечивающие транспорт питательных веществ к паразитарной кисте. В непосредственной близости от фиброзной оболочки в ткани печени обнаруживалась воспалительная полиморфноклеточная инфильтрация, включающая сегментоядерные нейтрофилы, эозинофилы, макрофаги и фибробласты с единичными лимфоцитами (рис. 2).

 

Рис. 2. Эхинококковая киста с фиброзной и герминативной оболочками: а — эхинококковая киста (увеличение ×50); b — часть кисты с внутренними оболочками (увеличение ×1000): 1 — герминативная оболочка; 2 — кутикулярная оболочка.

Fig. 2. Echinococcal cyst with fibrous and germinal membranes: а — echinococcal cyst (magnification ×50); b — part of the cyst with inner membranes (magnification ×1000): 1 — germinative shell; 2 — сuticle shell.

 

Сравнительная характеристика морфологических изменений в эхинококковых кистах у экспериментальных животных на 28-е сутки приёма албендазола и 15-е сутки приёма празиквантела представлена в табл. 1.

 

Таблица 1. Морфологическая характеристика кист

Table 1. Morphological characteristics of cysts

Морфологическая характеристика кист	28-е сутки приёма албендазола	15-е сутки приёма празиквантела
Герминативная оболочка	Отслойка и фрагментация	Выраженная фрагментация
Кутикулярная оболочка	Деструктивные изменения	Выраженные деструктивные изменения
Фиброзная оболочка	Перифокальная клеточная инфильтрация	Массивная клеточная инфильтрация
Детрит в полости кисты	Скопление детрита	Скопление детрита
Протосколексы	Нет	Нет
Ацефалоцисты	Нет	Нет

 

В эхинококковых кистах печени у экспериментальных животных второй группы (n=10), получавших албендазол, на 88-й день эксперимента (28-е сутки терапии) развились деструктивные изменения в кутикулярной и герминативной оболочках. Гистологическая картина характеризовалась отслойкой и фрагментацией герминативного слоя, а в полости кисты наблюдалось скопление детритических масс, что указывало на процессы, свидетельствующие о гибели паразита. Кроме того, в области фиброзной оболочки и в прилежащих к ней тканях обнаруживалась перифокальная клеточная инфильтрация, представленная лимфоцитами, нейтрофилами, эозинофилами, макрофагами и тучными клетками (рис. 3, a, b).

 

Рис. 3. Деструктивные изменения кутикулярной и герминативной оболочек эхинококковой кисты на фоне терапии албендазолом (a, b) и празиквантелом (c, d): 1 — деструктивные изменения в герминативной оболочке; 2 —деструктивные изменения в кутикулярной оболочке; 3 — массивная лейкоцитарная инфильтрация.

Fig. 3. Destructive changes in the cuticle and germinal membrane of an echinococcal cyst during therapy with albendazole (a, b) and praziquantel (c, d): 1 — destructive changes in the germinal membrane; 2 — destructive changes in the cuticle membrane; 3 — massive leukocyte infiltration.

 

В эхинококковых кистах печени у экспериментальных животных третьей группы (n=10), получавших празиквантел, на 75-й день эксперимента (15-е сутки терапии) также наблюдались деструктивные изменения со стороны кутикулярного и герминативного слоев. Однако эти изменения были выражены в большей степени, чем у крыс, получавших албендазол, что проявлялось более массивной лейкоцитарной инфильтрацией и фрагментацией герминативной оболочки (см. рис. 3, c, d).

Таким образом, при использовании албендазола значимые деструктивные изменения в кутикулярной и герминативной оболочках эхинококковых кист обнаруживались на 28-е сутки терапии. При использовании празиквантела уже на 15-е сутки гистологическая картина характеризовалась более мощной клеточной инфильтрацией всех слоёв кисты. Однако следует отметить, что на фоне приёма празиквантела у экспериментальных животных ярко проявлялись побочные действия препарата, что выражалось снижением двигательной активности и выпадением шерсти.

ОБСУЖДЕНИЕ

В научной литературе встречаются работы по экспериментальному моделированию эхинококковых кист путём введения зародышевых элементов внутрибрюшинно, непосредственно в паренхиму печени или в сосуды, приносящие кровь к органу. Однако их общими недостатками являются многоэтапность и сложность выполнения методик, более длительный срок моделирования эхинококковой кисты и высокая летальность среди экспериментальных животных [12]. Введение зародышевых элементов внутривенно или внутрибрюшинно не обеспечивает гарантированного формирования эхинококковой кисты. Кроме того, введение зародышевых элементов внутривенно или в паренхиму печени в большинстве случаев приводит к обструкции крупных сосудов или инфаркту органа. В хирургии применение 3D-технологий при эхинококкозе печени даёт возможность оценить анатомические особенности поражённого органа и определить локализацию эхинококкового пузыря, что позволяет выбрать наиболее оптимальную тактику хирургического вмешательства [13]. В то же время полимерное 3D-моделирование не позволяет изучить динамику морфологических изменений эхинококковых кист на фоне терапии различными антигельминтными препаратами, так как это возможно осуществить только на живой экспериментальной модели.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Разработанная нами модель эхинококкоза печени лишена всех вышеперечисленных недостатков и характеризуется простотой выполнения. Указанная модель обеспечивает высокую выживаемость лабораторных животных и формирование паразитарных кист, что позволяет использовать её в экспериментальных исследованиях для оценки эффективности различных антигельминтных препаратов с учётом динамики гистологических изменений эхинококковых кист.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Источник финансирования. Авторы заявляют об отсутствии внешнего финансирования при проведении исследования.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Вклад авторов. Все авторы подтверждают соответствие своего авторства международным критериям ICMJE (все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции, проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией). Наибольший вклад распределён следующим образом: Т.В. Гаврилюк — подготовка, разработка и осуществление моделирования эхинококкоза печени у лабораторных животных; А.В. Саулевич, Ю.Ф. Захаркив, В.С. Турицин — участие в разработке и практическая помощь в моделировании эхинококкоза печени у лабораторных животных; С.С. Козлов, К.В. Козлов — редактирование материалов исследования; В.Е. Карев — изготовление гистологических препаратов и их описание.

ADDITIONAL INFORMATION

Funding source. This study was not supported by any external sources of funding.

Competing interests. The authors declare that they have no competing interests.

Authors’ contribution. All authors made a substantial contribution to the conception of the work, acquisition, analysis, interpretation of data for the work, drafting and revising the work, final approval of the version to be published and agree to be accountable for all aspects of the work. T.V. Gavrilyuk — preparation, development and implementation of modeling of liver echinococcosis in laboratory animals; A.V. Saulevich, Yu.F. Zakharkiv, V.S. Turitsin — participation in the development and practical assistance in modeling liver echinococcosis in laboratory animals; S.S. Kozlov, K.V. Kozlov — editing research materials; V.E. Karev — production of histological preparations and their description.

Об авторах

Тимофей Васильевич Гаврилюк

Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова

Автор, ответственный за переписку.
Email: Gtv-25@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-7102-0672
SPIN-код: 9515-3727
Россия, Санкт-Петербург

Андрей Валерьевич Саулевич

Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова

Email: saulevich_andrei@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-6756-3105
SPIN-код: 9356-8410

канд. мед. наук

Россия, Санкт-Петербург

Сергей Сергеевич Козлов

Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова; Санкт-Петербургский государственный медицинский педиатрический университет; Детский научно-клинический центр инфекционных болезней Федерального медико-биологического агентства

Email: infectology@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-0632-7306
SPIN-код: 5519-6057

д-р мед. наук, профессор

Россия, Санкт-Петербург; Санкт-Петербург; Санкт-Петербург

Юрий Федорович Захаркив

Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова

Email: zufbiology@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-3453-7557
SPIN-код: 6541-9803

канд. мед. наук, доцент

Россия, Санкт-Петербург

Константин Вадимович Козлов

Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова

Email: kosttiak@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-4398-7525
SPIN-код: 7927-9076

д-р мед. наук, доцент

Россия, Санкт-Петербург

Владимир Сергеевич Турицин

Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова; Санкт-Петербургский государственный аграрный университет

Email: turicin_spb@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-9066-0026
SPIN-код: 2022-1869

канд. биол. наук, доцент

Россия, Санкт-Петербург; Санкт-Петербург

Вадим Евгеньевич Карев

Детский научно-клинический центр инфекционных болезней Федерального медико-биологического агентства

Email: vadimkarev@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-7972-1286
SPIN-код: 7503-3253

д-р мед. наук

Россия, Санкт-Петербург

Список литературы

Дополнительные файлы